JPH04173091A - Ｎ―メチレンキトサンゲルの製造方法および酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は酵素の固定化用担体を得るために用いられるＮ
−メチレンキトサンゲルの製造方法および各種酵素をこ
のＮ−メチレンキトサンゲルに固定化する方法に関する
。

［従来の技術］ 固定化酵素は臨床分析、環境汚染物質の分解除去等への
応用が可能であるため、発酵、化学、食品工学等の分野
のみならず、様々な産業分野から注目されている。

酵素の固定化に用いる担体は、物理的、化学的、生化学
的に安定であることが必須条件となる。担体の化学構造
は酵素の固定化に必要な官能基が豊富であるか、あるい
は官能基を導入することができるものでなければならな
い。とくにイオン結合法によって酵素を固定化する場合
には極性の高い官能基を有していることが必要である。

また、−般に酵素は水溶液中で用いられることが多いの
で担体は親水性に富んだものであることが望ましい。

固定化用担体としてはセルロース、デキストランなどの
多糖類の誘導体、あるいはポリアクリロアミドゲルなど
の合成高分子が用いられているが合成高分子系ゲルより
も多糖類系ゲルのほうが生体適合性や親水性が高いとい
う点で有利である。

ところで、これまで提案されている多糖類由来の担体は
、原料となる多糖類自体は分子内に反応性あるいは極性
の高い官能基をもたない。このた約そのままでは酵素固
定化に適さないので新たに官能基を導入する必要がある
が、その操作は複雑であるた約担体の価格が高価になる
。そのため最近では、生体由来の高分子材料であるキト
サンをゲル化して固定化酵素用担体として用いることが
検討されている。キトサンゲルを製造する方法としては
、第一にキトサンを希有機酸に溶解後、水酸化す）　Ｉ
Ｊウム等の塩基性溶液中に滴下して凝固させる方法、第
二に、第一の方法で得られたゲルをさらにアシル化する
方法が知られている（特公昭５９−３０１６３号公報、
同６３−５４２８７号公報）。

また、キトサンゲルに酵素を固定化する方法としては、
グルタルアルデヒド等の架橋試薬を用いて酵素と担体と
を共有結合させて固定化する方法が知られている。

［発胡が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の方法で得られたキトサンゲルは機
械的強度が小さいだけでなく、第一の方法では成形後に
架橋処理を施す場合キトサンの分子内のアミン基が水酸
基より優先して架橋試薬と反応してしまうので、架橋後
は反応性の高いアミノ基を酵素固定化のだ袷の官能基と
して使用することができないという問題点がある。また
、第二の方法はその製造過程が２段階からなり、操作が
繁雑であるという問題点がある。

さらに、従来の固定化方法は固定化時に架橋試薬によっ
て酵素が化学修飾を受けるために酵素の活性が低下する
。また、−度担体に固定化された酵素は失活しても担体
から脱離させることができないため、新たに酵素を固定
化することができず、担体の再生が不可能であるという
問題点があった。

本発明の目的は上記の問題点を解決した、機械的強度が
大きく、また酵素の固定化に有用な官能基を有し、酵素
固定化用担体材料として有用なＮ−メチレンキトサンゲ
ルの容易な製造方法および、そのＮ−メチレンキトサン
ゲルを用いて化学的に安定で、かつ、再生可能な固定化
酵素を得るための酵素の固定化方法を提供することにあ
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、上記の目的を達成するためになされたもので
あって、その要旨は希有機酸に溶解したキトサンをアル
カリ性のホルムアルデヒド水溶液中に滴下し、脱溶媒と
キトサンのアミノ基におけるシップ塩基形成とを同時に
行うことを特徴とするＮ−メチレンキトサンゲルの製造
方法および、このＮ−メチレンキトサンゲルにイオン結
合法により酵素を固定化する方法にある。

以下、本発明の詳細な説明する。

キトサンのゲル化は、アルカリ性のホルムアルデヒド水
溶液を凝固液とし、これにキトサンの希有機酸溶液を滴
下して凝固させるという方法により行われる。

本発明において用いられるキトサンとは、凝固液中で脱
溶媒とアミノ基におけるシッフ塩基形成とを同時に行う
ことが可能であるものであればとくに限定されるもので
なく、キトサンあるいはキチンの脱Ｎ−アセチル化物の
脱Ｎ−アセチル化度が、５０％〜１００％のものを例示
することができる。キトサンあるいはその誘導体群の希
有機酸中の重量％は１．５〜１５％の範囲にあることが
望ましい。１．５％未満である場合、この溶液を用いて
得られたゲルの機械的強度が小さくなるおそれがある。

一方、１５％を越える場合、キトサンが完全に溶解しな
いだけでなく、得られた溶液の粘度が非常に高くなるの
で、操作性が悪くなる。

また、有機酸は上記キトサンあるいはその誘導体群を溶
解できる物であれば特に限定されず、たとえば、蟻酸、
酢酸などの脂肪族カルボン酸、安息香酸、フェニル酢酸
などの芳香族カルボン酸などを挙げることができる。用
いる有機酸の量は、キトサンの希有機酸溶液の１〜１０
重量％であることが望ましい。有機酸の量が多い場合、
キトサンの脱溶媒の速度が遅くなり、ゲル化が速やかに
進行しないことがある。

凝固液に用いるアルカリは、ホルムアルデヒドと反応す
るもの以外であれば特に限定されるものではなく、水酸
化ナトリウム、水酸化カリウムなどを例示することがで
きる。その量は凝固液の２〜１０重量％であることが望
ましい。また、ホルムアルデヒドの量は凝固液の１０〜
３０重量％であることが望ましい。

ゲル化の際の温度は用いるキトサンの希有機酸溶液およ
び凝固液の沸点以下、凝固点以上であれば特に限定はさ
れないが凝固液中のホルムアルデヒドの蒸発を抑えるた
めには、上記の条件を満たす範囲内でできる限り低温で
行うことが望ましい。

また、その時間はアルカリとホルムアルデヒドの割合に
もよるが、通常１０分以上である。１０分未満であると
ゲル化が十分に進行せず、得られたゲルの機械的強度が
低くなることがある。

さらにゲル化後、架橋処理を施すことにより、ゲルを耐
酸性とすることができる。架橋試薬は、キトサン分子内
のアミノ基あるいは水酸基と反応して架橋構造を形成す
るものであれば特に限定されるものではなく、エピクロ
ロヒドリン、ヘキサメチレンジイソシアネートなどを例
示することができる。その量は用いるキトサンのモル数
の１〜５０倍であることが望ましい。また、その時間は
架橋試薬にもよるが、通常１０〜６０分である。

６０分以上であると架橋度が大きくなって固定化に供す
ることのできる官能基数が減少するばかりでなく、ゲル
の柔軟性がなくなり、機械的強度が低くなることがある
。

このようにして得られたＮ−メチレンキトサンゲルに酵
素を固定化するには、０．０１〜０．１Ｍの酢酸ナトリ
ウム、酢酸カリウム、あるいは、リン酸カリウム等の緩
衝溶液に所定量の酵素を溶かした後、Ｎ−メチレンキト
サンゲルを分散させ３０分以上放置する。その後、同緩
衝溶液で十分に洗浄することにより固定化が完了する。

本発明における固定化用酵素としては、例えばアミノア
シラーゼ、インベルターゼ、カタラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ
、グルコースイソメラーゼ、トリプトファンシンターゼ
、ラクトースデヒドロゲナーゼ等を挙げることができる
。

［実施例］ 本発明をさらに詳細に説明するために以下に実施例を述
べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。な
お、酵素活性は国際単位を用いて、１分間で１μｍｏｌ
の基質を変換する酵素活性の量を１ユニツト（以後Ｕと
略する）とした。

実施例Ｉ Ｎ−メチレンキトサンゲルの量 ３ｇのキトサンを２００ｍ１の水に分散させた後、２ｍ
ｌの酢酸を加えて溶解させキトサンの希有機酸溶液とし
た。また、７ｇの水酸化ナトリウムを１５０ｍ１の水に
溶解し、３５％ホルムアルデヒド水溶液１．５０ｍ１を
加えて凝固液とした。

次いで前記キトサンの希有機酸溶液を凝固液中に滴下す
ることによって無色透明のゲルが生成した。

このようにして本発明のＮ−メチレンキトサンゲルが得
られた。このゲルをエビクロロヒドリン４０ｍ１、水酸
化ナトリウム５ｇおよび水２６０ｍ１を混合した溶液中
で６０°Ｃで１時間架橋した。

架橋を施したゲルは１Ｍ酢酸水溶液中で１週間静置して
も膨潤しなかった。

遵ｍ化 得られたＮ−メチレンキトサンゲル５ｇを０゜０５Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液１０ｍ１に分散させ、酵素活性５０
０Ｕ／ｍｇのラクテートデヒドロゲナーゼ（以後ＬＤＨ
と略す。）０．３ｒｎｌを加えて、５°Ｃで４時間振と
うした後、同緩衝液で十分に洗浄して固定化ＬＤＨを得
た。このとき異なったｐＨで固定化を行ったところ、ｐ
Ｈ５，０で固定化したＬＤＨが最大の活性を示した。

実施例２ 実施例１に従ってｐＨ５，０で固定化した固定化ＬＤＨ
を異なったｐＨで反応させ、その酵素活性を遊離ＬＤＨ
および市販のキトサンビーズであるキトパールＢＣＬ２
６１０　（商品名、富士紡績■製）に同様の方法で固定
化した固定化ＬＤＨと比較し、第１図の結果を得た。第
１図中、Ａは本発明のＮ−メチレンキトサンゲルに固定
化したＬＤＨ，Ｂは市販キトサンビーズであるキトバー
ルＢＣＬ２６１０に固定化したＬＤＨ，Ｃは遊離のＬＤ
Ｈの相対活性を示す。遊離ＬＤＨの活性はｐＨ６，０に
おいて最大値を与えｐＨ変化の影響を大きく受けたが、
固定化ＬＤＨの活性はｐＨ８，０において最大値を与え
、ｐＨ変化に対して非常に安定であった。

特に、本発明のＮ−メチレンキトサンゲルに固定化した
ＬＤＨはキトバールに固定化したものに比べてｐＨ変化
に対する安定性がより高かった。

実施例３ 実施例１と同様の方法で得られたＮ−メチレンキトサン
ゲル３ｇを０．０１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝溶液１０
ｍ】に分散させ、酵素活性２０００／ｍｇのグルコース
オキシダーゼ（以後ＣＯＤと略す。）１．０ｍｌを加え
て５°Ｃで２時間振とうした後、同緩衝液で十分に洗浄
して固定化ＣＯＤを得た。このとき異なったｐＨで固定
化を行ったところ、酸性領域では固定化時のｐＨは固定
化ＣＯＤの活性にほとんど影響を及ぼさなかった。

実施例４ 実施例３に従ってｐＨ４，５で固定化した固定化ＣＯＤ
を異なったｐＨで反応させ、その酵素活性を遊離ＣＯＤ
および市販のキトサンビーズであるキトパーツ叶ＣＷ−
２６１０（商品名、富士紡績■製）に同様の方法で固定
化した固定化ＣＯＤと比較し、第２図の結果を得た。第
２図中、Ａは本発明のＮ−メチレンキトサンゲルに固定
化したＣＯＤ、Ｂは市販キトサンビーズであるキトパー
ツ叶ＣＬ２６］、０に固定化したＣＯＤ、Ｃは遊離のＣ
ＯＤの相対活性を示す。遊離ＣＯＤの活性はｐＨ６，５
において最大値を与えｐＨ変化の影響を大きく受けたが
、固定化ＣＯＤの活性はｐＨ４，５において最大値を与
え、ｐＨ変化に対して安定であった。特に、本発明のＮ
−メチレンキトサンゲルに固定化したＣＯＤはキトパー
ルに固定化したものに比べてｐＨ変化に対する安定性が
より高かった。

実施例５ 実施例３に従ってｐＨ４，５で固定化した固定化ＣＯＤ
を１日に１回、ｐＨ４，５で１０分間反応させて活性を
測定した後、濾別回収し、反復使用したときの活性の変
化を測定し、第３図の結果を得た。固定化ＣＯＤの活性
は使用回数が増加するに伴って徐々に低下したが、固定
化後３０日を経過した時点でも初期値の８０％以上を維
持していた。３０日１に再びこのゲルに最初と同じ条件
でＣＯＤを固定化し、同様の測定をおこなったところ初
期値を上回る高活性を示し、さらに繰り返し使用するこ
とが可能であった。

実施例６ 実施例３に従ってｐＨ４，５でＣＯＤを固定化した。こ
のとき固定化時間を変えて固定化ＣＯＤの活性を測定し
活性収率を算出して、第４図の結果を得た。ＣＯＤはほ
ぼ１時間で飽和量まで固定化することができた。なお、
活性収率は固定化に用いた遊離ＣＯＤの酵素活性（Ｕ）
に対する固定化ＣＯＤの酵素活性（Ｕ）の割合で示され
る。

実施例７ 実施例３に従ってｐＨ４，５でＣＯＤを固定化してその
活性を測定した後、ゲルを９０°Ｃで、２Ｍ水酸化ナト
リウム水溶液３０ｍ１中で１時間洗浄してＣＯＤを完全
に脱離、失活させた。このゲルに再び同様の条件でＣＯ
Ｄを固定化して酵素活性を測定し結果を第１表に示した
。上記の操作を５回繰り返した場合でもゲルの酵素固定
化能に変化は見られなかった。

第１表 実施例８ 同じ条件でＣＯＤ溶液に分散させた本発明のＮ−メチレ
ンキトサンゲルを２種類用意し、一方は実施例３にした
がって２時間振とうし、もう一方は］時間振とうした後
２ｍｌの２５％グルタルアルデヒド水溶液を加えてさら
に１時間振とうし、それぞれ緩衝溶液で十分に洗浄した
後、得られた固定化ＣＯＤの酵素活性を測定し結果を第
２表に示した。本発明の方法で固定化したＣＯＤはグル
タルアルデヒド法で固定化したものに比べて活性が高か
った。

第２表 ［発明の効果］ 本発明の方法により得られたＮ−メチレンキトサンゲル
は、生体適合性および親水性が高く、酵素の固定化に有
用な官能基を有しており、かつ定量性や操作性に富んだ
形状の固定化酵素用担体を得るた約の材料となり得る。

このゲルには、種々の酵素を簡便なイオン結合法で強固
に固定化することが可能で、固定化した酵素に高い安定
性及び耐久件を付与することができる。また、この方法
で酵素を結合すると、−度胆体に固定化された酵素が失
活した場合も、新たな酵素を固定化し再生して使用する
ことが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は酵素のｐ）（による活性の変化を
示した図である。第３図は、固定化酵素の反復使用時の
活性の変化を示した図である。第４図は、酵素の固定化
時の振とう時間と酵素の活性収率との関係を示した図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、希有機酸に溶解したキトサンをアルカリ性のホルム
   アルデヒド水溶液中に滴下し、脱溶媒とキトサンのアミ
   ノ基におけるシッフ塩基形成とを同時に行うことを特徴
   とするＮ−メチレンキトサンゲルの製造方法。 ２、請求項１記載のＮ−メチレンキトサンゲルにイオン
   結合法により酵素を固定化することを特徴とする酵素の
   固定化方法。