KR20010030878A - 이민 형성 폴리사카라이드, 이의 제조 방법 및 이것의아쥬반트 및 면역자극제로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항원 제시 세포(APC) 상에 존재하는 표면 수용체에 결합하고, 직접 또는 이작용성 링커를 통해 공유 결합된 안정한 카르보닐기 보유의 1종 이상의 화합물에 접합된 폴리사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드 접합체에 관한 것이다. 이 접합체는 면역자극제 및 아쥬반트로서 유용하다.

Description

이민 형성 폴리사카라이드, 이의 제조 방법 및 이것의 아쥬반트 및 면역자극제로서의 용도{IMINE-FORMING POLYSACCHARIDES, PREPARATION THEREOF AND THE USE THEREOF AS ADJUVANTS AND IMMUNOSTIMULANTS}
아쥬반트는 면역계를 활성화시켜 예방 백신 및 치료 백신의 효능을 증가시키는 용도를 갖는다. 면역 아쥬반트는 (1) 감염 질환 및 암에 대해 숙주 저항성을 갖는 비특이적 자극작용과, (2) 예방 백신의 면역원성 상승작용 및 (3) 치료 백신의 면역원성 상승작용으로서의 용도를 가진다. 이 아쥬반트는 세포가 매개하는 면역 반응(T 세포 반응, 지연된 과민성 반응), 체액성 반응(B 세포 반응, 항체 생산), 또는 이 두 반응 모두를 증진시킨다. 체액성 면역의 자극작용은 박테리아 감염질환, 일부 바이러스에 의한 감염 질환을 예방하는 데 뿐 아니라 순환성 암을 치료하는 요법에 중요하고, 한편, 세포성 면역은 고형의 종양 세포 치료요법 및 일부 바이러스에 의한 질환에 매우 중요하다.
면역계가 외래 반응제 또는 항원(예를 들면, 바이러스, 박테리아 또는 기생충)에 의해 처음에 자극되면 다음에 항원에 재노출시 상기 반응제와 반응하여 촉진된 반응을 나타낸다. 이러한 촉진된 반응은 질환을 예방하기 위한 예방접종의 성공률을 상당히 높게 한다. 하지만, 외래 항원에 대한 초기의 면역 반응은 이러한 반응이 완전히 일어나기 까지는 수일을 요하므로, 유독성이 상당히 높은 유기체가 일으키는 감염 질환에 대한 예방에는 부적합하다. 이러한 예방성 면역반응을 좀 더 빠르게 유발하기 위한 방법은 일반적으로 약독화되거나 또는 사멸된 병원체를 예방접종 또는 면역 접종하는 것이다. 하지만, 많은 경우에 사멸된 미생물 또는 순수한 항원으로의 면역 접종은 단기간동안 불충분한 면역 반응을 나타내기 때문에 세포에 의한 매개 면역이 미약하거나 전혀 면역활성이 생성되지 않는다는 문제점이 있다. 대부분의 경우에 이러한 불충분한 면역반응은 아쥬반트를 항원 제제에 첨가하므로써 수정될 수 있다. 몇몇 폴리사카라이드(탄수화물 중합체), 즉 만노오즈(예, 만난),-(1,3) 글루코스(예, 글루칸),-(1,4)아세틸레이트화 만노즈(아세만난),-(1,4)N-아세틸 글루코사민(키틴) 및 헤테로폴리사카라이드[예를 들면, 람노갈락트우로난(펙틴)]은 면역계를 자극시키는 것으로 입증되어왔다. 항원 제시 세포(APC)는 이들 폴리사카라이드와 기타 다른 폴리사카라이드의 당부분을 인식하고 결합하는 특이적인 세표 표면 수용체를 가진다. 수상돌기 세포 및 몇몇 대식세포와 같은 항원 제시 세포(APC)는 항원을 취한 뒤 이들을 엔도리소좀내에서 작은 펩티드로 가공하는 역할을 한다. 가공된 항원은 MHC II와 관련하여 APC의 표면에서 발현된다. 좀 더 구체적으로는, 반응성 T 세포는 항원과 MHC II를 동시에 인식하여 MHC II 제한성인 면역반응을 생성한다. B 세포는 가공된 항원에 의해 자극되어 항체를 생성한다. 이들 APC 표면-수용체(예를 들면, 수상 돌기 세포에서 얻은 대식세포 만노즈 수용체 및 이의 유사 수용체 DEC-205)는 경막 단백질로서 엔도시토시스를 매개하고 특히 항원 제시 과정에 관여한다(Stahl, P.D., Current Opinion in Immunology 4:49(1992); Jiang, W.,등 Nature 375;151(1995)). 이들 폴리사카라이드를 상기 수용체에 결합하면 포식작용, 증식성 반응, 시토킨의 방출, 및 면역계의 기타 다른 작용의 증가로 나타나는 바와 같이, 면역자극작용이 유발된다. 이러한 면역 자극작용때문에 상기 폴리사카라이드는 백신 아쥬반트로 제안된 바 있다.
폴리사카라이드 아쥬반트는 시토킨 생성을 변형, 예를 들면 IL-1을 상승조절하여 적절한 Th1 반응을 일으켜 면역조절 효과를 나타낸다. CD4+T 세포의 Th1 서브세트에 의해 생성되는 면역반응은 보체 고정 항체 뿐 아니라-IFN, IL-2 및 IL-12와 관련된 강력하면서 지연된 타입의 과민성(DTH) 반응을 유발한다. 이러한 천연 단백질 형태에 대한 폴리사카라이드가 미치는 영향은 적절한 수준이므로 중화성 항체 반응을 일으키는 데 필요한 형태성 에피토프를 보존한다. 하지만, 이들 아쥬반트는 내인성 경로를 통해서는 외인성 항원이 가공될 수 없게 하기 때문에 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유발하지 않는다. APC는 특정 탄수화물 부분에 특이적인 세포 표면 수용체를 가지고 있기 때문에 이 당부분과 관련된 항원이 상기 세포를 표적으로 한 후 전달되는 작용이 상당히 증진된다. 항원 전달의 표적화에 있어 당 부분의 역할은 폴리사카라이드 아쥬반트에 한정된 것은 아니다. 예를 들면, 퍼요오드산으로 산화시켜 퀼라자사포닌 탄수화물 측쇄를 변형시키면 이들의 아쥬반트 활성이 상실된다. 이것은 이들의 표적화 역량의 상실로 인한 것으로 추정된다.
특정 폴리사카라이드의 아쥬반트 특성은 한때 알려져 있었지만, 사실 이의 용도는 연구용으로만 크게 제한되어 있었다. 예를 들면, 글루칸은 마우스에서 항종양반응을 유발하므로 급성 패혈증을 예방하는 효과를 가져온다. 이 효과는 글루칸의 분자량 및 이들의 분지화 정도에 따라 달라진다. 만난은 대식 세포 만노즈 세포 표면 수용체에 결합한 후 이러한 효과를 나타내는 것으로 추정되는 아쥬반트 작용을 갖는 기타 폴리사카라이드이다. 최근에, 산화 조건하에서 만난에 단백질 항원을 접합시키면 세포 매개 면역 반응이 생성된다는 것이 관찰된 바 있다(Apostolopoulos, V 등, Vaccine 14;930 (1996)). 하지만, 비산화조건하에서 즉, 알데히드가 형성되지 않으면서 만난에 접합된 단백질 항원은 체액 면역만을 유발할 뿐이다(Okawa, Y등, J. Immonol. Meth. 142:127(1992)) 및 (Apostolopoulos, V 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:10128(1995)). T-세포 면역의 자극작용은 실험조건하에서 갈락토즈 옥시다제를 사용하여 세포-표면 폴리사카라이드의 갈락토실 잔기중에 알데히드를 생성하여 달성된 바 있다(Zeng, B., 등, Science 256:1560(1992)). 그러나, 이 면역 자극은 재현성이 없었다(Rhodes, J. Immonol. Today 17:436(1996)). 이것은 효소 산화에 의한 알데히드의 불충분한 생산 및/또는 알데히드의 불안정성과 관련된 문제점을 부각시키는 것이다.
그러므로, 백신 산업에 있어 새롭고 효용가치가 높은 아쥬반트의 제공은 임상적으로나 경제적으로 상당히 중요한다. 항원 제시 세포를 표적으로 하여 공동 자극의 신호를 보내 T-세포 면역을 자극하는 신규 아쥬반트의 개발이 본 발명의 과제이다.
본 발명은 신규의 폴리사카라이드 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 백신과 면역 자극 조성물에 사용하는 것에 관한 것이다. 아쥬반트란 항원 제시 세포(APC)에 의해 인식되는 폴리사카라이드 유도체를 말한다.
본 발명은 화학적 접합체(이후 폴리사카라이드 접합체로 지칭)에 관한 것으로서, 이 접합체는 (i) APC의 세포 표면에 결합할 수 있는 폴리사카라이드, (ii) 안정한 카르보닐기(즉, 이민 또는 쉬프(Schiff) 염기를 형성하기 위해 아미노기와 반응 할 수있는 알데히드기 또는 케톤기)를 갖는 1 이상의 분자를 포함하는데, 여기서 분자 (ii)는 (iii) 직접 공유 결합을 통하여 폴리사카라이드(i)에 결합되어 있거나 또는 안정한 카르보닐기를 그대로 유지하는 방식으로 이작용성 링커를 통해 폴리사카라이드(i)에 공유적으로 결합되어 있다. 이민 형성 카르보닐기를 갖는 분자는 방향족 시클릭 화합물, 비방향족 시클릭 화합물, 방향족 헤테로시클릭 화합물 또는 비방향족 헤테로시클릭 화합물 또는 비시클릭 화합물일 수 있다. 방향족 또는 이종 방향족 케톤 및 알데히드는 분자(ii)로 사용할 수있다.
본 발명의 제2 양태로서 안정한 카르보닐기(즉, 이민 또는 쉬프 염기를 형성하기 위해 아미노기와 반응할 수있는 알데히드기 또는 케톤기)를 갖는 1 이상의 분자는 비아쥬반트 탄수화물 항원에 직접 공유결합되어 있거나 또는 이작용성 결합 분자를 통하여 비아쥬반트 탄수화물 항원에 결합되어 비아쥬반트 탄수화물 항원에 고유의 아쥬반트성을 부여한다. 안정한 카르보닐기를 갖는 1 이상의 분자를 상기 탄수화물 항원에 접합하면 비접합 탄수화물 항원과 비교해볼때 예방 백신 접종의 효능이 증가된 생성물을 생성한다.
본 발명은 포유동물에서 면역 반응의 상승작용을 증진시키는 것에 관한 것으로서, 이는 본 발명의 폴리사카라이드 접합체의 유효량을 투여하여 1 이상의 항원에 대한 포유동물의 면역반응을 증진시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 하나이상의 항원과 본 발명의 폴리사카라이드 접합체를 투여하는 것을 포함하는 예방접종 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 폴리사카라이드 접합체, 하나 이상의 약학적 허용 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 및 수의학적 조성물을 제공하는 것이다. 이들 조성물은 동물 및 인간에 대하여 면역강화제로서 사용될 수있다.
본 발명은 하나 이상의 항원과 본 발명의 폴리사카라이드 접합체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명은 (i) APC의 표면에 결합할 수있는 폴리사카라이드 및 (ii) 안정한 카르보닐기(즉, "이민 형성 화합물"로 지칭되는 이민 또는 쉬프 염기를 형성하기 위해 아미노기와 반응할 수있는 알데히드 기 또는 케톤기)를 갖는 하나이상의 분자를 포함하는 데, 여기서 폴리사카라이드(i)은 (iii) 직접 공유 결합을 통해 하나 이상의 분자(ii)에 결합되어 있거나 이작용성 링커의 잔기를 통해 공유적으로 하나 이상의 분자(ii)에 결합되어 있다. 이민 형성 카르보닐기를 갖는 화합물은 방향족 시클릭 화합물 또는 비방향족 시클릭 화합물, 방향족 헤테로시클릭 화합물 또는 비방향족 헤테로시클릭 화합물 또는 비시클릭 화합물일 수있다. 방향족 케톤 또는 이종 방향족 케톤 및 알데히드가 (ii)로서 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명을 좀 더 명확히 설명하기 위해서 폴리사카라이드 접합체 또는 이의 허용 염을 다음식(I) 으로 제시할 수있다.
P-(L-I)x
상기식에서 P는 APC의 세포표면에 결합할 수있는 폴리사카라이드가고;
L은 이작용성 결합 분자의 잔기 또는 공유 결합을 각기 나나태며;
I는 이민 형성 분자로서, 바람직하게는 (a) 케톤 또는 알데히드 작용기 및 상기 폴리사카라이드 또는 이작용성 결합 분자(존재하는 경우)상에 있는 보충성 작용기와 반응할 수있는 제2 작용기를 갖는 방향족 또는 이종 방향족 화합물 잔기이고;
x는 1이상으로서, 이 값은 폴리사카라이드상에서 공유적으로 변형되는 반응성 기의 수에 의해 결정될 것이다. 수많은 변형 요인 및 전략이 x의 값에 영향을 미칠 것이므로 이에 대해서는 본명세서에서 자세히 설명한다. 일반적으로 x는 폴리사카라이드상에 존재하는 반응성 히드록실, 말단 단부 헤미아세탈, 카르복실 및/또는 아민기의 수의 함수이다. 유용한 폴리사카라이드(P)의 다양한 분자량 분포때문에, x로 표시되는 변형의 정도는 100 개의 글리코실 잔기에 대하여 유입된 이민 형성 기의 수로 표시된다. 이러한 정의를 사용하면, x의 값은 1 내지 100이상으로 변할 수있으며, 100개의 글리코실 잔기에 대하여 약 50 개의 이민 형성기로 구성되는 것이 바람직하다
이민 형성 분자의 비는 사용되는 접합 전략에 따라 광범위하게 변한다. 이러한 비의 조절에 대해서는 이하에서 설명한다.
폴리사카라이드의 유리 히드록실기, 말단 단부 헤미아세탈기, 카르복실산 또는 아민기를 사용하여 폴리사카라이드(P)를 (L) 또는 (I)에 공유적으로 결합시킨다. 폴리사카라이드상에 존재하는 이러한 하나 이상의 반응성기는 처음으로 "활성화"(이후 자세하 후술함) 되어 이들 기의 반응성을 증가시키거나 또는 폴리사카라이드를 "활성화된" 작용기를 갖는 이민 형성 화합물과 반응할 수있다.
본 발명의 다른 범주는 카르보닐기를 갖는 하나 이상의 화합물을 포함하는 접합체와 관련이 있는 것으로서, 여기서 이 화합물은 공유적으로 비아쥬반트성 항원에 직접 결합되거나 또는 이작용성 결합 분자의 잔기를 통하여 비아쥬반트성 탄수화물 항원에 결합하여 고유 아쥬반트 활성을 비 아쥬반트 탄수화물 항원에 제공한다. 상기 탄수화물 항원에 이민 형성 분자를 접합시키는 것은 탄수화물 항원 단독을 사용하는 것과 비교해볼때 예방 백신화의 효능을 증가시키는 생성물을 산출한다. 탄수화물 항원은 백신 항원으로 사용되는 스트렙토콕시, 스타필로콕시, 및 기타 다른 박테리아를 비롯한 지폴리사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드가다.
폴리사카라이드
본 발명의 접합체를 생성하기 위해 사용가능한 폴리사카라이드는 APC 상의 세포표면 수용체에 결합하는 천연 또는 화학적으로 변형된 임의의 폴리사카라이드를 포함한다. 본 발명의 목적에 적합한 폴리사카라이드는 최소 2개의 당류, 바람직하게는 분지쇄 또는 직쇄로 존재하는 7개 이상의 당류를 가지며, 약 1000 내지 수백만 달톤의 분자량을 지닌다. 바람직한 폴리사카라이드는 약1000 내지 약 500,000의 분자량을 갖는다. 이러한 폴리사카라이드는 본명세서에 기재된 바와 같이 화학적 변형물을 포함할 수있다.
"항원 제시 세포" 또는 "APC"라 함은 항원을 취하여 이들은 조그만 펩티드로 분해한 후 MHC II와 관련되어 이들을 표면상에 T 세포 및 B 세포로 발현하 는 수지상 돌기 세포 및 대식세포를 의미한다.
과정이 진행되어 가는 동안에, 대식세포 및 수지상 돌기 세포는 다른 미생물로부터 탄수화물 부분을 인식하는 세포 표면 수용체를 생성하였다. 이들 수용체는포식작용 및 흡수작용에서 중요한 역할을 하는 데, 이들은 두가지 항원 생성과 관련된 두개의 중요한 공정이들이다. 이들 세포 표면 수용체에 의해 인식되는 폴리사카라이드는 APC 표적화에 있어서 효과적인 메카니즘을 제공하기 때문에 이들 아쥬반트를 제조하는 데 적합하다. 일부 경우에서, 박테리아, 균류 및 동물 기원의 탄수화물 서열은 식물 폴리사카라이드를 가지고 있다. 그러므로, 식물 폴리사카라이드는 몇몇 경우에서 실질적인 출발 물질의 공급원이다. 이러한 아쥬반트는 가용성 도는 불용성 폴리사카라이드에 의해 제조될 수있지만, 가용성 형태가 바람직하다.
전술한 본 발명의 개시 내용은 식물 폴리사카라이드에만 적용되는 것이 아니라, APC 표면 수용체에 의해 인식되는 기타 다른 공급원에서 얻은 기타 탄수화물 함유 화합물까지로 확대될 수있다. 이들 기타 다른 폴리사카라이드는 동물 및 박테리아 기원의 키틴 및 덱스트란이다. 화합물을 함유하는 적합한 탄수화물의 예로는 박테리아성 테콘산 및 이들의 유도체, 박테리아성 지폴리사카라이드, 지질 A 및 이들의 유도체이다.
마지막으로, 이민 형성 카르보닐기를 운반하는 화합물을 비아쥬반트 탄수화물 함유 생성물에 접합하면 고유 아쥬반트가 이들 생성물에 제공되어 예방 면역의 효능을 증진시킨다. 이러한 생성물의 예로는 백신 항원으로 사용되는 스트렙토콕시, 스타필로콕시, 및 기타 박테리아에서 얻은 폴리사카라이드가다.
본 발명에 유용하게 사용되는 바람직한 폴리사카라이드로는-글루칸, 만난, 펙틴, 및 2-아세트아미도 글루칸이다. 이들 폴리사카라이드중에서 수용성 유도체를 비롯한 유도체가 또한 효과적으로 사용된다. 이에 대해서는 가명세서 출원 제60/083,106호를 참조하라. 바람직한 폴리사카라이드는 하기에 자세히 후술한다.
-글루칸:-글루칸은 (1→6) 결합에 의해 연결된-D-글루코피라노실 유니트를 지닌 (1→3) 결합된-D-글로코피라노실 주쇄 유니트를 가진다. 이들은 효모, 균류, 조류, 시리얼 과 같은 수개의 공급원에서 발견될 수있으며, 또한 이들의 면역 조절 특성에 영향을 주는 5,000 내지 〉500,000의 광범위한 분자량을 갖는다. 일반적으로, 고분자량의-글루칸은 상대적으로 불수용성으로서 보다 높은 생물학적 활성을 갖는다. 하지만, 용해성이 부족하기 때문에 글루칸은 전신성 투여가 불가능하다. 인산염, 황산염, 카르복실등과 같은 음이온성 기를 도입하면 이들 폴리사카라이드가 변형되어 생물학적 활성이 확실히 보유되는 가용성 형태를 생성한다. 가용성 글루칸은 하기의 절차중 하나에 따라 제조될 수있다; i) 효모 추출물로부터 분리(Hahn ＆ Albersheim, 1978, Plant Physiol, 66:107), ii) 글루칸 입자의 초음파(Januz 등, 1986, J. Immunol. 137:327) 및 iii) 설포닐화, 인산화, 카르복시메틸화 또는 설페이숀화에 의해 음이온성기를 가용성 글루칸에 유입한다(Bohn ＆ BrMiller, 1995, Carbohydr. Polym. 28:3), (DiLuzo, 미국특허 제4,739,046,4/1988).-글루칸에서 환원되는 글루코실 잔기는(3 위치에서 결합함) (13)-결합된-D-글루코실 잔기의 주쇄 사슬 말단에 위치하고 있다. 주쇄에 (16) 결합에 의해 부착된 글루코실 잔기는 유리 환원성기를 지니지 않는다. 단핵구 글루칸 수용체에 결합하는 가장 적은 단편은 (13)-결합된-글루카노헵타사카라이드이다. 하지만, 이 폴리사카라이드는 면역 자극 활성을 가지지 않는다.
만난: 만난은 만노즈로만 배타적으로 형성된 직쇄 또는 폴리사카라이드가다. 만난은 식물, 곰팡이, 박테리아 및 다른 유기체에서 발견된다. 특정 식물의 경우, 선형 만난은-(14) 결합 만노실 잔기로 구성되는 반면, 어떤 경우에서, 만노실 잔기는-(12) 및-(16) 결합에 의해 결합된다. 사카로마이세스 세로비제(베이커의 효모)로 부터 얻은 분지쇄의 만난에 있어서, 만난은-(16) 결합된 만노피라노실 주쇄 구조가 O-2원자에서-D-만노피라노실,-D-만노피라노실--(12)--D-만노즈피라노실 및-D-만노피라노실--(13)--D-만노즈피라노실--(12)--D-만노즈피라노실의 측쇄로 치환되어 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비제 만난은 포스포릴화될 수있다(Barreto-Bergter 및 P.A. Gorin, Adv, Carbohydr, Chem. Biochem. 41:67(1983), Vinogradov, E., 등, Carbohydr, Res, 307:177(1998)). 세포가 매개하는 면역원을 자극하는 사카로마이세스 세레비제의 역량은 의문이 있지만, 이는 T-세포 반응을 자극하는 데 있어서 지폴리사카라이드의 작용을 증진시킨다(Ohta, M등 면역학 60;503(1987)). 만난은 대식세포 만노즈 결합 세포 표면 수용체에 결합하므로써 이들의 면역자극 효과를 배출할 수있는 것으로 판단된다.-만난의 유도체인 아세틸화-(14) 폴리만노즈의 유도체는 만난와 유사한 방식으로 면역계를 자극하는 것으로 생각된다.
펙틴 폴리사카라이드: 몇개의 펙틴 폴리사카라이드는 항보체성이지만, 이들은 면역 상승작용 역량 정도가 서로 다를 수있다(Yamada, H등, Planta Medica 56:182(1990)). 주기적으로 산을 사용하여 이들 폴리사카라이드를 산화시키면 통상적인 경로상에서는 작용의 손실이 있지만 대안적인 경로상에서는 증가된 활성을 나타낸다(Yamada, H ＆ Kiyohara, H., Abstracts of Chinese Medicine 3(1): 104(1989)).
약간의 면역강화 활성을 나타내어 세포 표면 수용체에 의해 인식되는 폴리사카라이드는 크게 호모갈락트우로난, 람노갈락트우로난, 아라반, 갈락탄 및 아라비노갈락탄으로 분류할 수 있다. 하지만, 이 화합물들이 모두 생물학적 활성을 가지고 있는 것은 아니다. 대부분, 그 활성은 구조, 분자량, 응집 상태 및 기타 다른 변수에 따라 달라진다. 일반적으로, 펙틴 폴리사카라이드는 1,4-결합 α-D-갈락토실우론산 잔기와 결합된 일군의 당 중합체이다. 이 폴리사카라이드는 주쇄의 갈락토실우론산 잔기에 결합된 분지형 올리고사카라이드를 여러개 가질 수 있다. 사포닌과 기타 폴리사카라이드에 대한 종래 연구로부터 분지형 올리고사카라이드는 아쥬반트성과 관련이 있는 것으로 보이고 있다.
2-아세트아미도 글루칸: 키틴, 뮤레인 및 이들의 유도체
키틴은 β-(1→4) 결합에 의해 결합되어 있고 NAG 잔기 중 약 16%가 탈아세틸화되어 있는 선형 N-아세틸-D-글루코사민(NAG) 중합체이다. 이것은 자연에 널리 분포되어 있는데, 예컨대 절지 동물의 외골격과 진균류의 세포벽에서 발견되었다. 이 폴리사카라이드는 분자내 수소 결합을 충분히 형성시키는 사슬을 갖고 있어 물과 여러 유기 용매에 불용성이다. 강알칼리 처리로 키틴의 N-아세틸기를 제거하면 키토산인 β-(1→4)폴리-D-글루코사민 수용성 다양이온이 생성된다. N-아세틸기의 70%가 제거된 키토산(탈아세틸화된 키틴)은 유의적인 면역자극 활성을 나타낸다[Azuma, I., Vaccine 10:1000(1992)]. 불용성에 의한 제한점을 피하기 위하여, 수용성이 큰 여러 가지 키틴 유도체가 개발되었는데, 그 예로는 글리콜 키틴[Senzyu, K., et al., J Japan. Agri. Chem. Soc., 23:432(1950)] 및 면역 자극성을 보유하기도 하는 카르복실메틸 키틴이 있다. 헵타머 또는 보다 큰 NAG 올리고사카라이드로 구성된 수용성이며 알코올 불용성인 키토덱스트린은 제한된 산 가수분해로 제조하였다[Berger, L.R., et al., Biochem. Biophys. Acta 29:522(1958)]. 박테리아 세포벽의 주 성분인 뮤레인은 β-(1→4) 결합된 NAG로 이루어지고, NAG 단위 중 1개가 에테르 결합을 통해 C-3 위치가 O-락트산기로 치환되어 N-아세틸-D-뮤람산(NAM)을 생성하여 반복 서열 NAG-NAM을 형성하는 폴리사카라이드이다. 락트산 잔기 때문에 분리된 뮤레인은 수용성이다. 박테리아 세포벽에 있는 뮤레인은 특정 펩티드에 부착하여 가교성 펩티도글리칸을 형성한다. 이 뮤레인은 키틴과 구조적 유사성이 있기 때문에 리소자임 효소 및 특히 대식세포의 세포 표면 상에 존재하는 수용체에 의해 인식된다. 또한, 글리콜 키틴에도 존재하는 이러한 구조적 유사성은 키틴 및 이것의 일부 유도체의 면역자극성을 시사한다.
안정한 카르보닐기가 있는 분자(이민 형성 분자)
본 발명의 접합체를 구성하는 제2 인자는 아미노기와 반응하여 이민이나 쉬프 염기를 형성할 수 있는 안정한 카르보닐기(즉, 알데히드기 또는 케톤기) 보유의 1 또는 그 이상의 분자이다. 이민 형성 카르보닐기가 있는 분자는 방향족 또는 비방향족(포화 또는 부분 불포화) 카르보사이클, 방향족 또는 비방향족(포화 또는 부분 불포화) 헤테로사이클 또는 1 이상의 불포화 결합을 보유할 수 있는 비시클릭의 지방족 화합물일 수 있다.
카르보닐기를 가진 특정 방향족 화합물이 특정 Th-세포 표면 수용체 상의 아미노기와 반응시 이민이나 쉬프 염기를 형성하는데 매우 효과적이라는 것이 입증된 바 있다. 방향족 화합물에 부착된 카르보닐기는 보다 안정하기 때문에(이에 반해 지방족 알데히드는 일반적으로 불안정함), 그 유도체는 일반적으로 보존 기간이 보다 길다. 또한, 카르보닐기를 보유하는 시클릭 화합물의 소수성은 세포 표면 수용체와 폴리사카라이드 접합체 간의 상호작용을 강화시킨다. 결과적으로, 폴리사카라이드를 변형시키는데 사용될 수 있는 화합물로는 아릴 또는 헤테로아릴의 알데히드 또는 케톤이 바람직하다. 이 화합물들이 T 세포 상의 아미노기에 보다 용이하게 접근할 수 있도록 이 화합물은 약간의 친화성 특성을 갖고 있는 것이 보다 바람직하다.
전술한 모든 성질을 일부분 정도라도 갖고 있는 화합물이 폴리사카라이드를 변형시키는데 바람직한 제제이다. 바람직한 화합물로는 페닐이나 나프틸과 같은 아릴기를 포함하는 화합물인 일치환 및 이치환된 C6-10아릴알데히드 및 C6-10아릴(C1-4)알킬알데히드를 포함하고, 포르밀 및 포르밀(C1-4)알킬 치환체를 포함한다. 이 화합물은 1개 또는 2개의 추가 치환체, 예컨대 할로, 히드록실, C1-4알킬, C1-4히드록시알킬, C1-4알콕시, 트리플루오로메틸 또는 벤질옥시를 포함한다. 적합한 예로는 1개 또는 2개의 히드록실 및 할로로 치환된 벤즈알데히드 및 나프트알데히드를 포함한다. 예컨대, 2,3-, 2,4-, 2,5- 및 3,4-의 디히드록시벤즈알데히드, 5-클로로-2-히드록시벤즈알데히드, 바닐린, 에틸 바닐린, 나린제닌, 3- 및 4-의 히드록시벤즈알데히드 및 4-히드록시페닐아세트알데히드를 포함한다. 제2의 바람직한 군은 2-, 3- 및 4-히드록시아세토페논과 같은 히드록실 치환된 CC1-4알킬(CC6-10)아릴 케톤 및 6-히드록시-1,2-나프토퀴논과 같은 히드록실 치환된 아릴 케톤이다. 바람직한 제3군으로는 헤테로아릴 알데히드 및 헤테로아릴 케톤을 포함한다. 유용한 헤테로아릴 기로는 각각 케토, 포르밀 또는 포르밀(C1-4) 알킬 치환체를 보유하고, 바람직하게는 또 다른 할로 또는 히드록실 치환체를 포함(이용가능한 시클릭 탄소 원자가 수반되는 경우)하는, 티오펜, 푸란, 벤조티오펜, 벤조푸란, 피리딘, 퀴놀린, 피리다진, 피리미딘, 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 이속사졸 및 옥사졸이 있다. 바람직하게는, 푸라닐, 피리딜 및 인돌릴 알데히드 및 케톤이 유용한 헤테로아릴 코어이다. 유용한 헤테로아릴 알데히드 및 케톤으로는 피리독살, 2-티오펜카르복스알데히드 및 3-티오펜카르복스알데히드를 포함한다.
이민 형성 카르보닐기를 포함하는 시클릭 화합물의 또 다른 비교적 안정한 기는 케토, 포르밀 또는 포르밀알킬 치환기를 보유하는 트리테르페노이드 및 스테로이드이다. 그 예로는 안드로스테론, 포르밀디에놀론, 프로제스테론, 프레드니솔론 및 기타 다른 유도체를 포함한다.
이작용성 링커
이작용성 링커는 각종 용도에 대해 당해 기술 분야에 공지되어 있다(Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996). 적합한 폴리사카라이드와 적합한 이민 형성 화합물 간에 결합을 형성시키는데에는 다양한 이작용성 링커가 사용될 수 있다. "이작용성 링커의 잔기"란 이작용성 링커의 말단 단부가 안정한 카르보닐 화합물 및 폴리사카라이드와 공유결합하여 그 카르보닐 화합물을 폴리사카라이드에 결합시키는 구조체를 의미한다.
안정한 카르보닐 함유 화합물을 폴리사카라이드에 결합시키는데 사용할 수 있는 링커 기의 예로는 알킬렌 디아민, NH2-(CH2)n-NH2(n은 2 내지 12); 아미노알코올, HO-(CH2)r-NH2(r은 2 내지 12); 아미노티올, HS-(CH2)r-NH2(r은 2 내지 12); 경우에 따라 카르복시 보호되는 아미노산; 에틸렌 및 폴리에틸렌 글리콜, H-(O-CH2-CH2)n-OH(n은 1 내지 4)을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 적합한 이작용성 디아민 화합물로는 에틸렌디아민, 1,3-프로판디아민, 1,4-부탄디아민, 스퍼미딘, 2,4-디아미노부티르산, 리신, 3,3'-디아미노디프로필아민, 디아미노프로피온산, N-(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, 2-(4-아미노페닐)에틸아민 및 유사 화합물을 포함한다.
폴리사카라이드의 카르복실기가 접합 기로서 사용되는 경우, 이작용성 링커 분자로서 1 이상의 아미노산이 사용될 수 있다. 즉, β-알라닌이나 γ-아미노부티르산과 같은 아미노산이나, 디알라닌 또는 트리알라닌과 같은 올리고펩티드가 적합한 결합 분자로서 사용될 수 있다.
바람직한 이작용성 결합기로는 다음과 같은 것이 있다.
-NH-(CH2)r-NH-(r은 2 내지 5)
-O-(CH2)r-NH-(r은 2 내지 5)
-NH-CH2-C(O)-
-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-
-NH-NH-C(O)-CH2-
-NH-C(CH3)2-C(O)-
-S-(CH2)r-C(O)-(r은 1 내지 5)
-S-(CH2)r-NH-(r은 2 내지 5)
-S-(CH2)r-O-(r은 1 내지 5)
-S-(CH2)-CH(NH2)-C(O)-
-S-(CH2)-CH(COOH)-NH-
-O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(CO2H)-NH-
-O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(NH2)-C(O)-
-O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH2-CH2-NH-
-S-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH- 및
-NH-O-C(O)-CH2-CH2-O-P(O2H).
폴리사카라이드, 이민 형성 화합물, 링커의 바람직한 조합과 각각의 비는 다음과 같을 것을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다.
폴리사카라이드(P) 이민형성 화합물(I) 링커(L) L/P* I/P*
글루칸 4-히드록시벤즈알데히드 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
글루칸 4,6-디옥소헵탄산 -C(O)-NH-(CH2)m-NH- 5-30 5-20
글루칸 피리독살 5-포스페이트 -NH-O-C(O)-(CH2)-C-O- 5-30 5-20
글루칸 2,4-디히드록시벤즈알데히드 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
글루칸 피리독살 5-포스페이트 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
글루칸 2-티오펜카르복스알데히드 -C(O)-NH-(CH2)m-NH- 5-30 5-20
글루칸 3-티오펜카르복스알데히드 -NH-O-C(O)-(CH2)-C-O- 5-30 5-20
만난 4-히드로시벤즈알데히드 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
만난 4,6-디옥소헵탄산 -C(O)-NH-(CH2)m-NH- 5-30 5-20
만난 피리독살 5-포스페이트 -NH-O-C(O)-(CH2)-C-O- 5-30 5-20
만난 2,4-디히드록실벤즈알데히드 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
만난 피리독살 5-포스페이트 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
만난 2-티오펜카르복스알데히드 -C(O)-NH-(CH2)m-NH- 5-30 5-20
만난 3-티오펜카르복스알데히드 -NH-O-C(O)-(CH2)-C-O- 5-30 5-20
펙틴 폴리사카라이드 4-히드록시벤즈알데히드 -NH-(CH2)n-NH-(O)-
펙틴 폴리사카라이드 피리독살 5-포스페이트 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
펙틴 폴리사카라이드 2-티오펜카르복스알데히드 -C(O)-NH-(CH2)n-NH- 5-30 5-20
펙틴 폴리사카라이드 3-티오펜카르복스알데히드 -NH-O-C(O)-(CH2)-C-O- 5-30 5-20
뮤레인 4-히드록시벤즈알데히드 -CH2-CHOH-(CH2)-O-(CH2)n-O-CH2-CHOH-CH2- 5-30 5-20
뮤레인 4,6-디옥소헵탄산 -C(O)-(CH2)n-NH- 5-30 5-20
뮤레인 2,4-디히드록시벤즈알데히드 -CH2-CHOH-CH2- 5-30 5-20
뮤레인 피리독살 5-포스페이트 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
뮤레인 2-티오펜카르복스알데히드 -C(O)-NH-(CH2)n-NH- 5-30 5-20
뮤레인 3-티오펜카르복스알데히드 -NH-O-C(O)-(CH2)-C(O)- 5-30 5-20
글리콜 키틴 피리독살 5-포스페이트 -O-C(O)-(CH2)n-C-O- 5-30 5-20
글리콜 키틴 피리독살 5-포스페이트 -NH-(CH2)n-NH-C(O)- 5-30 5-20
글리콜 키틴 2-티오펜카르복스알데히드 -C(O)-NH-(CH2)n-NH- 5-30 5-20
글리콜 키틴 3-티오펜카르복스알데히드 -NH-O-C(O)-(CH2)-C-(O)- 5-30 5-20
(*) I/P 및 L/P비는 탄수화물 잔기 100개 당 병입되는 I 또는 L 분자, n = 1 내지 8
이민 형성 폴리사카라이드 아쥬반트의 제조
또한, 본 발명은 상기 폴리사카라이드 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 아쥬반트 폴리사카라이드 및 사포닌의 구조/기능 연구는 탄수화물 사슬 구조의 보존이 아쥬반트성에 중요하다는 것을 밝히고 잇다. 명백한 것은, APC 표면 수용체에 의한 탄수화물부의 인식이 면역자극 효과의 발휘 뿐만 아니라 세포의 표적화에 중요하다는 것이다. 또한, 트리테르펜 사포닌의 아쥬반트 활성은 트리테르페노이드 부에 알데히드기를 필요로 한다. 또한, 최근에는 이민이나 쉬프 염기를 형성할 수 있는 작은 유기 분자가 T 세포에 동시자극 시그널을 제공하여 APC 상에 존재하는 B7-1 수용체에 의한 자극의 필요성을 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌다[Rhodes, J., et al., Nature 377:71(1995)]. APC에 의해 인식되어 결합되는 특정 폴리사카라이드(ii)에, 이민 형성 카르보닐기를 가진 시클릭 화합물이나 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 화합물(i)을 첨가하면 우수한 아쥬반트성이 있는 생성물이 형성될 것이다. 이와 같은 아쥬반트 분자는 면역조절성 및 표적성을 보유한다.
A. 말단 환원성 글리코실 잔기에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
β-글루칸 및 β-만난의 말단 환원성 글리코실 잔기에 이민 형성 화합물을 공유 결합시키는 방법은 하기 반응식 1을 참조로 하여 기재한다.
반응식 1
말단 단부 헤미아세탈을 통한 β-글루칸에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
β-글루칸 및 β-만난은 글루코실 또는 만노실 잔기로 구성되기 때문에, 화학 변형에 이용가능한 작용기는 주로 반응성이 제한적인 히드록실기(-OH)이다. 또한, 중합체 사슬 당 말단 환원성 글루코실 잔기는 1개이고, 일반적으로 글리코실 잔기의 1차 히드록실기는 2차 히드록실기보다 반응성이 크다. 하지만, 특정 폴리사카라이드의 구조는 히드록실기의 반응성에 특정 제한(입체 또는 전자)을 부과할 수 있다. 이와 같은 가능성은 제한 반응 조건하에서 특정 주 생성물 생성에 유리할 수 있는 히드록실기의 체계를 만든다.
글루칸 및 만난 중에 존재하는 제한된 수의 말단 환원 당은 신규 화학기가 도입되는 고도 특이성 부위를 제공한다. 이러한 특이성으로 인하여 본 발명의 변형된 폴리사카라이드 아쥬반트의 상업적 생산에 바람직한 군은 말단 단부 글리코실 헤미아세탈이다.
본 명세서에 기재된 화학적 변형은 여러 유기체 유래의 가용성 또는 불용성 글루칸으로 실시할 수 있다. 하지만, 이것도 하나의 예일 뿐이며, 합성 방법도 이용가능하다. 이러하 신규 아쥬반트 중에 제공되는 탄수화물 부의 역할은 APC 표적화이기 때문에, 유용한 분자량 범위는 약 천 내지 수백만으로 매우 광범위할 수 있다. 본 발명에 사용되는 가용성 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드는 분자량 범위가 약 1000 내지 수만인 것이 바람직하다.
올리고사카라이드의 환원성 말단은 이작용성 디아민 화합물과 같이 아미노기를 보유한 분자가 직접 공유 결합할 수 있는 선택적이고 편리한 부위를 제공한다. 이러한 환원적 아민화 절차는 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)의 존재하에 올리고사카라이드(또는 폴리사카라이드) 중의 말단 환원성 글리코실 잔기를 1 이상의 1차 아미노기 보유 화합물과 반응시키는 것을 포함한다. 이 시아노보로하이드라이드 음이온은 알데히드 또는 케톤에 의해 형성된 쉬프 염기 또는 이민 및 아민을 선택적으로 환원시킨다. 이 때 말단 글루코실 헤미아세탈 중 소량만이 포르밀 또는 개방 형태로 존재하기 때문에 반응은 매우 느린 속도로 진행할 것이다. 분자내 이민 형성 카르보닐과 1차 아민이 모두 존재하는 경우에는 주로 바람직하지 않은 생성물을 생성시키기 때문에 첨가 반응은 다음과 같이 2단계 절차로 실시한다.
단계 1
글루칸/만난 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드(1)는 적당한 용매, 예컨대 수성 아세토니트릴, 디메틸포름아미드(DMF), 피리딘 또는 3차 아민 완충액(pH 9.0) 함유 수성 완충액에 현탁시키고, 적합한 디아민 화합물(2)(n은 약 2 내지 약 12이고, 바람직하게는 2 내지 4임)은 pH를 9.0으로 조정한 상기와 동일한 용매에 첨가한다. [적합한 이작용성 디아민 화합물은 에틸렌디아민, 1,4-부탄디아민, 스퍼미딘, 2,4-디아미노부티르산, 리신, 3,3'-디아미노디프로필아민, 디아미노프로피온산, N-(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, 2-(4-아미노페닐)에틸아민 및 이의 유사 화합물이다.] 첨가되는 디아민 화합물은 탄수화물 중에 존재하는 자유 알데히드기(즉, 탄수화물 중합체 사슬 당 1개의 자유 알데히드)의 몰 당량과 비교했을 때 약 5 내지 10배 과량이어야 한다. 50% 아세토니트릴 중에 용해된 나트륨 시아노보로하이드라이드를 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 수일 동안 서행 교반하면서 25 ℃하에 반응을 진행시켰다. 폴리사카라이드 중에 병입된 아민 화합물의 양은 글루칸 제조물 뿐만 아니라 반응 조건에 따라서도 달라진다. 따라서, 병입된 디아민 화합물의 양은 매일 측정하여 필요량의 디아민이 병입되는데 소요되는 반응 시간을 결정한다. 폴리사카라이드 사슬 당 디아민 스페이서 1몰을 포함하는 변형된 아민화된 글루칸/만난(3)은 6 부피량의 에탄올, 또는 다른 적합한 용매로 4 ℃에서 8 시간 동안 침전시켜 회수한다. 침전물은 물에 재용해하고 여과한 뒤 에탄올 5 부피량으로 4 ℃에서 24 시간 동안 재침전시킨다. 이 침전물을 물에 용해하고 동결건조시킨다.
단계 2
이민 형성 카르보닐기(4) 및 1종 이상의 히드록실기를 보유한 방향족 시클릭 또는 헤테로시클릭 화합물, 예컨대 4-히드록시벤즈알데히드, 2,4-디히드록시벤즈알데히드, 바닐린, 에틸 바닐린, 나린제닌 및 기타 유사 화합물은 아민화된 폴리사카라이드에 첨가하기에 바람직하다. 하지만, 스테로이드 및 트리테르페노이드 유도체와 같이 카르보닐 기를 보유하는 기타 화합물도 사용할 수 있다. 디옥산 또는 아세톤 10 ㎖ 중에 용해시킨 10 mmol의 4-히드록시벤즈알데히드(1.2 g), 바닐린(1.5 g) 또는 5-클로로-2-히드록시벤즈알데히드(1.6 g) 중 소량을 무수 디옥산 또는 아세톤 10 ㎖ 중에 용해시킨 10 mmol(1.6 g)의 1,1'-카르보닐디이미다졸(카르보디이미다졸 또는 CDI) 또는 N,N'-카르보닐디이미다졸에 첨가한다. 이 혼합물을, 대기 수분의 차단하에 혼합하면서 실온에서 6 내지 8 시간 동안 반응시킨다. 반응 생성물은 방향족 알데히드 유도체 유래의 히드록실과 이미다졸에 의해 형성되는 고도 반응성 중간체 이미다졸 카르바메이트(5)이다.
단계 3
이 반응 혼합물은 중간체 이미다졸 카르바메이트를 미리 분리함이 없이 아민화된 폴리사카라이드에 첨가할 수 있다. 카르바메이트는 변형된 폴리사카라이드 아미노기와 결합하여 안정한 카르바메이트 결합을 형성한다(이미다졸 카르바메이트 유도체는 크로마토그래피, 차등 추출 또는 기타 다른 절차에 의해 분리할 수 있다). 폴리사카라이드 히드록실기와 이미다졸 카르바메이트 중간체와의 반응을 최소화하기 위해서, 커플링 반응은 동등몰량의 아미노기와 이미다졸 카르바메이트기의 존재하에 실시해야 한다. 아민화된 폴리사카라이드 중에 존재하는 아미노기의 양은 트리니트로벤젠설폰산(TNBS)으로 측정하거나 또는 원소 분석을 통해 측정되는 C, N, H 및 O 함량으로부터 추정한다. 아민화된 글루칸 또는 만난은 적합한 무수 유기 용매, 예컨대 DMF, 디옥산 또는 피리딘 중에 현탁하고, pH는 트리에틸아민을 사용하여 약 9.5 내지 10으로 조정한다. 폴리사카라이드 제조물의 아미노기와 등가량을 함유하는 카르바메이트 중간체 일정량을 첨가하고, 수분 차단된 실온에서 12 내지 18 시간 동안 반응을 진행시킨다. 이 반응물에 저온 에탄올 약 6 내지 8 부피량을 첨가하여 폴리사카라이드-방향족 알데히드 접합체(6)를 침전시키고, 이것을 여과 수거한다. 접합된 폴리사카라이드는 물에 재용해하고 다시 6 내지 8 부피량의 에탄올이나 기타 다른 적합한 용매로 재침전시킨다. 커플링의 효능은 다음과 같은 방법, 즉 i) 제조물 중의 잔류 아미노기를 TNBS로 측정하는 방법, ii) 제조물 중에 존재하는 방향족 화합물의 양을 분광학적으로 측정하는 방법 또는 iii) 알데히드기를 쉬프 시약으로 직접 측정하거나 N-메틸 벤조티아졸론 히드라존(MBTH)을 이용하여 분광학적으로 직접 측정하는 방법[Pza, M.A., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 109:548(1965)] 중 하나를 사용하여 측정한다. 폴리사카라이드-방향족 알데히드 접합체는 물에 용해하고 동결건조시킨다.
또한, 퍼요오드산을 이용하여 약하게 산화시켜 폴리사카라이드 사슬 중에 새로운 알데히드기를 형성시키는 것도 가능하다. 산화후, 추가 알데히드기를 가진 폴리사카라이드를 알코올로 침전시키고 전술한 바와 같이 환원 아민화시킨다.
B. 폴리사카라이드 히드록실기를 통한 이민 형성 화합물의 첨가
카르보닐 함유 화합물에 접합된 글루칸 또는 만난을 제조하는 또 다른 방법은 접합체 형성용 폴리사카라이드 히드록실기를 사용하는 것이다. 이 방법에 대하여 반응식 2를 참조로 하여 설명한다. 이 방법은 글리코실 잔기 당 히드록실 기의 수 때문에 고밀도 카르보닐기를 가진 접합체를 제조할 수 있다. 폴리사카라이드의 히드록실기를 활성화시켜 카르보닐 함유 분자와 반응시킨다.
반응식 2
-OH 기를 통해 β-글루칸에 이민 형성 화합물의 첨가
폴리사카라이드의 히드록실기에 대한 카르보닐기 보유 화합물의 접합은 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트(DSC)로 제조할 수 있다. DSC에 의해 활성화된 히드록실기는 거의 대부분 1차 아민과 반응하고 자신의 -OH기를 통해 폴리사카라이드 사슬을 가교시키지는 않는다. β-1,3 글루칸의 히드록실기는 DSC에 의해 활성화되고, 이어서 에틸렌디아민과 반응시켜 글루칸 중으로 아미노기를 도입시킨다. 이 아미노기는 다음과 같은 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, 즉 3- 또는 5-포르밀살리실산, 4-포르밀신남산 및 3- 또는 4-카르복시벤즈알데히드 중 어느 1가지와 반응시키면 방향족 알데히드-글루칸 접합체를 형성한다. 글루코스 단위 3번째 마다 하나의 β-1,6 결합된 D-글루코스 분지를 보유하고 분자량이 약 130,000인 β-1,3 글루칸인 스클레로글루칸(7)은 물에 용해하고(2 내지 5% 용액), 동결 건조시켜 유기 용매 중에 용이하게 현탁되는 분말 생성물을 만든다. 동결건조된 스클레로글루칸 2 g(글루코실 잔기 12 mmol)을, DSC 0.8 g(3 mmol)을 함유하는 DMF 40 ㎖ 중에 현탁시킨다. 이 현탁액에, 무수 트리에틸아민(5.5 mmol) 0.75 ㎖를 함유하는 무수 피리딘 20 ㎖를 1 시간내에 첨가하고 실온에서 추가 4 시간 동안 반응시킨다. 이 반응물에 아세톤 1 부피량을 첨가하여, 불용성의 활성화된 스클레로글루칸 숙신이미딜 카르보네이트(8)를 수거하고 여과 세정한다. 활성화된 스클레로글루칸을 물 20 ㎖에 첨가하여 용해 또는 현탁시키고, 이것을 교반하에 에틸렌디아민 2 ㎖(30 mmol 또는 최대 폴리사카라이드의 활성화된 -OH기 보다 10배 과량)를 함유하는 0.2 M 중탄산칼륨 100 ㎖에 첨가하고 pH 8.5로 조정한다. 실온에서 4 시간 후, 반응액을 농축하고 물에 대하여 투석하여 아민화된 스클레로글루칸 유도체(9)로부터 과량의 반응물을 제거한 뒤, 동결 건조시킨다. 그 다음, 아민화된 폴리사카라이드를 숙신이미딜-3-포르밀살리실산 에스테르와 반응시킨다.
숙신이미딜-3-포르밀살리실산 에스테르는 다음과 같이 제조한다. DMF 10 내지 15 ㎖에 용해한 3-포르밀살리실산(3 mmol) 0.49 g과 NHS(3.5 mmol) 0.42 g 용액에 CMC 또는 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 p-톨루엔설포네이트(3 mmol) 1.28 g을 첨가하고, 수분 차단하에 실온에서 5 시간 동안 반응시켰다. 이 반응 혼합물에 2-머르캅토에탄올(30 mmol) 2.1 ㎖를 첨가하여 미반응된 CMC를 반응 정지시키고, 혼합한 뒤, 실온에서 10 분동안 반응시키고, 즉시 숙신이미딜-3-포르밀살리실산 에스테르(10)를 사용한다(이 3-포르밀살리실산 대신에 동등몰량의 5-포르밀살리실산, 4-포르밀페녹시아세트산 또는 3-카르복시벤즈알데히드를 사용할 수 있다).
아민화된 스클레로글루칸(약 2 g)을 0.1 M MOBS(4-[N-모르폴리노]부탄설폰산) 완충액(pH 7.6) 25 ㎖에 용해시킨 용액에, 교반하에 숙신이미딜 3-포르밀살리실산 에스테르와 머캅토에탄올을 함유하는 DMF를 첨가하고 실온에서 교반하에 4 내지 6 시간 동안 반응시킨다. 3-포르밀살리실산-스클레로글루칸 유도체(11)를 6 내지 8 부피량의 에탄올로 침전시키고 수거한 뒤 에탄올로 세정하여 과량의 반응물을 제거한다. 침전된 스클레로글루칸 유도체는 물 50 ㎖에 용해시키고, 물에 대하여 투석한 뒤 동결건조시킨다. 스클레로글루칸 유도체의 3-포르밀살리실산 함량은 H, C, N 및 O 원소 조성으로부터 측정할 수 있다. 스클레로글루칸 유도체 중의 방향족 알데히드 잔기의 함량은 다음과 같이 분광학적으로 측정할 수 있다. 0.05 M KOH 4 ㎖ 중에 스클레로글루칸 유도체 5 내지 8 ㎎을 용해시키고, 0.05 M KOH 중에 용해시킨 동일 농도의 미변형성 스클레로글루칸 용액을 대조군으로 하여 220 내지 320 nm 사이에서 UV 스펙트럼을 판독한다. 0.05 M KOH 중에서 측정한 이 화합물의 흡광 계수를 사용하여 병입된 3-포르밀살리실산을 측정한다. 또한, 알데히드 함량은 쉬프 시약으로 비색측정하거나 MBTH로 분광분석할 수 있다.
카르보닐기와 히드록실기를 모두 보유하는 화합물과 만난 같은 폴리사카라이드의 접합은 p-톨루엔설포닐(토실)클로라이드로 폴리사카라이드 히드록실기를 활성화시켜 실시할 수 있다[Nilsson, K., et al., Acta Chem. Scan. 35:19(1981); Nilsson, K., et al., Methods Enzymol. 104:56-69(1984)]. 반응식 3a를 참조하라.
반응식 3a
만난에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
S.세레비지애 유래의 만난에 있는 여러 1차 히드록실기는 인산화되어 있거나 포스포에스테르에 결합되어 있어 토실화에 이용될 수 없기 때문에 환원 조건하에 알칼리 가수분해를 통해 인산염을 제거하는 것이 필요하다. 베이커(Baker)의 효모 만난 4 내지 5 g을, 1% 나트륨 보로하이드라이드를 함유하는 1.5 M KOH 200 ㎖에 용해시키고 일정 교반하에 100 ℃에서 2 시간 동안 환류시킨다. 100 ℃에서 2 시간 후, 용액을 약 50 ℃로 냉각시키고 아세트산 약 18 ㎖를 사용하여 중화시킨다. 중화된 만난 용액을 교반하에 저온 에탄올 1.5 리터에 첨가하고, 이 혼합물을 4 시간 동안 방치하여 만난을 침전시킨다. 침전된 만난을 여과 수거하고 물에 용해한 뒤 물에 대하여 투석하여 염을 제거하고 동결건조시킨다.
동결건조된 만난(12)(약 6 mmol 만노스) 1g(피리딘 중의 현탁액을 건조하고 공비 혼합물을 제거함)을 DMF 15 ㎖ 중에 재현탁시키고, DMF 5 ㎖ 중에 용해한 토실 클로라이드(2.15 mmol) 2.5 g과 혼합한다. 이 혼합물에 피리딘 5 ㎖를 첨가하고 실온에서 18 시간 동안 교반하에 반응시켜, 만노실 20 내지 25 잔기 마다 1개의 토실기를 가진 토실화된 만난(13)을 생성한다. 토실화도는 다음과 같이 침전 및 알코올 세정된 활성화된 만난 시료를 사용하여 측정한다. 침전된 만난 8 ㎎을 0.1 N KOH 4 ㎖ 중에 용해하고 UV 흡광 스펙트럼(220 내지 360 nm)을 미변형 만난(0.1 N KOH 4 ㎖ 중에 8 ㎎) 대조군에 대하여 측정한다. 261 nm에서 480 M-1㎝-1인 토실에 대한 흡광 계수를 사용하여 토실기의 함량을 측정한다. 토실화된 만난(13) 제조물(약 0.9 g)을 0.5 M 중탄산칼륨 20 ㎖에 재현탁시키고, 여기에 2-시스테아민 HCl(18 mmol) 2 g을 첨가하고 pH를 1N KOH로 9.5 내지 10으로 조정한다. 교반 및 질소 대기하에 40 ℃에서 24 시간 동안 반응시켜 토실화된 -OH 당 약 1개의 시스테아민 잔기를 도입시킨다. 반응물을 물에 대하여 투석하여 과량의 반응물과 염을 제거하고 얻어지는 만난-시스테아민 유도체를 동결건조시킨다(14). 토실화된 만난에 결합된 시스테아민의 양은 유도체의 H, C, S, O 및 N 원소 조성으로부터 측정할 수 있다. 또한, 시스테아민 병입은 아민화된 만난 2 ㎎을함유하는 0.05 M 탄산칼륨 완충액(pH 9.5) 10 ㎖를 수성 TNBS(7.2 ㎎/㎖) 1 ㎖와 혼합하고 40 ℃에서 2 시간 동안 반응시켜 측정할 수 있다. 완충액 + TNBS 대조군에 대하여 363 nm에서의 흡광도를 측정하고 몰 흡광 계수 11,000 M-1㎝-1을 사용하여 병입된 -NH2를 측정한다.
반응식 3b
만난에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
반응식 3b는 만난-시스테아민에 대한 이민 형성 화합물의 결합에 대하여 예시한 것이다. 동결건조된 만난-시스테아민(0.8 내지 0.9 g)을 피리딘 20 ㎖ 중에 현탁시키고, 감압하에 공비 혼합물을 분리하여 물을 제거한 다음, 만난-시스테아민 잔기(14)를 피리딘:테트라히드로푸란(10:1) 40 ㎖ 중에 재현탁시킨다. 이 현탁물에 DCC(디시클로헥실카르보디이미드)(1.8 mmol) 0.37 g, p-카르복시벤즈알데히드 0.3 g 및 NHS(1.8 mmol) 0.21 g을 첨가하여 p-카르복시벤즈알데히드-NHS 에스테르 중간체(10)를 동일계에서 형성시킨다. 실온에서 교반하에 24 시간 동안 반응을 진행시킨다. DCU의 형성을 가속화하기 위하여 혼합물에 물 100 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 30 분 후, p-카르복시벤즈알데히드-만난 유도체(15)를 용해시키기 위하여 물 400 ㎖를 더 첨가한다. 실온에서 6 시간 동안 교반한 후, 디시클로헥실 우레아(DCU)를 하룻밤 동안 침강시킨 후 기울여 따라서 분리제거한다. 상청액을 여과하고, 감압하에 농축한 뒤 물에 대하여 투석하고 p-카르복시벤즈알데히드-만난 유도체(15)를 동결건조시킨다. 만난에 병입된 방향족 알데히드는 다음과 같이 분광학적으로 측정할 수 있다. 0.05 M KOH 4 ㎖ 중에 만난 유도체 5 내지 8 ㎎을 용해하고 0.05 M KOH 중의 동등 농도의 미변형 만난 용액을 대조군으로 하여 220 내지 320 nm에서 UV 스펙트럼을 판독한다. 0.05 M KOH 중에서 측정한 흡광계수를 사용하여 p-카르복시벤즈알데히드 농도를 계산한다. 또한, 알데히드 함량은 쉬프 시약을 사용하여 비색 측정하거나 MBTH를 사용하여 분광분석할 수 있다.
C. 펙틴 폴리사카라이드의 카르복시기에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
펙틴 폴리사카라이드(호모갈락트우로난, 람노갈락트우로난, 아라비노갈락탄, 아라반 또는 갈락탄) 유래의 카르복실기, 예컨대 갈락트우론산, 글루쿠론산, 아세르산, Kdo 또는 3-데옥시-D-만노옥툴로손산 및 기타 다른 산들은 카르보닐 함유(이민 형성) 화합물에 펙틴을 결합시키는데 사용할 수 있는 반응성기이다. 카르복실기는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하여 아민에 특이적으로 커플링시킬 수 있다. 반응식 4를 참조하라.
반응식 4
펙틴 폴리사카라이드에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
이 반응은 디옥산, DMF, 피리딘, 아세토니트릴 또는 이들의 혼합물과 같은 유기 용매 중에서 실시할 수 있다. 또한, 이 커플링 반응은 N-히드록시설포숙신이미드(설포-NHS) 또는 NHS 중 어느 하나와 함께 CMC 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)와 같은 수용성 카르보디이미드 중 하나를 사용하여 수성 매질 또는 반수성 매질 중에서 실시할 수 있다. 글리코실 잔기 당 아민기의 수는 과량의 디아민 리간드의 존재하에 제한된 양의 CMC를 사용하여 선택할 수 있다. 이와 같은 시도에 대해 반응식 4에 예시하고 있다. 일 예로서, 고온 수 50 ㎖ 중에 용해시킨 저메톡실 Na+펙티네이트(갈락투론산 〈11 mmol) 2.0 내지 2.2 g에, H+형태의 침강된 강양이온 교환 폴리스티렌 설폰산 수지(Dowex, 50-X8) 15 ㎖를 첨가하고 2 시간 동안 교반한다. 이 현탁액을 여과하여 수지를 제거하고, 수지를 가온수 20 ㎖로 세정한다. 이 펙틴(H+형태)(16) 용액을 부분 동결건조, 저압 회전 증발 또는 역삼투압에 의해 약 40 ㎖로 부피 감소시킨다. 이 펙틴 용액(H+형태)에 피리딘을 첨가하여 pH를 약 7.6으로 조정한다. 이 용액에 피리딘 10 ㎖와 에틸렌디아민(30 mmol) 2 ㎖에 용해시킨 CMC(2.35 mmol) 1 g과 NHS(3.4 mmol) 0.41 g을 교반 하에 첨가하고 이 혼합물을 일정 교반하에 실온에서 하룻밤 동안 반응시킨다. 다른 반응물로부터 아민화된 폴리사카라이드(17)의 분리는 에탄올 6 내지 8 부피로 침전시켜 실시한다. 에탄올 세정 및 침전되고, 아민화된 펙틴은 물에 용해하고, 투석한 뒤 동결건조시켜 물에 쉽게 용해되는 분말 생성물을 얻고, 그 아미노기 함량을 TNBS로 측정한다. 그 다음, 아민화된 펙틴을 다음과 같이 제조한 숙신이미딜-3-포르밀살리실산 에스테르와 반응시킨다. DMF 10 내지 15 ㎖에 용해시킨 NHS(3.5 mmol) 0.42 g과 3-포르밀살리실산(3 mmol) 0.49 g에, CMC(3 mmol) 1.28 g을 첨가하고 수분 차단하에 실온에서 5 시간 동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물에 2-머캅토에탄올(30 mmol) 2.1 ㎖를 첨가하여 미반응된 CMC를 반응 정지시키고, 실온에서 10 분 후 형성된 숙신이미딜-3-포르밀살리실산 에스테르(10)를 즉시 사용한다. (3-포르밀살리실산 대신 동등몰량의 3-카르복시벤즈알데히드, 4-포르밀-페녹시아세트산 또는 4,5-디옥소헵탄산을 사용할 수도 있다.)
0.1 M MOBS(4-[N-모르폴리노]부탄설폰산) 완충액(pH 7.6) 30 ㎖에 용해시킨 아민화된 펙틴 2 g에, 숙신이미딜 3-포르밀살리실산 에스테르와 머캅토에탄올을 함유하는 DMF 중의 반응 혼합물을 첨가하고 실온에서 6 시간 동안 교반하에 반응시킨다. 3-포르밀살리실산-펙틴 유도체(18)를 6 내지 8 부피량의 에탄올로 침전시키고, 그 다음 수거한 뒤 에탄올로 세정하여 과량의 반응물을 제거한다. 침전된 펙틴 유도체를 최소량의 물에 용해하고, 물에 대하여 투석한 뒤 동결건조시킨다. 또한, 아민화된 펙틴은 히드록실화된 카르보닐 함유 화합물의 숙신이미딜 카르보네이트 중간체, 예컨대 4-히드록시페닐아세트알데히드, 6-히드록시-2-나프토퀴논, 4-히드록시벤즈알데히드, 2,4-디히드록시벤즈알데히드, 포리밀디에놀론, 프로제스테론, 안드로스테론, 프레드니솔론 또는 피리독살과 반응시킬 수 있다. 반응물을 6 부피량의 에탄올과 혼합한 후, 알데히드 함유의 펙틴 폴리사카라이드 유도체를 그 다음 여과 수거하고, 물에 용해시킨 뒤, 물에 대하여 투석한 다음 동결건조시킨다.
대안으로, 아민화된 펙틴(17)은 테레프트알데히드 모노디에틸아세탈과 같이 자유 알데히드기 및 보호된 알데히드기를 함유하는 화합물과 반응시킬 수 있다. 아민화된 펙틴을 먼저 자유 알데히드기와 반응시켜 안정한 결합을 형성시키고, 이어서 이하 기재되는 바와 같이 보호된 알데히드를 약산 가수분해로 해리시킨다. 수성 테트라히드로푸란 또는 다른 적합한 용매 30 ㎖ 중에 현탁시킨 아민화된 펙틴 2 g에, 테레프트알데히드 모노디에틸아세탈(2 mmol) 0.43 g, 나트륨 시아노보로하이드라이드(3 mmol) 0.18 g을 첨가하고, 40 ℃에서 교반하에 하룻밤 동안 반응시켜 펙틴의 테레프트알데히드 모노디에틸아세탈 유도체(19)를 생성한다. 이 펙틴 유도체를 6 부피의 에탄올로 침전시키고, 수거한 뒤, 추가 에탄올로 여과 세정한다. 이 테레프트알데히드 모노디에틸아세탈 펙틴 유도체를 0.05 M HCl 최소량에 용해시키고 100 ℃에서 15 내지 20 분 동안 가열하여 아세탈을 알데히드 형태로 변환시킨다. 가수분해 후 페닐아세트알데히드 펙틴 유도체(20) 용액을, 물에 대하여 투석시킨 NaOH로 중화하고 동결건조시킨다. 펙틴 유도체의 방향족 알데히드 함량은 다음과 같이 분광학적으로 측정한다. 0.05 N NaOH 3 ㎖에 접합성 펙틴 5 내지 8 ㎎을 용해하고, 동량의 미변형 펙틴을 함유하는 대조 용액에 대하여 220 내지 320 nm 사이에서 UV 스텍트럼을 스캐닝한다. 펙틴 유도체의 방향족 알데히드 농도를 0.05 M NaOH에서 측정한 바와 같이 자유 방향족 알데히드의 흡광 계수를 사용하여 계산한다. 또한, 이 알데히드 함량은 MBTH로 분광학적으로 측정하거나 쉬프 시약으로 비색 측정할 수 있다.
대안으로, 유기 용매 중에서 펙틴 폴리사카라이드에 대한 카르보닐 함유 화합물의 도입을 실시할 수 있다. 일 예로, CMC, NHS 및 CMC에 대해 10배 과량의 디아민을, DMF-피리딘(6:4, v/v) 중에 현탁시킨 무수 동결건조형 펙틴(H+형태)에 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반 반응시킨다. 글리코실 잔기 당 아민기의 수는 제한 양의 CMC를 사용하여 과량의 디아민 리간드 존재하에 선택할 수 있다. 다른 반응물로부터 아민화된 폴리사카라이드의 분리는 6 내지 8 부피의 에탄올로 침전시켜 실시한다. 에탄올 세정 및 침전되고, 아민화된 펙틴은 물에 용해하고, 동결건조시켜 DMF-피리딘에 쉽게 재현탁되는 분말 생성물로 만든다. 그 다음, 아민화된 펙틴을 DMF-피리딘 중에서 (i) 카르복실화된 카르보닐 함유 화합물의 숙신이미딜 에스테르, 예컨대 4,5-디옥소헵탄산, 3- 또는 5-포르밀살리실산, 4-포르밀신남산, 또는 3- 또는 4-카르복시벤즈알데히드 또는 (ii) 히드록실화된 카르보닐 함유 화합물의 숙신이미딜 카르보네이트 중간체, 예컨대 2,4-디히드록시벤즈알데히드, 4-히드록시벤즈알데히드, 4-히드록시페닐아세트알데히드, 4'-히드록시아세토페논, 6-히드록시-2-나프토퀴논, 포르밀디에놀론, 프로제스테론, 안드로스테론, 프레드니솔론, 피리독살 중 어느 하나와 반응시킨다. 그 다음, 알데히드 함유 펙틴 폴리사카라이드 유도체는, 반응물을 에탄올 6 부피량과 혼합한 후 여과하여 수거하고, 물에 용해한 후 물에 대하여 투석한 다음 동결건조시킨다.
D. 키틴 유도체의 아미노기에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
대부분의 용매에서의 키틴의 불용성은 키틴에 대한 이민 형성 화합물의 첨가를 방해한다. 하지만, 수용성 키토산에 카르보닐 함유 화합물을 도입시키면 수불용성 겔을 형성하는데, 이것은 아마도 쉬프 염기에 의한 다른 폴리사카라이드 사슬의 카르보닐기와 글루코사민의 아민기간에 가교 결합한 결과로 사료된다. 이러한 방해는 아민기 중 약 85 %가 N-아세틸화되어 있는 수용성 키틴 유도체를 사용하면 피할 수 있는데, 그 예로는 글리콜 키틴(6-o-히드록시프로필 키틴 또는 6-o-히드록시에틸 키틴)[글루코사민의 1차 히드록실이 히드록시에틸화되어 있음]이 있다.
반응식 5
글리콜 키틴에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
일 구체예로서, 글리콜 키틴은 다음과 같이 제조한다. 42% NaOH 30 ㎖에 실온에서 2 시간 동안 현탁시킨 미분된 키틴(22)(N-아세틸 글루코사민 21.25 mmol 및 3.75 mmol 글루코사민에 해당함) 5 g에 빙수 혼합물 70 ㎖를 교반하에 첨가하여 고도 점성의 알칼리 키틴 분산액을 만든다. 이 분산액을 30 내지 35 ℃하에 1 내지 2 시간 동안 교반하면서 용액을 버블링시켜 에틸렌 옥사이드(114 mmol) 5 g을 첨가한다. 글리콜 키틴(23)을 80% 에탄올 6 부피량으로 침전시키고 유리 여과지 상에서 80% 에탄올로 세정하고, 물에 용해한 뒤, 물에 대하여 투석한 다음 동결건조시키고, 유리 아민기의 함량은 TNBS로 비색 측정한다. 물 40 ㎖에 용해/현탁시킨 동결건조된 글리콜 키틴(글루코사민 약 1.5 mmol) 1.7 내지 2 g에, 테레프트알데히드 모노디에틸아세탈(7.5 mmol) 1.60 g, 나트륨 시아노보로하이드라이드(6 mmol) 0.4 g을 함유하는 피리딘 40 ㎖를 첨가하고, 실온에서 4 시간 동안 반응시킨다. 글리콜 키틴(24)의 테레프트알데히드 모노디에틸아세탈 유도체(24)를 에탄올 4 내지 6 부피량으로 침전시키고, 이 침전물을 재현탁시킨 뒤, 80% 에탄올로 세정하여 과량의 반응물을 제거한다. 글리콜 키틴 유도체(24)를 0.05 M HCl 40 내지 50 ㎖에 용해시키고, 100 ℃에서 20 내지 30 분 동안 가열하여 알데히드기를 해리시키므로써 글리콜 키틴(25)의 벤즈알데히드 유도체를 생성한다. 글리콜 키틴 유도체의 벤즈알데히드 함량은 다음과 같이 분광학적으로 측정한다. 0.05 M KOH 4 ㎖ 중에 글리콜 키틴 유도체 5 내지 8 ㎎을 용해하고, 0.05 M KOH 중에 용해한 동일 농도의 글리콜 키틴 용액을 대조 용액으로 하여 220 내지 320 nm 사이에서 UV 스펙트럼을 판독한다. 병입된 벤즈알데히드를, 0.05 M KOH 중에서 측정한 이 화합물의 흡광 계수를 사용하여 산정한다. 또한, 알데히드 함량은 MBTH로 분광학적으로 측정하거나 쉬프 시약을 사용하여 비색 측정할 수 있다.
반응식 6에 기재한 다른 구체예에서는 전술한 바와 같이 형성된 글리콜 키틴(23)을 다음과 같이 제조한 숙신이미딜-5-포르밀살리실산에스테르(10)와 반응시킨다. DMF 10 내지 15 ㎖에 용해시킨 3-포르밀살리실산(3 mmol) 0.5 g과 NHS(3.5 mmol) 0.42 g에 CMC(3 mmol) 1.28 g을 첨가하고 수분 차단하에 실온에서 5 내지 6 시간 동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물에 p-머캅토에탄올(30 mmol) 2.1 ㎖를 첨가하여 미반응 CMC를 반응 정지시키고, 혼합한 뒤 실온에서 10 분 동안 반응시킨 다음, 숙신이미딜-5-포르밀살리실산 에스테르를 즉시 사용한다. 이 5-포르밀살리실산 대신에 동등몰량의 다른 카르복실화된 카르보닐 함유 화합물, 예컨대 4,5-디옥소헵탄산, 4-포르밀신남산, 3-카르복시벤즈알데히드 또는 4-포르밀페녹시아세트산을 사용할 수 있다. 0.1 M MOBS 완충액(pH 7.6) 40 ㎖에 용해시킨 글리콜 키틴(1.7 내지 2 g)에 숙신이미딜-5-포르밀살리실산 에스테르와 머캅토에탄올을 함유하는 DMF를 교반하에 첨가하고 실온에서 4 내지 6 시간 동안 교반하에 반응시킨다. 글리콜 키틴(26)의 3-포르밀살리실산 유도체를 6 부피량의 에탄올로 침전시키고 80% 에탄올로 세정하여 과량의 반응물을 제거한다. 침전된 글리콜 키틴 유도체를 물 50 내지 60 ㎖ 중에 용해하고 물에 대하여 투석한 뒤 동결건조시킨다. 글리콜 키틴 유도체의 3-포르밀살리실산 함량은 다음과 같이 분광학적으로 측정한다. 0.05 M KOH 4 ㎖ 중에 글리콜 키틴 유도체 5 내지 8 ㎎을 용해시키고, 0.05 M KOH 중에 동등 농도의 미변형 글리콜 키틴을 용해시킨 용액을 대조 용액으로 하여 220 내지 320 nm에서 UV 스펙트럼으로 판독한다. 0.05 M KOH 중에서 측정한 3-포르밀살리실레이트의 흡광 계수를 사용하여 병입된 3-포르밀살리실레이트를 측정한다. 또한, 알데히드 함량은 쉬프 시약을 사용하여 비색 측정하거나 MBTH로 분광학적으로 측정할 수 있다.
반응식 6
글리콜 키틴에 대한 이민 형성 화합물의 첨가
여기에 기재한 절차 외에도, 글리콜 에테르, 활성화된 할로겐 및 기타 다른 화합물의 사용과 같은 기타 다른 방법을 사용하여 폴리사카라이드의 글리코실 잔기에 카르보닐 함유 화합물을 접합시킬 수 있다. 예컨대, 문헌[Maron et al., Biochem. Biophys. Acta 278:243(1972)] 및 [Erlanger et al., J.Biol.Chem. 228:713(1957)]을 참조하라.
APC 표면 수용체에 의해 인식되는 기타 유용한 탄수화물 함유 화합물로는 각각 동물 및 박테리아 기원의 키틴 및 덱스트란을 포함한다. 적합한 탄수화물 함유 화합물의 예로는 박테리아 테이코산 및 이것의 유도체, 박테리아 리포폴리사카라이드, 지질 A 및 이것의 유도체가 있다.
비아쥬반트성 탄수화물 함유 생성물에 대한 이민 형성 카르보닐기 보유 화합물의 접합은 상기 생성물에 고유 아쥬반트성을 제공하고 예방 면역화의 효능을 증가시키는데 유용한 것으로 추정된다. 이러한 생성물의 예는 스트렙토코시, 스타필로코시 및 백신 항원으로 사용되는 다른 박테리아 유래의 폴리사카라이드이다.
약학적 조성물, 수의학적 조성물 및 그 사용 방법
또 다른 양태로서, 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염은 면역계 및/또는 비효과적 숙주 방어 기작에 결손이 있는 질환의 치료 또는 면역계에 대한 활성을 정상 수준 이상으로 증강시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염은 면역결손 포유 동물의 치료 또는 예방에 다른 치료제, 예컨대 다른 항바이러스제 또는 다른 항암제와 조합하여 투여하거나 또는 단독물로 투여할 수 있다.
본 발명의 접합체, 예를 들어 화학식 I로 표시되는 화합물 및 이것의 생리학적 허용성 염은 면역결손 포유 동물의 치료 또는 예방에 다른 치료제, 예컨대 다른 항바이러스제 또는 다른 항암제와 조합하여 투여하거나 또는 단독물로 투여할 수 있다.
면역 아쥬반트는 개체에게 투여시 또는 시험관내 시험시 항원이 투여되는 검체 또는 시험계 중에 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 화합물이다.
"유효량"이란 면역 기능을 실질상 정상 수준으로 복원시키거나 정상 수준 이상으로 면역 기능을 증가시켜 감염을 제거하는 본 명세서에 기재된 접합체의 양을 의미한다.
면역 반응의 강화란 억제된 면역 기능의 복원, 정상 면역 기능의 증강 또는 이 양자를 모두 의미한다. 면역 기능은 체액(항체 매개) 면역, 세포(T 세포 매개) 면역 또는 대식세포 및 과립구 매개 저항성의 발생 및 발현을 의미한다.
본 명세서에서, "면역결핍 환자"란 용어는 결핍 또는 결손성 면역계를 가진 환자를 의미한다. 면역결핍 환자는 T 림프구 증식 분석법을 사용하여 규명할 수 있다. 이 분석법을 사용하여 유사분열인자에 의한 자극에 대해 반응하는 T 세포의 활성 감소를 통해 면역결핍 환자를 규명할 수 있다. 이 분석법에 일반적으로 사용되는 유사분열인자의 일예는 피토헤마글루티닌(PHA)이다.
면역결핍 및 면역억제는 림프구, 구체적으로 면역 반응을 주관하는 T 세포로 시그널을 전달하는데 병변이 있는 많은 임상 상태에서 일어나는 것으로 생각된다. T 세포는 효과적인 면역 반응을 개시시키기 위하여 다음과 같은 2가지 시그널을 필요로 한다.
(i) 항원에 대한 특정 T 세포 수용체의 점유 및
(ii) 동시자극 수용체를 통한 자극.
시그널 (ii)의 부재시 T 세포는 응답 반응하지 못하고 만성적으로 무능하게 되거나 무력화될 수 있다. 지속적인 바이러스 감염 및 박테리아 감염과 종양 질환은 2차 시그널 전달을 다양한 방식으로 방해하여 T 세포 저감반응성을 생성할 수 있고 이런 방식으로 면역 반응을 회피한다. 본 발명의 접합체는 T 세포에 대한 결핍성 동시자극 시그널을 치환하거나 보충하여 작용하는 것으로 보인다.
최근 연구[Rhodes, J., Immunology Today 17:436(1996)]는 외인성 쉬프 염기 형성 화합물이 카르보닐기의 천연 공여체 대신 사용되어 CD4 T 헬퍼(Th) 세포에 동시자극 시그널을 제공할 수 있음을 입증하였다. 관련 연구[Zheng, B. et al., Science, 256:1560(1992)]에서는 새로운 알데히드 기를 형성하도록 APC를 갈락토스 산화효소로 처리하면 마우스에 항원 투여시 아쥬반트 효과를 제공한다고 밝히고 있다.
이와 같은 발견은 면역계의 자극인자로서 쉬프 염기 형성 화합물의 역할을 강조하는 것이다. APC와 Th 세포 간의 상호작용 동안에는 미규명의 세포 표면 수용체 상에 존재하는 Th 세포의 아미노기와 특정 APC 카르보닐기 사이에 쉬프 염기가 일시 형성된다. 쉬프 염기 형성 결과, Th 세포내 IL-2 및 IFN-γ 생성의 증가에 의한 Th1형 반응으로 면역계가 편중되고 CTL 반응의 증가가 일어난다. 쉬프 염기 형성 화합물은 APC 상에 존재하는 B7-1 수용체와 Th 세포 상의 CD28 수용체와 관련된 동시자극 경로를 우회하여 작동하는 것으로 나타난다.
면역계가 결손 또는 결핍되는 상황에는 여러 가지가 있다. 예컨대, 면역계 결핍은 미숙아 또는 조숙아(신생아)에 일반적으로 나타난다. 또한, 암 화학요법의 부작용과 같이 고의적인 특정 약물에 의한 억제로부터 일어날 수 있다. 암의 특정 형태에서와 같이 면역계 중 1 이상의 구성 성분의 무질서한 성장은 면역결핍을 일으킬 수 있다. 또한, 면역 결핍은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 비롯한 바이러스 감염에 의해 일어날 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염의 유효량을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하여 면역결손 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태로, 본 발명은 급성 및 만성 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물이나 이것의 생리학적 허용성 염에 의한 면역강화 요법이, 바람직하게는 항바이러스제와 함께 사용될 수 있는 급성 바이러스의 예는 다음과 같다.
헤르페스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키 바이러스, 피코나 바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 폭스 바이러스, 호흡성 합포체 바이러스, 유두종 바이러스, 엔테로바이러스, 아레나바이러스, 리노바이러스, 폴리오바이러스, 뉴캣슬 질환 바이러스, 광견병 바이러스 및 아르보바이러스.
본 발명의 접합체를 이용한 면역강화 요법을 사용할 수 있는 만성 바이러스 감염의 예는 지속성 헤르페스 바이러스 감염, 엡스타인 바르 바이러스 감염, 지속성 풍진 감염, 유두종바이러스 감염, 간염바이러스 감염 및 인간 면역결핍 바이러스 감염이다.
본 발명의 접합체는 상기 감염이나 질환의 치료에 단독물로 또는 다른 치료제와의 조합물로 사용할 수 있다. 본 발명에 기재된 조합 요법은 본 발명에 기재된 1종 이상의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염과 1종 이상의 다른 약학적 활성 성분의 투여를 포함한다. 본 발명의 약학적 활성 성분 및 화합물은 함께 또는 별도로 투여될 수 있고, 별도로 투여하는 경우에는 동시에 또는 임의 순서로 연속하여 실시할 수 있다. 본 발명의 약학적 활성 성분 및 화합물의 양과 상대적 투여 시기는 목적하는 복합 치료 효과를 얻을 수 있도록 선택한다. 조합 요법은 본 발명의 한 화합물과 하기 기재되는 제제 중 어느 한 제제의 투여를 포함하는 것이 바람직하다.
이와 같은 추가 치료제의 예로는 HIV 감염이나 관련 질환의 치료에 효과적인 제제, 예컨대 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(지도부딘), 기타 2',3'-디데옥시뉴클레오시드[예, 2',3'-디데옥시시티딘, 2',3'-디데옥시아데노신 및 2',3'-디데옥시이노신, 카르보비르, 아시클릭 뉴클레오시드(예, 아시클로비르), 2',3'-디데히드로티미딘], 프로테아제 억제제[예, N-tert-부틸-데카히드로-2-[-2(R)-히드록시-4-페닐-3(S)-[[N-2-퀴놀릴카르보닐)-L-아스파기닐]부틸]-(4aS, 8aS)-이소퀴놀린-3(S)-카르복스아미드(Ro31-8959)], 옥사티올란 뉴클레오시드 유사체[예, cis-1-(2-히드록시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일)-시토신 또는 cis-1-(2-(히드록시메틸)-1,3-옥사티올란 -5-일)-5-플루오로-시토신, 3'-데옥시-3'-플루오로티미딘, 2',3'-디데옥시-5-에티닐-3'-플루오로우리딘, 5-클로로-2',3'-디데옥시-3'-플루오로우리딘, 리바비린, 9-[4-히드록시-2-(히드록시메틸)부트-1-일]구아닌(H2G), TAT 억제제(예, 7-클로로-5-(2-피릴)-3H-1,4-벤조디아제핀-2-온(Ro5-3335) 또는 7-클로로-1,3-디히드로-5-(1H-피롤-2-일)-3H-1,4-벤조디아제핀-2-아민(Ro24-7429)], 인터페론(예, α-인터페론), 신(腎) 배출 억제제(예, 프로베네시드), 뉴클레오시드 수송 억제제(예, 디피리다몰, 펜톡시필린, N-아세틸시스테인, 프레세션, α-트리코산틴, 포스포노포름산, 뿐만 아니라 면역조절제, 예컨대 인터루킨 II, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 가용성 CD4 및 이들의 유전자 조작된 유도체를 포함한다. HBV 감염 치료에 효과적인 또 다른 치료제로는 카르보비르, 옥사티올란 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 cis-1-(2-히드록시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일)시토신 또는 cis-1-(2-(히드록시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일)-5-플루오로시토신, 2',3'-디데옥시-5-에티닐-3'-플루오로우리딘, 5-클로로-2',3'-디데옥시-3'-플루오로우리딘, 1-(β-D-아라비노푸라노실)-5-프로피닐우라실, 아사이클로비르 및 인터페론(예, α-인터페론)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염을 포유 동물의 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) 감염의 치료 및/또는 예방용 약제 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 디조오지 증후군(DiGeorge Syndrome), 진균 감염, 마이코플라즈마 감염, 결핵, 나병 및 전신 홍반성 루프스와 같이 상대적 T 세포 결핍으로 초래되는 질환을 치료하기 위한 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염의 용도를 제공한다.
또 다른 양태로, 본 발명은 포유 동물 중의 암을 치료 및/또는 예방하는 약제 제조에 사용하기 위한 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 화합물로 치료하기에 특히 적합한 암 형태로는 흑색종, 유방암, 결장암, 두부 및 경부 암, 위암, 신암, 후두암, 직장암 및 비호지킨스 림프종이 있다. 종양 특이 항원이나 정상 세포 상에서 발현률이 낮거나 매우 저 밀도로 발현되는 항원을 발현하는 암도 마찬가지로 치료 표적이다. 무력성이거나 비효과적인 종양 특이적 세포독성 T 세포를 포함하는 암 역시 치료의 표적이다. 재발률이 매우 높은 외과 절개성 종양 역시 본 발명의 화합물로 치료하기에 적합하다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 접합체, 예컨대 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이것의 생리학적 허용성 염의 백신 아쥬반트로서의 용도를 제공한다. 따라서, 백신은 본 발명의 접합체와 항원성 성분을 배합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은 경구, 비경구(경피, 피내, 근육내 및 정맥내 포함), 직장 및 흡입 중에서 선택되는 경로에 의해 인간 수용체에게 투여될 수 있다. 화합물의 유효 투여량은 수용체의 종류, 관련 면역강화의 종류, 치료해야 하는 질환의 정도 및 투여 경로를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라지나, 최종적으로는 처치의의 판단에 달려있다.
유효량은 일반적으로 개체 당 0.03 내지 250 ㎎ 범위, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 약 100 ㎎/투여량 범위이다. 면역 자극제는 1주에 1회만 또는 2회 투여되는 것이 좋고, 일부 경우에는 그 빈도가 더 적을 수 있다. 치료 빈도 및 기간은 종과 개체 마다 다르다.
본 발명의 화합물은 화합물 자체로서 투여하는 것도 가능하지만, 약학적 조성물 제제로서 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물과 함께 1종 이상의 허용성 담체 및 경우에 따라 기타 다른 치료 성분을 포함한다. 담체는 조성물의 다른 성분과 상용성이고 그 수용체에게 유해하지 않다는 의미에서 허용성이어야 한다.
면역 아쥬반트는 개체에게 투여하거나 시험관내에서 시험할 때, 항원이 투여되는 검체 또는 시험계 중의 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 화합물이다. 일부 항원은 단독 투여하는 경우에는 약한 면역원성이거나 검체 중의 유용한 면역 반응을 자극하는 농도에서는 검체에게 독성이다. 면역 아쥬반트는 항원을 더욱 강한 면역원성으로 만들어 항원에 대한 검체의 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 또한, 아쥬반트 효과는 검체 중에 유용한 면역 반응을 형성하는데 필요한 항원의 투여량을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물의 면역원 유도 활성은 다수의 공지 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명의 조성물 투여시 특정 항원에 대한 항체 역가의 증가는 면역원성 활성을 측정하는데 사용할 수 있다[Dalsgaard, K. Acta Veterinia Scandinavica 69:1-40(1978)]. 1가지 방법은 1종 이상의 외인성 항원을 포함하는 시험 조성물을 CD-1 마우스의 피내로 주사하는 것을 포함한다. 2주 후에 마우스로부터 혈청을 수거하고 항면역원 항체에 대하여 ELISA로 시험한다.
본 발명의 조성물은 검체 중의 항원에 대하여 활성 면역성을 유도하는 백신으로 유용하다. 본 발명의 조성물에 의해 유효 효과를 나타낼 수 있는 동물이라면 어떤 동물도 치료받을 수 있는 검체 범위에 포함된다. 검체는 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 접합체는 단독 아쥬반트로서 사용하거나 또는 대안으로 다른 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 이와 같은 아쥬반트로는 오일 아쥬반트(예, 프로인트 완전 및 불완전), 사포닌, 변형 사포닌, 리포좀, 무기 염[예, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), 실리카, 명반, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, 카올린 및 탄소], 폴리뉴클레오티드[예, 폴리 IC 산 및 폴리 AU 산) 및 특정 천연 물질(예, 코리네박테리움 파르범(Corynebacterium parvum), 보르데텔라 퍼튜시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라(Brucella) 속의 일원 중에서 발견되는 물질 뿐만 아니라 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 왁스 D], 소 혈청 알부민, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 에데스틴, 키홀 림펫 헤모시아닌, 슈도모날 톡신 A, 콜레라제노이드, 콜레라 독소, 백일해 독소, 바이러스 단백질 및 진핵 단백질(예, 인터페론, 인터루킨 또는 종양 괴사 인자)을 포함한다. 이러한 단백질은 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법에 따라 재조합원으로부터 또는 천연원으로부터 얻을 수 있다. 재조합원으로부터 얻는 경우, 비사포닌 아쥬반트는 최소한 분자의 면역원성 부를 포함하는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 기타 공지의 면역원성 거대분자로는 폴리사카라이드, tRNA, 비대사성 합성 중합체, 예컨대 폴리비닐아민, 폴리메타크릴산, 폴리비닐피롤리돈, 4,4'-디아미노디페닐-메탄-3,3'-디카르복실산과 4-니트로-2-아미노벤조산의 혼합 다중축합체(비교적 고분자량)[Sela, M., Science 166:1365-1374(1969)] 또는 당지질, 지질 또는 탄수화물을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 접합체는 투여되는 1 또는 그 이상의 특정 항원에 대해 광범위한 투여량 및 광범위한 비율로 투여될 때 아쥬반트 효과를 나타낸다.
본 발명의 접합체는 항원에 대한 면역 반응의 증강 효과를 얻기 위하여 개별적으로 투여되거나 다른 실질상 순수 아쥬반트와의 혼합물로 투여될 수 있다.
본 발명의 접합체는 1종 이상의 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는데 이용할 수 있다. 본 발명의 면역 반응 자극 조성물에 적합한 일반적인 항원으로는 다음과 같은 미생물, 즉 인플루엔자, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, HIV-1, HIV-2, 광견병, 홍역, B형 간염 또는 제(蹄)와 구강 질환과 같은 바이러스; 탄저병, 디프테리아, 라임병 또는 결핵과 같은 박테리아; 또는 바베오시스 보비스(Babeosis bovis) 또는 플라스모듐(Plasmodium)과 같은 원생생물 중 어느 하나로부터 유래되는 항원을 포함한다. 항원은 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드 또는 이것의 혼합물일 수 있다. 단백질 및 펩티드는 천연원에서 정제하거나 고상 합성법으로 합성하거나 재조합 유전자 조작으로 얻을 수 있다.
본 발명의 접합체는 만성 감염 질환, 구체적으로 면역 타협성 환자를 치료하기 위한 면역계 강화에 단독 투여될 수 있다. 본 발명의 접합체가 치료 또는 예방 치료에 이용될 수 있는 감염성 질환의 예에 대해서는 미국 특허 제5,508,310호에 기재되어 있다. 또한, 사포닌 접합체에 의한 면역계의 강화는 병원 감염 및/또는 수술후 감염의 위험을 제한하는 예방적 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 화합물의 투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 경피, 비측 또는 기타 다른 적합한 방법에 의해 실시할 수 있다. 투여되는 투여량은 연령, 체중,동시 치료의 종류, 경우에 따라 투여되는 항원의 성질에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 사포닌/항원 접합체는 투여되는 항원에 대한 다양한 투여량 및 다양한 비율로 투여될 수 있다. 초기 투여량 후 약 4주 후에 추가 자극 투여량을 투여하여 면역원성 반응을 증강시킬 수 있다. 또 다른 추가 자극 투여량을 투여할 수도 있다.
본 발명의 접합체는 경구 투여용 엘릭시르, 현탁제, 유탁제, 액상 용제, 캅셀과 같은 형태 또는 용제, 유탁제 또는 현탁제와 같은 멸균 액제 형태로 사용할 수 있다. 또한, 담체는 본 발명의 방법에 사용되는 화합물이 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 용해성을 나타내는 어떤 불활성 담체라도 바람직하게 사용되며, 그 예로는 식염수, 인산염 완충 식염수 등이 있다.
이상, 본 발명에 대하여 충분히 설명하였지만, 당업자라면 본 발명의 범위 또는 이것의 구체예에 영향을 미치지 않는 다양한 등가 범위의 조건, 조성물 및 기타 변수내에서 수행할 수 있다. 본 명세서에 기재된 모든 특허 및 공보는 본 발명에 전문을 참고 인용하였다.

Claims (28)

  1. (i) 항원 제시 세포(APC)의 세포 표면에 결합할 수 있는 폴리사카라이드, 및
    (ii) 안정한 카르보닐기를 가진 1종 이상의 분자를 포함하고,
    상기 폴리사카라이드(i)가 분자(ii)에 (iii) 직접 공유 결합 또는 안정한 카르보닐기를 본래 상태로 유지하는 방식으로 이작용성 링커를 통해 공유 결합되어 있는 폴리사카라이드 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 1종 이상의 분자(ii)가 방향족 알데히드, 방향족 케톤, 시클로알킬 알데히드, 시클로알킬 케톤, 시클로알케닐 알데히드, 시클로알케닐 케톤, 헤테로시클릭 알데히드, 헤테로시클릭 케톤, 헤테로방향족 케톤, 헤테로방향족 알데히드, 알킬 알데히드, 알킬 케톤, 알케닐 알데히드 및 알케닐 케톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 직접 공유 결합을 통해 폴리사카라이드에 결합되어 있는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 이작용성 링커 분자의 잔기를 통해 폴리사카라이드에 결합되어 있는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  5. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 최소 2개의 사카라이드를 포함하는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  6. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 β-글루칸, 만난, 펙틴 폴리사카라이드 및 2-아세트아미도 글루칸 폴리사카라이드로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  7. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 일치환 및 이치환된 C6-10아릴알데히드, C6-10아릴(C1-4)알킬알데히드 및 이의 혼합물로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  8. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 포르밀 또는 포르밀(C1-4)알킬 치환체에 의해 치환되고, 경우에 따라 할로, 히드록실, C1-4알킬, C1-4알콕시, 트리플루오로메틸 및 벤질옥시로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 추가 치환체를 포함하는 나프틸 또는 페닐인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  9. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 1개 또는 2개의 히드록실 및 할로에 의해 치환된 벤즈알데히드 및 나프트알데히드인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  10. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 2,3-, 2,4-, 2,5- 및 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 5-클로로-2-히드록시벤즈알데히드, 바닐린, 에틸 바닐린, 나린제닌, 3- 및 4-히드록시벤즈알데히드 또는 4-히드록시페닐아세트알데히드인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  11. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 히드록실 치환된 C1-4알킬(C6-10)아릴 케톤 및 히드록실 치환된 아릴 케톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  12. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 2-히드록시아세토페논, 3-히드록시아세토페논, 4-히드록시아세토페논 및 6-히드록시-1,2-나프토퀴논으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  13. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 헤테로아릴 알데히드 및 헤테로아릴 케톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  14. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 각각 케토, 포르밀 또는 포르밀(C1-4) 치환체를 보유하고, 바람직하게는 또 다른 할로 또는 히드록실 치환체를 포함(이용가능한 시클릭 탄소 원자가 수반되는 경우)하는, 티오펜, 푸란, 벤조티오펜, 벤조푸란, 피리딘, 퀴놀린, 피리다진, 피리미딘, 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 이속사졸 및 옥사졸인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  15. 제1항에 있어서, 안정한 카르보닐기를 가진 분자가 피리독살, 2-티오펜카르복스알데히드 및 3-티오펜카르복스알데히드 중 어느 하나인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  16. 제1항에 있어서, 이작용성 링커 분자의 잔기가
    H2N-(CH2)r-NH2(n은 2 내지 12),
    HO-(CH2)r-NH2(r은 2 내지 12),
    HS-(CH2)r-NH2(r은 2 내지 12),
    경우에 따라 카르복시 보호되는 아미노산, 및
    H-(O-CH2-CH2)n-OH(n은 1 내지 4)로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  17. 제5항에 있어서, 이작용성 링커 분자가 에틸렌디아민, 1,4-부탄디아민, 스퍼미딘, 2,4-디아미노부티르산, 리신, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 디알라닌, 트리알라닌, 3,3'-디아미노디프로필아민, 디아미노프로피온산, N-(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민 및 2-(4-아미노페닐)에틸아민으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  18. 제1항에 있어서, 이작용성 링커 분자가
    -NH-(CH2)r-NH-(r은 2 내지 5)
    -O-(CH2)r-NH-(r은 2 내지 5)
    -NH-CH2-C(O)-
    -O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-
    -NH-NH-C(O)-CH2-
    -NH-C(CH3)2-C(O)-
    -S-(CH2)r-C(O)-(r은 1 내지 5)
    -S-(CH2)r-NH-(r은 2 내지 5)
    -S-(CH2)r-O-(r은 1 내지 5)
    -S-(CH2)-CH(NH2)-C(O)-
    -S-(CH2)-CH(COOH)-NH-
    -O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(CO2H)-NH-
    -O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(NH2)-C(O)-
    -O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH2-CH2-NH-
    -S-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH- 및
    -NH-O-C(O)-CH2-CH2-O-P(O2H)으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  19. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 β-글루칸, 만난, 펙틴 폴리사카라이드, 키틴 및 이것의 유도체, 뮤레인, 박테리아 프럭탄, 크산탄, 박테리아 헤테로폴리사카라이드, 진균성 플룰란 및 이것의 에스테르, 설포네이트, 설페이트, 포스페이트, 에테르 및 가교 유도체로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  20. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 (1→6) 결합에 의해 연결된-D-글루코피라노실 유니트를 지닌 (1→3) 결합된-D-글루코피라노실 유니트 주쇄를 보유하는 β-글루칸으로, 분자량이 약 5000 내지 약 500000이고, 이 β-글루칸이 경우에 따라 1종 이상의 음이온기, 양이온기 또는 비이온기의 첨가에 의해 변형되기도 하는 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  21. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 말단 환원성 만노실 잔기를 가진 (1→4)폴리만노스를 포함하는 β-만난 또는 이것의 아세틸화 생성물인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  22. 제1항에 있어서, 폴리사카라이드가 호모갈락트우로난, 람노갈락트우로난, 아라반, 갈락탄 및 아라비노갈락탄으로 구성된 군 중에서 선택되고 면역강화 활성을 보유하는 펙틴 폴리사카라이드인 것이 특징인 폴리사카라이드 접합체.
  23. 제1항에 기재된 폴리사카라이드 접합체 및 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 폴리사카라이드 접합체와의 혼합물로 항원을 추가로 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  25. (a) 제1항에 기재된 폴리사카라이드 접합체,
    (b) 항원의 면역학적 유효량 및
    (c) 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 백신.
  26. 제23항에 기재된 조성물을, 면역 반응을 증강시킬 필요가 있는 포유 동물의 면역 반응을 증강시키기에 효과적인 양으로 상기 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 동물의 면역 반응을 증강시키는 방법.
  27. 제25항에 기재된 조성물을 항원에 대한 동물의 면역 반응을 강화시키기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하여, 동물 중의 항원에 대한 면역 반응을 강화시키는 방법.
  28. 제25항에 기재된 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하여 동물에게 예방 접종하는 방법.
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU760669B2 (en) * 1998-04-28 2003-05-22 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
WO2001076626A2 (en) * 2000-04-11 2001-10-18 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic aromatic aldehyde and ketone derivatives and the use thereof as immunostimulants and adjuvants
AUPQ797700A0 (en) * 2000-06-06 2000-06-29 Austin Research Institute, The Vaccine
US20040248214A1 (en) * 2001-10-09 2004-12-09 Akikuni Yagita Novel method of assaying immune activity
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
US20040126272A1 (en) * 2002-08-28 2004-07-01 Eric Bornstein Near infrared microbial elimination laser system
WO2004092329A2 (en) * 2003-04-08 2004-10-28 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Semi-synthetic saponin analogs with carrier and immune stimulatory activities for dna and rna vaccines
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005044861A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-19 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharides of helicobacter pylori
EP2267062B1 (en) * 2003-11-04 2017-10-25 SupraPolix B.V. Supramolecular polymers containing quadruple hydrogen bonding units in the polymer backbone
WO2006006855A1 (en) * 2004-07-12 2006-01-19 Suprapolix B.V. Supramolecular ionomers
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US8246990B2 (en) * 2005-05-04 2012-08-21 Suprapolix B.V. Hydrogen bonded hydrogels
ES2376888T3 (es) 2005-05-04 2012-03-20 Suprapolix B.V. Materiales supramoleculares activos biológicamente, modulares biorreabsorbibles o biomédicos
EP2399609B1 (en) 2005-08-24 2015-03-18 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
EP2612872A3 (en) 2006-06-02 2014-01-22 Synedgen, Inc. Chitosan-Derivative Compounds
US20100076147A1 (en) * 2006-11-20 2010-03-25 Suprapolix B.V. Supramolecular polymers from low-melting, easily processable building blocks
US8628789B2 (en) * 2007-03-23 2014-01-14 Suprapolix, B.V. Strong reversible hydrogels
JP5350626B2 (ja) * 2007-12-20 2013-11-27 キリンフードテック株式会社 樹状細胞活性化用組成物
US8754213B2 (en) * 2008-07-04 2014-06-17 Suprapolix B.V. High flow supramolecular compounds
WO2010030366A2 (en) 2008-09-11 2010-03-18 Nektar Therapeutics Polymeric alpha-hydroxy aldehyde and ketone reagents and conjugation method
SG176068A1 (en) 2009-06-03 2011-12-29 Immunogen Inc Conjugation methods
CN101791410B (zh) * 2010-01-25 2013-03-27 中国药科大学 抗感染药物-多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用
US9006386B2 (en) 2010-11-05 2015-04-14 Suprapolix B.V. Process for the preparation of a supramolecular polymer
WO2012097223A2 (en) * 2011-01-14 2012-07-19 Emory University Oligosaccharide conjugates for targeting bacteria and uses related thereto
US9023600B2 (en) 2011-02-16 2015-05-05 The University Of Akron Highly selective pyrophosphate sensor
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
EP2776070A4 (en) * 2011-11-09 2016-02-10 Ascend Biopharmaceuticals Ltd IMMUNOMODULATORY CONJUGATES
TW201340980A (zh) * 2012-04-10 2013-10-16 Taiwan Hopax Chems Mfg Co Ltd 金屬多醣體共軛物：含其之組合物、其製造方法、及以其治療癌症的方法
CN102626518B (zh) * 2012-05-09 2014-05-28 中国药科大学 一种包载难溶性药物的泊洛沙姆/两亲性多糖混合胶束的制备和应用
RU2018122734A (ru) 2012-10-04 2018-07-24 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент
US9402925B2 (en) 2013-03-12 2016-08-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio Probes and methods of imaging a bacterial infection
WO2016176510A1 (en) * 2015-04-28 2016-11-03 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Piv5-based amplifying virus-like particles
CN107261130A (zh) * 2017-06-29 2017-10-20 云南沃森生物技术股份有限公司 一种用dsc作为活化剂的细菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法
US11116737B1 (en) 2020-04-10 2021-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods of using probenecid for treatment of coronavirus infections
EP4304606A1 (en) * 2021-03-12 2024-01-17 Children's Medical Center Corporation Polysaccharide adjuvants for virus vaccines
US11572420B1 (en) 2021-07-30 2023-02-07 Tissue repair ltd Isolated biological polysaccharide compound, methods of use and methods of manufacture thereof
US11384160B1 (en) * 2021-07-30 2022-07-12 Tissue repair ltd Method of making a beta glucan compound
CN114805637B (zh) * 2022-05-31 2023-02-03 中国科学院海洋研究所 一种海洋生物多糖席夫碱衍生物及其制备方法和应用

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US554386A (en) * 1896-02-11 Stove-truck
US3297604A (en) 1963-10-28 1967-01-10 American Mach & Foundry Oxidized galactose containing reaction products
US3236792A (en) 1963-12-12 1966-02-22 Miles Lab Water-dispersible form of dialdehyde polysaccharides and process therefor
US4003792A (en) 1967-07-01 1977-01-18 Miles Laboratories, Inc. Conjugates of acid polysaccharides and complex organic substances
GB1550819A (en) 1975-06-04 1979-08-22 Nat Res Dev Polymeric support for biogically active materials
US4063016A (en) 1975-12-15 1977-12-13 University Of Delaware Chitin complexes with alcohols and carbonyl compounds
US4424346A (en) 1981-06-04 1984-01-03 Canadian Patents And Development Ltd. Derivatives of chitins, chitosans and other polysaccharides
SE8200751L (sv) 1982-02-09 1983-08-10 Olle Larm Forfarande for kovalent koppling for framstellning av konjugat och hervid erhallna produkter
BR8202708A (pt) 1982-05-11 1983-12-20 Petroleo Brasileiro Sa Sistema de enzima imobilizada e processo para sua preparacao
JPS6051702A (ja) * 1983-08-30 1985-03-23 Rikagaku Kenkyusho 複合多糖およびその製造法
DE3340592A1 (de) 1983-11-10 1985-05-23 B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen Konjugate makromolekularer verbindungen an haemoglobine, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4983748A (en) 1984-08-17 1991-01-08 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Acetals useful for the preparation of polysaccharide derivatives
US4741804A (en) 1984-08-17 1988-05-03 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide derivatives containing aldehyde groups, their preparation from the corresponding acetals and use as paper additives
US4703116A (en) 1984-08-17 1987-10-27 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide derivatives containing aldehyde groups, their preparation from the corresponding acetals and use as paper additives
US4731162A (en) 1984-08-17 1988-03-15 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide derivatives containing aldehyde groups for use as paper additives
US4675394A (en) 1984-08-17 1987-06-23 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide derivatives containing aldehyde groups, their preparation from the corresponding acetals and use as paper additives
SE466289B (sv) 1984-09-19 1992-01-27 James Hoffman Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning
US4895724A (en) 1985-06-07 1990-01-23 Pfizer Inc. Chitosan compositions for controlled and prolonged release of macromolecules
US4739046A (en) * 1985-08-19 1988-04-19 Luzio Nicholas R Di Soluble phosphorylated glucan
US4693891A (en) 1985-09-09 1987-09-15 Miles Laboratories, Inc. Vaccine for Pseudomonas aeruginosa
DK163176C (da) 1985-09-27 1992-06-22 Schweiz Serum & Impfinst Ugiftig konjugatvaccine mod infektioner af pseudomonas aeruginosa- og escherichia coli- bakterier, fremgangsmaade til fremstilling heraf og anvendelse af vaccinen
US4663448A (en) 1985-10-23 1987-05-05 National Starch And Chemical Corporation Aldehyde-containing heterpolysaccharides, a process for their preparation, and the use thereof
US5554386A (en) 1986-07-03 1996-09-10 Advanced Magnetics, Inc. Delivery of therapeutic agents to receptors using polysaccharides
US4801699A (en) 1987-03-09 1989-01-31 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide esters containing acetal and aldehyde groups
US4749800A (en) 1987-03-09 1988-06-07 National Starch And Chemical Corporation Polysaccharide esters containing acetal and aldehyde groups
US5583112A (en) * 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
EP0320942A3 (en) 1987-12-18 1989-10-04 American Cyanamid Company Novel polysaccharides novel macromolecular conjugates of the polysaccharides
EP0326111A3 (en) 1988-01-29 1989-12-27 New York Blood Center, Inc. Peptide derivatives rendered immunogenic when administered with alum as an adjuvant
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5433955A (en) * 1989-01-23 1995-07-18 Akzo N.V. Site specific in vivo activation of therapeutic drugs
US5057503A (en) 1989-01-23 1991-10-15 The Brigham And Women's Hospital Derivativized polysaccharides with biologic activity, method of their isolation, and uses therefor
US5032401A (en) * 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
US5622939A (en) * 1992-08-21 1997-04-22 Alpha-Beta Technology, Inc. Glucan preparation
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
US5169840A (en) 1991-03-27 1992-12-08 Nobipols Forskningsstiftelse Diequatorially bound β-1, 4 polyuronates and use of same for cytokine stimulation
ZA927923B (en) 1991-10-16 1993-04-26 Schering Corp Lipophilic oligosaccharide antibiotic salt compositions.
US5591771A (en) * 1991-12-17 1997-01-07 Michel Fockerman Use of propolis components as an adjuvant
JPH06166635A (ja) * 1992-06-18 1994-06-14 San Five Kk 免疫アジュバント
EP0678298A3 (en) 1992-10-01 1996-05-29 Wellcome Found Use of 4- (2-formyl-3-hydroxyphenoxymethyl) benzoic acid as an immunopotentiating agent.
SE500964C2 (sv) 1993-01-19 1994-10-10 Medicarb Ab Fast bärare med modifierad yta varvid modifikationen åstadkommes genom en primer innehållande en polysackarid och förfarande för framställning av en sådan bärare
WO1994019376A1 (en) * 1993-02-26 1994-09-01 Drug Delivery System Institute, Ltd. Polysaccharide derivative and drug carrier
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
US5567685A (en) 1994-08-16 1996-10-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Water-Soluble polyene conjugate
US5912000A (en) 1994-09-23 1999-06-15 Zonagen, Inc. Chitosan induced immunopotentiation
US5738855A (en) * 1994-10-17 1998-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Synthesis of typhoid fever vaccine from a plant or fruit polysaccharide
WO1996020012A2 (en) 1994-12-23 1996-07-04 Middlesex Sciences, Inc. Methods for preparing and purifying macromolecular conjugates
AU721276B2 (en) 1995-04-04 2000-06-29 Wound Healing Of Oklahoma Cancer treatment by photodynamic therapy, in combination with an immunoadjuvant
US5785975A (en) * 1995-06-26 1998-07-28 Research Triangle Pharmaceuticals Adjuvant compositions and vaccine formulations comprising same
AU726344B2 (en) * 1995-10-27 2000-11-02 Board Of Regents Of The University Of Nebraska, The High fluorescence specific immune enhancing factor and methods of use for same
AU1991097A (en) 1996-03-15 1997-10-01 Immunotherapy, Inc. Dialdehydes as immunostimulatory adjuvants and cross-linkers for producing immunogenic preparations and generating pressure and cross-linked treated cells for enhancing and augmenting the immune response against cancers, tumors and pathogenic diseases
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5929049A (en) 1997-08-08 1999-07-27 Dade Behring Marburg Gmbh Polysaccharide conjugates of biomolecules
CA2266718C (en) * 1997-08-08 2007-05-22 Behringwerke Aktiengesellschaft Polysaccharide conjugates of biomolecules
AU760669B2 (en) * 1998-04-28 2003-05-22 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
KR100680014B1 (ko) 2007-02-09
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JP2001518556A (ja) 2001-10-16
EP1027061A1 (en) 2000-08-16
US6960344B2 (en) 2005-11-01
US20040220142A1 (en) 2004-11-04
CA2305599A1 (en) 1999-04-15

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