KR19980034824A - 효소를 이용한 한외여과막 반응기에서 키토산 올리고당의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산 올리고당의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 키틴 또는 키토산을 효소로 가수분해시켜 키토산 올리고당을 제조하는 방법으로서, 다음의 단계: (a) 키토산을 산용액에 용해시켜 키토산 염 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a)에서 얻은 시료 용액에 키토산 분해효소를 첨가하여 키토산을 분해하여 키토산 올리고당을 얻는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)단계에서 얻어진 키토산 올리고당-함유 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시켜 키토산 올리고당을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 (b) 단계는 온도 30 - 50℃, 키토산 대 효소의 비율이 키토산 1% 용액 10 - 30ml 대 효소 1 단위의 범위내에 있고, 반응시간은 2.5 - 4시간의 범위내에 있는 조건에서 실시되고, 또한 상기 (c) 단계에서 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시키는 유출속도는 3-5ml/min임을 특징으로 한다.

이상과 같은 본 발명의 방법은 값비싼 키토산 분해효소의 효율적인 사용을 가능케 하여 경제적인 방법으로 키토산 올리고당을 생산할 수 있게 한다.

Description

효소를 이용한 한외여과막 반응기에서 키토산 올리고당의 제조방법

1. 발명이 속하는 기술분야

본 발명은 키토산 올리고당의 제조방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 효소를 이용한 한외여과막 반응기에서 키토산 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

2. 발명이 속하는 분야의 종래기술

키틴(Chitin)은 N-아세틸-D-글루코사민이 β-1,4 글리코시드 결합한 고분자 다당류로서, 게나 새우 등의 갑각류, 곤충의 외골격, 버섯이나 균류의 세포벽 성분으로 존재하고 있으며, 년간 생산량은 셀룰로오스와 거의 유사한 100억톤에 이르고 있다(島原健三, 最後のバイオマス キチン キチン キトサン キチン キトサン 硏究會編, p. 1, 1990). 키토산(Chitosan)은 키틴을 탈아세틸화하여 제조할 수 있으며, 각 단위 구조마다 아미노기를 가지고 있기 때문에 약한 산에 쉽게 녹는다.

최근 키틴·키토산(J. Iida 등,Vaccine,5, 270, 1987; K. Nishimura 등,J. Biomed. Mat. Res.,20, 1359, 1986; K. Nishimura 등,Vaccine,3, 379, 1985;

K. Nishimura 등,Vaccine,2, 93, 1984; 內田 泰, キチン キトサンの應用, キチン キトサン硏究會編 p. 71, 1990; D. F., Kendra와 L. A. Hadwiger,Exp. Mycol.,8, 276, 1984; C. R. Allan과 L. A. Hadwiger,Exp. Mycology,3, 285, 1979) 및 그 유도체들(I. Saiki 등,Cancer Res.,50, 3631, 1990; J. Murata, 등,Jpn. J. Cancer Res.,80, 866, 1989)의 생리기능성이 밝혀진 이후로 이에 관한 연구와 많은 관심이 고조되고 있다. 그러나 키틴·키토산은 고분자의 상태로 물에 녹지 않아 체내에서의 효과에 제약을 받고 있다. 하지만 키틴·키토산을 염산으로 가수분해하여 얻어진 그 올리고당 중 비교적 고차 올리고당인 중합도 6∼7인 N-아세틸 키토올리고당(N-acetyl chitooligosaccharide; NACOS) 및 키토올리고당(COS)에는 높은 항종양활성이 보고(K. Tsukada 등,Jpn. J. Cancer Res.,81, 259, 1990; A. Tokoro 등,Microbiol. Immunol.,33, 357, 1989; A. Tokoro 등,Chem. Pharm. Bull.,36, 784, 1988; K. Suzuki 등,Carbohydr. Res.151, 403, 1986)되고 있어 이를 효율적으로 대량 생산하고자 하는 연구가 현재 진행되고 있으나, 이에 대한 효율적 방법이 아직 확립되어 있지 않은 상태이다.

본 발명자는 생체 안전성과 환경오염 측면에서 문제가 될 수 있는 화학적 처리방법 대신 생물학적 방법인 효소를 사용하여 키토산 올리고당을 제조하는 방법을 검토하였다. 또한 키토산 분해효소인 시판 정제 키토사나아제(chitosanase)가 고가인 점을 고려하여 이를 재사용할 수 있는 방안을 모색한 결과, 한외여과막 반응기(ultrafiltration membrane reactor)를 키토산 올리고당의 제조에 도입시켜 이를 이용한 대량 생산을 가능케 하고자 광범위한 연구를 행하였다.

즉, 본 발명의 목적은 키토산으로부터 키토산 올리고당을 제조하는 보다 효율적이고 경제적인 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 효소를 이용한 한외여고막 반응기에서의 키토산 올리고당의 제조공정도이다.

도 2와 도 3은 각각 37℃ 및 45℃ 회분식 반응에서 키토산의 가수분해도에 미치는 효소 첨가량의 영향을 보여주는 그래프이다.

도 4 및 도 5는 각각 효소에 의한 한외여과막 반응기에서 키토산의 가수분해도에 미치는 온도 및 유출속도의 영향을 보여주는 그래프이다.

도 6은 한외여과막 반응기에서 효소에 의하여 생성된 키토산 올리고당의 HPLC 패턴이다.

도 7은 한외여과막 반응기에서의 유출속도에 따라 생성된 키토산 올리고당 조성의 함량을 보여주는 그래프이다.

도 8은 한외여과막 반응기에서의 효소에 의한 키토산의 가수분해에 있어서, 사용 횟수에 따른 효소의 안정성을 보여주는 그래프이다.

상기한 본 발명의 목적은 키토산을 효소로 가수분해시켜 키토산 올리고당을 제조하는 방법에 있어서, 다음의 단계:

(a) 키토산을 산용액에 용해시켜 키토산 염 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 (a)에서 얻은 시료 용액에 키토산 분해효소를 첨가하여 키토산을 분해하여 키토산 올리고당을 얻는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)단계에서 얻어진 키토산 올리고당-함유 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시켜 키토산 올리고당을 분리하는 단계

를 포함하고,

상기 (b) 단계는 온도 30 - 50℃, 키토산 대 효소의 비율이 키토산 1% 용액 10 - 30ml 대 효소 1 단위의 범위내에 있고, 반응시간은 2.5 - 4시간의 범위내에 있는 조건에서 실시되고, 또한 상기 (c) 단계에서 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시키는 유출속도는 3-5ml/min임을 특징으로 하는 제조방법에 의해 달성된다.

본 발명의 상기한 목적, 그리고 그외 다른 목적과 특징들은 하기 발명의 상세한 설명란으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 최근 여러 가지의 유용한 생리적 기능이 밝혀지고 있는 키토산 올리고당을 생물학적인 방법으로 효율 좋게 생산하는 방법을 제공하며, 특히 한외여과막 반응기를 이용하므로써 값비싼 효소의 재활용을 가능케 한다.

본 발명의 방법에 의하면, 비교적 고차 올리고당으로서 생리적 활성이 강한 중합도가 3 내지 6인 키토산 올리고당 ((COS)-3 내지 (COS)-6)을 얻을 수 있다.

본 발명에서는 키토산을 효소로 가수분해시켜 키토산 올리고당을 제조하는 방법에 있어서, 우선 키토산을 산용액에 용해시켜 키토산 염 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 이때 산 용액으로는 젖산 용액을 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이때 사용되는 젖산 용액에만 국한되는 것은 아니다.

이어 상기에서 얻은 시료 용액에 키토산 분해효소를 첨가하여 키토산을 분해하여 키토산 올리고당을 얻는다. 이때 분해효소로는 예를 들면 키토사나제가 사용되며, 반응은 온도 30 - 50℃, 키토산 대 효소의 비율이 키토산 1% 용액 10 - 30ml 대 효소 1 단위의 범위내에 있고, 반응시간은 2.5 - 4시간의 범위내에 있는 조건에서 실시한다. 특히, 온도 온도 37-45℃, 키토산 대 효소의 비율이 키토산 1% 용액 약 20ml 대 효소 1 단위의 범위내에 있고, 반응시간은 2.5 - 3시간의 범위내에서 선정된다.

이어 상기 단계 에서 얻어진 키토산 올리고당-함유 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시켜 키토산 올리고당을 분리한다. 이때 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시키는 유출속도는 3-5ml/min의 범위 내, 바람직하게는 약 4ml/min이다.

이하 본 발명에서 사용된 각종 재료물질, 실험 방법 등을 설명한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료 및 장치

키토산은 탈아세틸화도가 89%, 점도 20cps인 것으로 사용하였으며, 키토사나아제 (Bacillus pumilusBN-262)와 정제 키토산 올리고당(chitobiose dihydrochloride, chitotriose trihydrochloride, chitotetraose tetrahydrochloride, chitopentaose pentahydrochloride, chitohexaose hexahydrochloride 및 chitoheptaose heptahydrochloride)은 일본 Wako Pure Chemical Industries, LTD.에서, 그리고 D-글루코사민 염산염은 Sigma Chemical Co.에서 각각 구입하였다. 그외 사용된 모든 시약은 분석용 특급을 사용하였다.

한외여과막 반응기에서 효소를 이용한 키토산 올리고당의 제조를 위한 시스템은 도 1과 같이 설계되었으며, 사용된 한외여과막과 펌프는 Millipore Co.로부터 구입하였다. 한외여과막의 한계 분자량은 3,000 - 5,000의 범위내에 있다.

2. 방 법

2-1. 키토산 유산염 용액의 제조

키토산 150g을 초순수 1L에 분산시키고 1M 유산용액 400ml를 첨가하여 키토산을 녹인 후, 초순수로 전체 부피가 15L 되도록 첨가하여 1% 키토산 용액을 제조하였다. 이때 1% 키토산 유산염 용액의 pH는 5.5였으며, 용액 중에 완전히 녹지 않고 남아 있는 키토산은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 그 여과액을 실험에 사용하였다.

2-2. 키토산 올리고당의 조성 분석

키토산의 효소적 가수분해에 의해 생성된 올리고당의 조성 분석은 TSKgel NH₂-60 역상 컬럼(4.6×250mm, TOSOH Manufacuring Co., Ltd.)의 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC, Spectra Physics P2000)로 분석하였다. 즉, 가수분해액 1ml와 아세토니트릴 1ml를 혼합하여 그 중 20㎕를 컬럼에 주입하고 60% 아세토니트릴로 유출속도를 분당 0.8ml로 조절하여 용리시켰다. 키토산 올리고당의 피크는 굴절률 검출기(refractive index detector)로 검출하였다.

2-3. 회분식에서 키토산의 효소적 가수분해

1% 키토산 젖산염 용액 1ml에 키토사나아제를 0.05unit, 0.1unit, 0.15unit 및 0.2unit 되도록 첨가하여 반응온도를 37℃ 및 45℃로 조절된 항온수조에서 일정 시간(10, 20, 40, 60, 90, 120, 180 및 240분) 가수분해하였다. 반응 종료 후, 효소 불활성화를 위하여 반응물을 100℃에서 10분간 가열하였다. 가수분해도는 반응종료 후 유리된 D-글루코사민의 함량으로 표시하였으며, 유리 D-글루코사민의 정량은 Blix의 방법(G. Blix,Acta Chem. Scand.,2, 467, 1948)에 따라 수행하였다.

2-4. 한외여과막 반응기에서 효소에 의한 키토산의 가수분해

(1) 효소에 의한 키토산의 가수분해에 미치는 온도 효과

1% 키토산 용액 500ml를 반응기에 넣고 반응온도를 각각 37℃ 및 45℃로 조절한 후 효소를 25unit(기질/효소 = 20ml/unit)되도록 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 반응 3시간 후, 유출속도를 분당 2ml로 하여 MWCO 3,000(molecular weight cut off 3,000 - 5,000 dalton)의 한외여과막을 통과하여 나온 키토산 가수분해액을 시간경과(0, 10, 20, 40, 60, 90, 120 및 180min)에 따라 2ml씩 분취하여 유리된 D-글루코사민을 정량하여 가수분해도를 측정하였다.

(2) 효소에 의한 키토산의 가수분해에 미치는 유출속도의 영향

1% 키토산 용액 500ml를 반응기에 넣고 반응온도를 45℃로 조절한 후 효소를 25unit되도록 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 반응시간이 3시간 경과한 후, 한외여과막 반응기의 유출속도를 0.5ml/min에서 5ml/min로 각각 조절하여 키토산 가수분해액 500ml 중 약 300ml를 막을 통과시켜 모은 후 그 가수분해액으로부터 2ml 취하여 유리된 D-글루코사민을 정량하여 가수분해도를 측정하였다.

(3) 한외여과막 반응기에서 효소에 의한 키토산의 가수분해시 그 효소의 안정성

1% 키토산 용액 500ml를 반응기에 넣고 반응온도를 45℃로 조절한 후 효소를 25unit되도록 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 반응시간이 3시간 경과한 후, 한외여과막 반응기의 유출속도를 4ml/min로 조절하여 키토산 가수분해액 500ml 중 약 300ml를 막을 통하여 유출시킨 후, 새로운 기질 300ml를 첨가하여 위와 같은 방법으로 3시간 반응 후 300ml를 유출시켰다. 이러한 조작을 11회 반복하여 각각 얻어진 키토산 가수분해액으로부터 유리된 D-글루코사민을 정량하여 그 가수분해도를 측정하여 효소의 안정성을 검토하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 회분식에서 키토산의 효소적 가수분해

회분식 반응에서 반응온도를 37℃ 및 45℃로 각각 조절하여 1% 키토산 용액 1ml에 대하여 키토사나아제를 각각 0.05, 0.1, 0.15, 0.2unit 첨가하였을 때 키토산의 효소적 가수분해의 결과는 먼저 37℃반응(도 2)에서 키토사나아제를 0.1∼0.2unit 첨가하였을 때, 반응시간 90분까지 급격한 분해를 보였으나, 그 이후 240분까지 시간이 경과하여도 더 이상 분해되지 않았다. 키토사나아제의 0.05unit 첨가에서는 반응시간이 60분 경과할 때까지 키토산의 분해가 급격하게 증가하였으며 그후 180분까지도 완만한 증가를 보였다. 키토산의 분해는 효소 첨가량이 많을 수록 높았으며, 0.05unit 첨가에서는 0.2unit보다 약 22% 낮았다. 45℃반응(도 3)에서는 모든 효소 첨가량에서 반응시간 60분까지 급격한 증가를 보였으며, 반응시간이 240분 경과하여도 완만한 증가를 보였다. 0.1∼0.2unit 의 효소 첨가에서의 유리 글루코사민 함량은 약 1,900㎍/ml이었으나 0.05unit 첨가에서는 그 함량이 1,700㎍/ml로서 약 10% 낮았다. 따라서 이러한 키토산 분해의 차이는 키토사나아제의 가격이 매우 고가인 점을 고려해 볼 때, 1%의 키토산 용액에 대한 키토사나아제의 첨가량은 0.05unit를 사용하여도 가능할 것으로 판단된다. 또한 효소를 0.05unit 첨가하였을 때의 반응온도에 따른 효소의 활성은 37℃에서 1,400㎍/ml인데 비하여 45℃에서는 약 1,700㎍/ml으로서 약 21% 정도 증가하였다.

2. 한외여과막 반응기에서 키토산의 효소적 가수분해

한외여과막 반응기에서 효소적 가수분해에 의한 키토산 올리고당의 생산에서는 회분식 반응에서 선정된 조건에서 반응액의 유출없이 180분간 가수분해시키고, 그 이후 한외여과막으로 생성되어져 나오는 가수분해 용액으로부터 시간의 경과에 따른 키토산의 분해도를 유리 글루코사민 함량을 측정하여 나타내었다. 반응온도(37℃와 45℃)에 대한 키토산의 분해를 검토한 결과(도 4), 두 온도조건에서 반응시간 120분이 경과할 때까지 키토산의 분해는 완만한 속도로 계속적인 증가를 보였으나 그 이후 오히려 급격하게 증가하였다. 이러한 결과는 일정한 시간이 경과함에 따라 일정량의 키토산 분해액이 막을 통하여 빠져 나가기 때문에 기질에 대한 효소의 첨가량이 상대적으로 높아지기 때문인 것으로 생각된다. 두 온도간의 분해도는 반응온도 45℃가 37℃보다 유리 글루코사민 함량이 약 400㎍/ml 많은 1,800㎍/ml로서 약 28% 증가하였다. 따라서 한외여과막 반응에서는 회분식 반응과 같은 경향을 보였으나 키토산의 분해도는 약 7% 높게 나타났다.

한외여과막 반응기의 유출속도에 따른 키토산의 가수분해에서 유출속도가 높을 수록 가수분해도는 비례적으로 증가하였다. 유출속도를 3ml/min까지는 급격하게 증가하였으나, 그 이후 4∼5ml/min으로 조절하여도 완만한 증가만을 보였다(도 5). 따라서 유출속도를 3∼5ml/min으로 조절하였을 때의 가수분해도는 거의 유사하였으며, 이때 생성된 키토산 올리고당의 조성을 TSKgel NH₂-60 역상컬럼의 HPLC로 분석하였다(Fig. 6). 한외여과막을 이용하여 효소적 가수분해로 생성된 키토산 올리고당은 대부분의 키토올리고당(chitooligosaccharide; COS)이 이량체인 (COS)-2에서 오량체인 (COS)-5까지 얻어졌다. 유출속도를 3ml/min 및 5ml/min으로 조절하였을 때는 (COS)-4가 각각 35% 및 33%로 가장 높게 함유되어 있었으며, 4ml/min으로 조절한 유출속도에서는 (COS)-5가 35%로 가장 높은 비율로 함유되어 있었다. 특히 4ml/min의 유출속도에서는 다른 유출속도에 비하여 고차 올리고당인 육량체 (COS)-6가 약 15% 함유되어 있었다(도 7).

최근의 키토산 올리고당의 생리기능에 대한 연구에서 저분자 올리고당보다는 고차 올리고당이 높은 항종양활성 및 항균활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(K. Tsukada 등,Jpn. J. Cancer Res.,81, 259, 1990; A. Tokoro 등,Microbiol. Immunol.,33, 357, 1989; A. Tokoro 등,Chem. Pharm. Bull.,36, 784, 1988; K. Suzuki 등,Carbohydr. Res.151, 403, 1986). 특히 α-D-글루코사민이 6개 글리코시드 결합된 (COS)-6이 가장 높은 활성을 보이고 있어 이러한 올리고당이 많은 주목을 받고 있다.

따라서 한외여과막에서 키토산 올리고당의 생산을 위한 조건 중 최적 유출속도는 (COS)-3에서 (COS)-6까지 비교적 고차 올리고당의 함량이 높은 4ml/min가 가장 적합한 것으로 나타났다.

한외여과막 반응기에서 효소적 가수분해에 의한 키토산 올리고당의 생성 중 사용된 효소의 안정성에서 새로운 기질 첨가(1% 키토산 용액 300ml)를 11회까지 수행하였을 경우, 5회 첨가 이후부터 활성은 다소 감소하였으나 그 감소율은 매우 완만하였다(도 8). 이러한 결과는 한외여과막 내에서 작용하는 효소가 물리적인 요소에 의하여 일어날 수 있는 효소 자체의 손상이 크지 않았으며, 효소의 열안정성도 매우 높은 것으로 사료되었다. 따라서 한외여과막 반응기 시스템에서 효소 사용량이 25unit일 때 1% 키토산 용액 약 4L를 키토산 올리고당으로 생산하여도 그 효소의 활성의 감소는 매우 적기 때문에 그 이상의 키토산 올리고당도 제조가 가능할 것으로 판단된다.

이상의 결과를 요약하면 다음과 같다:

1. 37℃ 및 45℃로 각각 조절된 회분식 반응에서 1% 키토산 황산염 용액 1ml를 분해시키는데 소요되는 효소량은 0.2unit일 때 가장 높은 분해율을 보였으나, 45℃에서 240분동안 가수분해시켰을 때 0.05unit는 0.2unit보다 약 10% 정도 낮았다. 따라서 고가의 키토사나아제를 사용하는 점을 고려해 볼 때, 1% 키토산 용액 1ml당 0.05unit의 효소를 첨가하는 것이 상대적으로 높은 경제적 효과를 얻을 수 있으리라 판단되었다.

2. 한외여과막 반응기에서 키토산의 효소적 가수분해에 대한 반응온도 조건설정에서는 회분식에서와 마찬가지로 45℃에서 약 28% 높게 나타났다. 두 온도조건에서 시간이 경과할 수록 증가율은 좀 더 크게 나타났다.

3. 한외여과막 반응기에서 유출속도에 대한 키토산의 가수분해는 유출속도 3ml/min∼5ml/min에서 서로 비슷한 분해율을 보였다. 이중 키토산 올리고당의 조성은 4ml/min일 때 고차 올리고당인 (COS)-3에서 (COS)-6의 함량이 가장 높게 나타났다.

4. 한외여과막 반응기에서 효소에 의한 키토산 올리고당의 연속적 생산에서 사용된 키토사나아제가 막반응기에서의 효소 안정성에 대하여 검토한 결과, 새로운 기질을 11회 첨가할 때까지도 효소의 활성저하는 두드러지게 나타나지 않았다. 따라서 이러한 한외여과막 반응기 내에서의 효소 안정성은 매우 높았다.

이상의 연구결과에서, 효소를 이용한 한외여과막 반응기에서 키토산 올리고당의 제조를 위한 최적조건은 1% 키토산 유산염 용액 500ml에 키토사나아제 25unit(기질/효소 = 20ml/unit)를 첨가하여 3시간동안 반응시킨 후 4ml/min의 유출속도로 한외여과막을 통하여 생산되는 키토산 올리고당은 비교적 고차 올리고당인 (COS)-3에서 (COS)-6이 약 95% 함유되어 있었다. 한외여과막 반응기에서 25unit의 키토사나아제로 약 4L 정도의 키토산 용액을 처리하여도 그 효소의 안정성은 계속 유지하였으므로, 결국 이러한 반응 시스템에서 키토산 올리고당의 제조 능력은 1% 키토산 용액 4L 이상이 될 수 있을 것으로 판단된다.

상기한 바와 같은 본 발명의 방법은 보다 경제적이고 효율적으로, 생리적 활성이 우수한 고차 키토산 올리고당을 다량 생산할 수 있게 하는 특징이 있고, 따라서 키토산 올리고당의 대량 생산에 적합하다.

Claims (4)

1. 키토산을 효소로 가수분해시켜 키토산 올리고당을 제조하는 방법에 있어서, 다음의 단계:

   (a) 키토산을 산용액에 용해시켜 키토산 염 용액을 제조하는 단계;

   (b) 상기 (a)에서 얻은 시료 용액에 키토산 분해효소를 첨가하여 키토산을 분해하여 키토산 올리고당을 얻는 단계; 및

   (c) 상기 단계 (b)단계에서 얻어진 키토산 올리고당-함유 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시켜 키토산 올리고당을 분리하는 단계

   를 포함하고,

   상기 (b) 단계는 온도 30 - 50℃, 키토산 대 효소의 비율이 키토산 1% 용액 10 - 30ml 대 효소 1 단위의 범위내에 있고, 반응시간은 2.5 - 4시간의 범위내에 있는 조건에서 실시되고, 또한 상기 (c) 단계에서 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시키는 유출속도는 3-5ml/min임을 특징으로 하는 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 온도 37-45℃, 키토산 대 효소의 비율이 키토산 1% 용액 약 20ml 대 효소 1 단위의 범위내에 있고, 반응시간은 2.5 - 3시간의 범위내에 있는 조건에서 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 반응 혼합물을 한외여과막에 통과시키는 유출속도는 약 4ml/min임을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 사용되는 산용액은 젖산 용액임을 특징으로 하는 제조방법.