SE500964C2 - Fast bärare med modifierad yta varvid modifikationen åstadkommes genom en primer innehållande en polysackarid och förfarande för framställning av en sådan bärare - Google Patents

Description

500 964 10 15 20 25 30 35 2 tioner till vidhäftning mot ytan. Detta reagens kan ytter- ligare stabiliseras genom tillförande av en bryggbildare, vanligen en funktionell organisk substans.

Bakgrundsteknik De primers och bryggbildare som hittills använts framställes vanligen utgående från material av icke-bio- logiskt ursprung och är av en icke-bionedbrytbar typ.

Exempel på reagenser är polyetylenimin och tridodecyl- metylammoniumklorid. Ytterligare detaljer beträffande denna immobiliseringsteknik återfinnes i Hoffmann J., Larm O. och Scholander S., A new method for covalent coupling of heparin and other glycosaminoglycans to substances containing primary amino groups, (1983) 117, 328; Larm O., non-thrombogenic surface prepared by selective covalent Carbohydrate Research Larsson R. and Olsson P., A new binding of heparin via a modified reducing terminal residue, Biomaterials, Medical Devices and Artificial Organs (1983) ll, 161.

Föreliggande uppfinning har som huvudändamål att åstadkomma ny teknik för modifiering av ytor för att möjliggöra introduktion av reaktiva grupper av en hydrofil karaktär på sådana ytor.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ny teknik för utförande av sådan modifikation under an- vändning av substanser som är av biologiskt ursprung och även är av den bionedbrytbara typen. Ännu ett ändamål med uppfinningen är införandet av rekativa amino- och/eller hydroxylgrupper lämpliga för kovalent bindning av biologiskt aktiva substanser på aktuella ytor.

Ytterligare ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ny teknik som möjliggör modifikation av ytor för att göra nämnda ytor mera hydrofila genom införandet av funktionella grupper, som kan användas för kovalent koppling av biologiskt aktiva substanser på sådana ytor. 10 15 20 25 30 35 SUG 964 3 Sammanfattning_av uppfinningen Genom föreliggande uppfinning åstadkommes sålunda en fast bärare, vars yta modifierats för införande av reak- tiva grupper av hydrofil karaktär på ytan. Modifikationen av ytan åstadkommes genom en primer som innefattar en första polysackarid innehållande som reaktiva grupper amino- och hydroxylgrupper. Det har sålunda överraskande befunnits, att en sådan första polysackarid kan effektivt anslutas till ytan av fasta bärare, och en speciellt före- dragen utföringsform av uppfinningen består i att nämnda första polysackarid är kitosan.

Kitosan består av 1,4-B-bundna D-glukosaminenheter.

Polysackariden är linjär och kvaliteterna varierar med av- seende på graden av N-acylering. I naturen är samtliga aminogrupper acetylerade och polysackariden kallas då kitin. Den erhålles huvudsakligen från skal av krabbbor och räkor.

Det är föredraget att kitosan har en grad av N-acy- lering av högst cirka 90%. En föredragen grad av N-acy- lering är högst cirka 50% och företrädesvis mindre än cirka 25%.

Enligt en föredragen sida av uppfinningen har nämnda första polysackarid stabiliserats genom förnätning under användning av en periodatoxiderad andra polysackarid med vicinala hydroxylgrupper eller amino- och hydroxylgrupper i vicinal position, varvid nämnda polysackarid underkas- tats periodatoxidation till bildning av minst ett par dialdehydfunktioner.

Det är föredraget att nämnda andra polysackarid an- vänd för stabilisering genom förnätning är utvald bland polysackarider, vars bionedbrytningsprodukter är ogiftiga, såsom D-glukosamin och D-glukos. Det är speciellt före- draget att nämnda andra polysackarid är utvald ur gruppen innefattande kitosan, amylos och glykosaminoglykaner.

Bärare med modifierade ytor i enlighet med förelig- gande uppfinning är vanligen av hydrofob eller inert karaktär och kan vara utvalda ur gruppen innefattande 500 964 10 15 20 25 30 35 4 polyolefiner, polyuretaner, polyvinylklorid, polystyren, silikon och polytetrafluoretylen eller fràn gruppen inne- fattande medicinskt acceptabla metaller och glas. Bland de polymera materialen är polyolefiner föredragna, såsom polyeten eller polypropen.

Uppfinningen innefattar även ett förfarande för fram- ställningen av en fast bärare, vars yta modifierats för införande av reaktiva grupper av hydrofil karaktär på ytan. Nämnda förfarande innefattar följande steg: a) åstadkommande av en bärare, vars yta skall modi- fieras; b) framställning av en lösning av nämnda första polysackarid; c) överdragning av nämnda yta med den lösning som erhålles fràn steg b); och d) åstadkommande av utfällning av nämnda första poly- sackarid på nämnda yta resulterande i modifikation av dess egenskaper.

Vid ett sådant förfarande är det föredraget att som nämnda första polysackarid använda ett kitosan.

Enligt en föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen supplementeras den under steg c) ovan beredda lösningen med en andra polysackarid med vicinala hydroxylgrupper eller amino- och hydroxylgrupper i vicinal position, och nämnda andra polysackarid har underkastats periodatoxidation till bildning av minst ett par aldehyd- funktioner. Funktionen för nämnda andra polysackarid är att stabilisera nämnda första polysackarid genom brygg- bildning.

Det är föredraget att nämnda andra polysackarid är utvald bland polysackarider, vars bionedbrytningsprodukter är ogiftiga, såsom D-glukosamin och D-glukos. Bland spe- ciellt föredragna polysackarider utgörande nämnda andra polysackarid återfinns kitosan, amylos och glykosamino- glykaner. 10 15 20 25 30 35 500 964 5 Föreliggande uppfinning kommer nu att ytterligare illustreras genom icke inskränkande exempel med hänvisning till bilagda ritningar, vari: Figurerna 1 och 2 illustrerar genom kemiska formler en kovalent koppling av kolsyreanhydras på en yta inne- hållande primära aminogrupper; och Figur 3 är en schematisk illustration av tänkbara kopplingsreaktioner för erhållande av kovalent koppling av en biologiskt aktiv substans till en modifierad bäraryta.

Illustration av reaktioner resulterande i kovalent bindning Figur 3 illustrerar ett antal reaktioner, som kan användas i förening med föreliggande uppfinning för kovalent bindning av biologiskt aktiva substanser på bärare innehållande amino- och/eller hydroxylgrupper. De illustrerade reaktionerna skall tolkas som endast exempel och är ej avsedda att inskränka uppfinningens omfattning.

I figur 3 illustrerande kovalent koppling till amino- eller hydroxylgrupper är EDC en vattenlöslig karbodiimid och Z är lika med O eller NR, R, R' och R" är organiska grupper, eventuellt immobiliserade.

Med avseende på substrat som utgöres av polymerer av hydrofob karaktär, såsom polyeten och polypropen, är det föredraget att etsa ytan för applicering av den första polysackariden. Sådan etsning kan utföras under användning av ett oxidationsmedel i sur lösning, såsom kaliumperman- ganat i svavelsyra. Sådan etsning förbättrar vidhäftningen av den första polysackariden, vare sig den är stabiliserad genom förnätning eller ej.

I de icke inskränkande exemplen nedan avser procent- tal och delar vikten om ej annat anges.

EXEMPEL 1 Etsning av polyetenytor Polyetenfilm eller -slang inkuberas i 2 minuter vid rumstemperatur med en lösning av 2% kaliumpermanganat (KMnO4) (vikt/vol) i koncentrerad svavelsyra H SO och 2 4 sköljes noggrant med destillerat vatten. 500 10 15 20 25 30 35 964 EXEMPEL 2 Periodatoxidation av kitosan I ett typiskt exempel när cirka 10% av monosackarid- resterna oxideras upplöses polysackaridkitosan innehållan- de l5% N-acetylgrupper i vatten (100 ml) och natriumperio- dat (0,5 g) tillsättes. Lösningen förvaras i mörker vid rumstemperatur i 24 timmar. Reaktionsblandningen dialy- leras sedan mot destillerat vatten och frystorkas till bildning av 4,1 g kitosan innehållande dialdehydfunk- tioner.

EXEMPEL 3 Exempel 2 upprepas under användning av amylos i stället för kitosan.

EXEMPEL 4 Exempel 2 upprepas under stället för kitosan. Liknande EXEMPEL 5 Aminering med kitosan och bryggbildning Liknande resultat erhålles. användning av hyaluronsyra i resultat erhålles.

Den från exempel 1 erhållna ytan behandlas vid rums- temperatur med en lösning av kitosan innehållande 15% N-acetylgrupper (O,25% vikt/vol) i vatten tillsammans med en bryggbildare (0,015% vikt/vol) framställd såsom be- skrives i exempel 2 ovan. Ytan sköljes noggrant med etanol (80%) och stabiliseras sedan genom reaktion i 2 timmar vid 50°C med natriumcyanoborhydrid (0,00025% vikt/vol i 0,15 M NaCl, pH 3,9). Ytan sköljes med vatten och behandlas med en lösning av dextransulfat (Pharmacia AB, Uppsala, Sverige) 0,1 g/L i 0,15 M NaCl, pH 3,0 i 10 minuter vid 55°C. Efter sköljning med stora volymer destillerat vatten behandlas ytan med en lösning av 0,25% kitosan i vatten- lösning vid pH 9,0, 10 minuter vid rumstemperatur och tvättas såsom ovan. Närvaron av aminogrupper verifieras med en indikator (ponceau S, Sigma).

EXEMPEL 6 Exempel 5 upprepas men under användning av brygg- bildaren i exempel 3. 10 15 20 25 30 35 500 964 EXEMPEL 7 Exempel 5 upprepas men under användning av brygg- bildaren i exempel 4.

EXEMPEL 8 Aminering med enbart kitosan Ytan från exempel 1 behandlas vid rumstemperatur med en lösning av kitosan innehållande 15% N-acetylgrupper (0,25% vikt/vol) i vatten.

EXEMPEL 9 Kovalent koppling av biologiskt aktiv substans till modifierad yta.

Polyetenpärlor etsas såsom i exempel l ovan och amineras med bryggbildning såsom i exempel 5 ovan. De aminerade pärlorna aktiveras ytterligare genom behandling med en lösning av boratbuffert (50 ml, pH 9,0), etanol (10 ml) och kloracetaldehyddimetylacetal (1 ml). Till den klara lösningen sättes ytterligare 40 ml boratbuffert och suspensionen omröres över natten vid rumstemperatur. Gra- 0,05 M) i 25 minuter vid 70°C. De reaktioner som är aktuella nulatet hydrolyseras i HCl i vattenlösning (100 ml, framtill nu illustreras i bilagda figur 1.

Efter tvättning med stora volymer vatten kopplas kolsyreanhydras (CA) härrörande från bovina erytrocyter (Sigma) genom reduktiv aminering. Granulatet omröres i en vattenlösning (200 ml, pH 6,1) innehållande CA (128 mg) och NaBH3CN (40 mg) vid rumstemperatur i 24 timmar. Denna reaktion illustreras i bilagda figur 2.

Efter tvättning med vatten och torkning uppmättes kopplingsutbytet kolorimetriskt med avseende på det immobiliserade enzymets förmåga att hydrolysera p-nitro- fenylacetat. Kopplingsutbytet är 5 pg/cmz.

EXEMPEL 10 Karbodiimidkoppling av hyaluronsyra Polyetenfilm etsas såsom i exempel l och amineras såsom i exempel 5 och behandlas med en lösning av hya- 0,195 mg i 100 mL vatten). ning av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydro- luronsyra (Pharmacia, En lös- SÛÛ 964 10 15 20 25 30 35 8 klorid (EDC, Merck, 0,5 g i 1,0 mL vatten) tillsättes successivt under en halv timme. Efter justering av pH till 4,75 (0,1 M HCl) tillàtes reaktionen fortskrida över nat- ten. Filmerna sköljes noggrant med stora volymer ultrarent vatten och torkas. Kopplingsutbytet är 1,8 pg/cmz bestämmes med FTIR.

EXEMPEL ll Immobilisering av kolsyreanhydras (CA) genom karbodi- imidkoppling Polyetenpärlor (3 mm i diameter, 40 ml) etsas såsom i såsom exempel 1 och amineras såsom i exempel 5. Pärlorna suspen- deras i en vattenlösning av CA (100 ml, pH 5,5 justerad med M HCl). EDC (2 g i 5 mL vatten, sättes successivt till den omrörda suspensionen. se exempel 8) till- pH-värdet hålles vid 5,5 i 24 timmar vid rumstemperatur. Pärlorna tvättas med stora volymer NaCl (5 L) och analyseras sàsom i exempel 9. Kopplingsutbytet är 2 ug/cmz.

EXEMPEL 12 Karbodiimidkoppling av heparansulfat Polyeten etsas sàsom i exempel 1 ovan och behandlas med heparansulfat_(35 mg i 50 mL vatten). Kopplingsproce- duren utföres såsom beskrives i exempel 10 med den modi- fikationen, att 0,2 g EDC i 1,0 mL vatten användes i kopp- lingsproceduren. Kopplingsutbytet bestämmes semikvantita- tivt med toluidinblàtt, vilket ger en lila färg och kvan- ticativr med FTIR (1,6 pg/cmz).

Claims (13)

10 15 20 25 30 35 500 964 9 PATENTKRAV

1. Fast bärare, vars yta modifierats för införande av reaktiva grupper av hydrofil karaktär pà ytan, k ä n - n e t e c k n a d därav, att modifikationen àstadkommits med en primer innehållande en första polysackarid vilken som reaktiva grupper innehåller amino- och hydroxylgrup- per, och vilken stabiliserats genom bryggbildning under användning av en periodatoxiderad andra polysackarid som har vicinala hydroxylgrupper eller amino- och hydroxyl- grupper i vicinal position, varvid nämnda polysackarid underkastats periodatoxidation till bildning av minst ett par dialdehydfunktioner.

2. Fast bärare enligt patentkravet 1, vari nämnda första polysackarid är kitosan. vari kito- cirka 90%. 3, vari kito- cirka 50% och

3. Fast bärare enligt patentkravet 2, sanet har en grad av N-acylering av högst

4. Fast bärare enligt patentkravet sanet har en grad av N-acylering av högst företrädesvis mindre än cirka 25%.

5. Fast bärare enligt något av de föregående pa- tentkraven, vari nämnda andra polysackarid är utvald bland polysackarider, vars bionedbrytningsprodukter är ogiftiga, såsom D-glukosamin och D-glukos.

6. Fast bärare enligt patentkravet 5, vari nämnda andra polysackarid är utvald ur gruppen bestående av kito- san, amylos och glykosaminoglykaner.

7. Fast bärare enligt nàgot av de föregående patentkraven, vilken är av hydrofob karaktär.

8. Fast bärare enligt patentkravet 7, vilken är ut- vald ur gruppen bestående av polyolefiner, polyuretaner, polyvinylklorid, polystyren, silikon och polytetrafluor- etylen.

9. Fast bärare enligt patentkravet 8, vilken är ett polyolefin, såsom polyeten eller polypropen. 10. 7, vilken är utvald ur gruppen bestående av medicinskt acceptabla metaller och glas. Fast bärare enligt något av patentkraven 1 till 500 964 10 15 20 25 30 35

10

11. ll. Förfarande för framställning av en fast bärare, vars yta modifierats för införande av reaktiva grupper av hydrofil karaktär på ytan, varvid modifikationen åstadkom- mes med en primer innehållande en första polysackarid, vilken som reaktiva grupper innehåller amino- och hydro- xylgrupper och vilken stabiliserats genom bryggbildning under användning av en periodatoxiderad andra polysackarid som har vicinala hydroxylgrupper eller amino- och hydro- xylgrupper i vicinal position, varvid nämnda polysackarid underkastats periodatoxidation till bildning av minst ett par dialdehydfunktioner, k ä n n e t e c k n a t av föl- jande steg: a) åstadkommande av en bärare, vars yta skall modi- fieras; b) framställning av en lösning innehållande nämnda första polysackarid och innehållande även en andra poly- sackarid med vicinala hydroxylgrupper eller amino- och hydroxylgrupper i vicinal position, varvid nämnda andra polysackarid underkastats periodatoxidation till bildning av minst ett par dialdehydfunktioner, varigenom nämnda första polysackarid stabiliseras genom bryggbildning; c) överdragning av nämnda yta med den lösning som er- hàlles fràn steg b); och d) åstadkommande av utfällning av nämnda första poly- sackarid pà nämnda yta resulterande i modifikation av dess egenskaper.

12. Förfarande enligt patentkravet ll, vari nämnda första polysackarid är kitosan.

13. Förfarande enligt patentkravet ll eller 12, vari steg c) föregås av ett etsningssteg för att förbättra vidhäftningen av nämnda första polysackarid till nämnda yta.