CN109536480A - 一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，采用壳聚糖、罗望子胶－戊二醛交联吸附的方法，将褐藻胶裂解酶固定于介质之上，它包括壳聚糖载体的精制、交联试剂的配制、壳聚糖、罗望子胶－戊二醛的交联、褐藻胶裂解酶的提取及固定等步骤。本发明所制备的褐藻胶裂解酶固定化酶，催化能力和对不同环境(温度、pH、贮存时间)的稳定性都有明显提高，用固定化酶处理海藻酸钠，采用离子树脂吸附降解产物，筛网过滤的方法回收固定化酶，采用超滤膜过滤的方法回收游离状态的酶，可以反复利用，提高了褐藻寡糖的得率，生产过程简单，生产成本大幅度下降，满足了褐藻寡糖产品的工业化生产要求。

Description

一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，涉及酶的固定化技术领域，特别是使用壳聚糖等生物多糖作为介质固定化褐藻胶裂解酶的制备方法。
背景技术
褐藻寡糖具有良好的亲水、稳定、高粘、无毒等特点，并且具有独特的生物活性，如促植物生长、提高抗逆性等，在医疗、肥料领域有广阔的应用潜力。褐藻寡糖由褐藻胶降解而来，传统的化学法使用强酸强碱或强氧化剂，产物以饱和寡糖为主。酶解法作用温和，主要断裂糖醛酸之间的化学键，得到的是不饱和寡糖，其生理活性更好。并且酶解法过程简单，副产物少，对环境友好，在未来必将替代化学方法。褐藻胶裂解酶是指可以专一催化断裂褐藻胶分子中糖苷键的一类酶，目前已经有70多种从藻类、海洋动物及微生物种分离出来，但商品化的寥寥无几。该酶在自然界中分泌量较少，提取困难，成分较高。且酶催化收环境温度和pH影响，稳定性较差，限制了其作为工业酶制剂的开发。
随着酶工程学的蓬勃发展，酶固定化技术的相关理论和实践技术日新月异。酶固定化方法可以分为吸附法、交联法共价偶联法、包埋法等几种，其中吸附法是通过载体表面与酶分子之间次级键相互作用而实现的固定化方法，具有操作简单、酶活保留率高的优点。而交联法是借助交联试剂的交联作用形成介质网格结构的固定化法，具有载量大，稳定程度高的优点。壳聚糖是一种天然碱性多糖，本身具有无毒无害、耐酸耐温的特点，使用壳聚糖作为固定化介质，制备褐藻胶裂解酶制剂，可以提高褐藻胶裂解酶的稳定性，实现酶制剂回收循环，减少化学试剂污染。但现有技术中，以壳聚糖作为酶固定化介质，多需辅以一定的载体，如改性膨胀蛭石(专利2018107277719)、聚乙烯醇纳米纤维(专利2016101545665)、大孔吸附树脂(专利201210062682X)等，因此开发高固定化率、稳定性好、耐酸碱环境优良、成本低等优势的褐藻胶裂解酶固定化酶是本领域亟需解决的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术中的不足，提供一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，得贮藏和操作稳定性良好的固定化褐藻胶裂解酶。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于它是利用壳聚糖-罗望子胶-戊二醛交联的方法制备固定化介质，之后通过活化加入游离褐藻胶裂解酶，制得固定化褐藻胶裂解酶，其具体步骤如下:
(1)将壳聚糖与罗望子胶混合后研磨成粉，过60目筛，室温下浸泡4h，冲洗掉杂质，抽滤后烘干；
(2)将壳聚糖-罗望子胶混合物用3％的乙酸溶液溶解，终浓度为2％-5％，超声至气泡消失变成透明凝胶；取凝胶加入至凝结液中，硬化过夜，水洗至中性，4℃保存；
(3)称取壳聚糖-罗望子胶小球置于戊二醛溶液中，缓冲液pH为5-7之间，30℃下浸泡并温和搅拌1-5h，静置并去除上清液，使用同样pH缓冲液反复冲洗交联后的小球，并抽滤除去多余的戊二醛，4℃保存；
(4)向交联后的壳聚糖-罗望子胶小球中加入一定量的褐藻胶裂解酶，用缓冲液稀释后，温和搅拌静置3h，之后再温和搅拌一次，4℃静置过夜；去除上清液得到固定化褐藻胶裂解酶。
上述壳聚糖的分子量为20000～50000Da，优选30000～40000Da。
上述壳聚糖与罗望子胶的质量比为3～5:1。
上述凝结液组成为15％NaOH溶液与95％乙醇的混合液，其体积比为4︰1。
上述壳聚糖-罗望子胶与戊二醛的质量比为1:0.1～0.5。
上述戊二醛质量浓度在1％-6％。
上述交联后的壳聚糖-罗望子胶小球与褐藻胶裂解酶的质量比为1:0.08～0.20；优选的质量比为1:0.15。
与现有技术相比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明采用了壳聚糖、罗望子胶作为介质，以吸附交联的方式制备固定化褐藻胶裂解酶，克服了单独采用吸附或者交联固定化方法产生的吸附力弱、易失活的缺点；
(2)与游离酶相比，固定化后的酶制剂具有性能更稳定，可以重复利用的特点；
(3)本发明选用的壳聚糖和罗望子胶均为生物多糖材料，资源丰富，而且通过壳聚糖和罗望子胶间的协同作用显著提升了褐藻胶裂解酶固定化酶的固定化率；
(4)本发明制备的褐藻胶裂解酶固定化酶具有高固定化率、稳定性好、耐酸碱环境优良、成本低等优势。
附图说明
图1：固定化酶与游离酶在不同温度条件下的相对酶活；
图2：固定化酶和游离酶在不同pH条件下的相对酶活；
图3：褐藻胶裂解酶固定化酶使用稳定性示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将壳聚糖与罗望子胶混合后研磨成粉，过60目筛，室温下浸泡4h，冲洗掉杂质，抽滤后烘干；所述壳聚糖的分子量为30000～40000Da；所述壳聚糖与罗望子胶的质量比为4:1；
(2)将壳聚糖-罗望子胶混合物用3％的乙酸溶液溶解，终浓度为2％-5％，超声至气泡消失变成透明凝胶，取凝胶加入至凝结液中，硬化过夜，水洗至中性，4℃保存；所述凝结液组成为15％NaOH溶液与95％乙醇的混合液，其体积比为4︰1；
(3)称取壳聚糖-罗望子胶小球置于戊二醛溶液中，戊二醛质量浓度在3％，缓冲液pH为5-7之间，30℃下浸泡并温和搅拌1-5h，静置并去除上清液，使用同样pH缓冲液反复冲洗交联后的小球，并抽滤除去多余的戊二醛，4℃保存；所述壳聚糖-罗望子胶与戊二醛的质量比为1:0.3；
(4)向交联后的壳聚糖-罗望子胶小球中按壳聚糖-罗望子胶小球与褐藻胶裂解酶的质量比1:0.15的比例加入褐藻胶裂解酶，用缓冲液稀释后，温和搅拌静置3h，之后再温和搅拌一次，4℃静置过夜；去除上清液得到固定化褐藻胶裂解酶。
实施例2
一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将壳聚糖与罗望子胶混合后研磨成粉，过60目筛，室温下浸泡4h，冲洗掉杂质，抽滤后烘干；所述壳聚糖的分子量为30000～40000Da；所述壳聚糖与罗望子胶的质量比为3:1；
(2)将壳聚糖-罗望子胶混合物用3％的乙酸溶液溶解，终浓度为2％-5％，超声至气泡消失变成透明凝胶，取凝胶加入至凝结液中，硬化过夜，水洗至中性，4℃保存；所述凝结液组成为15％NaOH溶液与95％乙醇的混合液，其体积比为4︰1；
(3)称取壳聚糖-罗望子胶小球置于戊二醛溶液中，戊二醛质量浓度在3％，缓冲液pH为5-7之间，30℃下浸泡并温和搅拌1-5h，静置并去除上清液，使用同样pH缓冲液反复冲洗交联后的小球，并抽滤除去多余的戊二醛，4℃保存；所述壳聚糖-罗望子胶与戊二醛的质量比为1:0.3；
(4)向交联后的壳聚糖-罗望子胶小球中按壳聚糖-罗望子胶小球与褐藻胶裂解酶的质量比1:0.15的比例加入褐藻胶裂解酶，用缓冲液稀释后，温和搅拌静置3h，之后再温和搅拌一次，4℃静置过夜；去除上清液得到固定化褐藻胶裂解酶。
实施例3
一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将壳聚糖与罗望子胶混合后研磨成粉，过60目筛，室温下浸泡4h，冲洗掉杂质，抽滤后烘干；所述壳聚糖的分子量为30000～40000Da；所述壳聚糖与罗望子胶的质量比为5:1；
(2)将壳聚糖-罗望子胶混合物用3％的乙酸溶液溶解，终浓度为2％-5％，超声至气泡消失变成透明凝胶，取凝胶加入至凝结液中，硬化过夜，水洗至中性，4℃保存；所述凝结液组成为15％NaOH溶液与95％乙醇的混合液，其体积比为4︰1；
(3)称取壳聚糖-罗望子胶小球置于戊二醛溶液中，戊二醛质量浓度在3％，缓冲液pH为5-7之间，30℃下浸泡并温和搅拌1-5h，静置并去除上清液，使用同样pH缓冲液反复冲洗交联后的小球，并抽滤除去多余的戊二醛，4℃保存；所述壳聚糖-罗望子胶与戊二醛的质量比为1:0.3；
(4)向交联后的壳聚糖-罗望子胶小球中按壳聚糖-罗望子胶小球与褐藻胶裂解酶的质量比1:0.15的比例加入褐藻胶裂解酶，用缓冲液稀释后，温和搅拌静置3h，之后再温和搅拌一次，4℃静置过夜；去除上清液得到固定化褐藻胶裂解酶。
实施例4褐藻胶裂解酶固定化率的测定
固定化率定义：游离酶的酶活减去经过固定化操作后上清液的酶活，所得结果与游离酶的酶活之比；
W1为固定化率，A1为游离酶540nm的吸光值，A2为固定化结束后上清液540nm的吸光值。测定实施例1-3褐藻胶裂解酶的固定化率并测定仅采用壳聚糖(对照实施例1，制备工艺同实施例1)和罗望子胶(对照实施例2，制备工艺同实施例1)的固定化率；试验结果如下表所示：
表1不同工艺条件下褐藻胶裂解酶固定化率
组别 实施例1 实施例2 实施例3 对照实施例1 对照实施例2
固定化率 91.6 88.2 85.9 71.3 10.4
上述实验结果表明，本发明制备方法能够较好的固定化褐藻胶裂解酶，其中实施例1中的固定化率最高，达到91.6％，实施例2和实施例3固定化率略低，说明壳聚糖与罗望子胶的配比会影响褐藻胶裂解酶的固定化率。对照实施例1的固定化率结果表明壳聚糖交联后能够起到较好的固定化褐藻胶裂解酶的作用，罗望子胶交联后的固定化率较低，但壳聚糖与罗望子胶的协同作用可以显著提升褐藻胶裂解酶的固定化率。
实施例5固定化褐藻胶裂解酶性能测定
褐藻胶裂解酶酶活测定方法：取酶液1ml，加入0.5％海藻酸钠溶液1ml及pH7.2的磷酸缓冲液5ml，40℃恒温水浴30min；还原糖采用DNS法，吸收波长540nm，灭活酶作为对照，计算相对酶活；海藻酸钠经过褐藻胶裂解酶降解后产生的褐藻寡糖为还原糖。酶活力定义为：每分钟每克固定化酶催化底物，释放出1μg还原糖为一个酶活力单位(U)。
其中，X为样品的酶活力(U/g)，A为在波长540nm的吸光值，反应时间为30min，M为加入酶的质量(g)，D为稀释倍数。m、n分别为还原糖标曲参数；
取固定化酶与游离酶，分别于不同温度下、不同pH条件下水解褐藻酸钠，对比其相对酶活，以两者最大酶活记为100％。，结果如图1-3所示；
图1、图2实验结果表明，温度低于30℃时，游离酶与固定化酶差别不大。游离酶最佳催化温度为30℃左右，而固定化酶为37℃左右，提高了约7℃。且温度高于40℃后，游离酶由于热变性，活力迅速下降。固定化酶比起游离酶在温度较高时稳定性较好，具备了一定程度的耐热性。游离酶和固定化酶的最适反应pH值均为7，在pH值6以下及8以上时，游离酶活性迅速减少，而固定化酶活性较为稳定。
图3实验结果表明，连续使用固定化酶催化反应10次，记录每次所表现的相对酶活。连续使用多次，固定化酶的活力缓慢下降。以固定化酶最大酶活记为100％，回收6次后相对活力仍然可以保持最大酶活的80％以上，说明此固定化酶具备较好的操作稳定性。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于利用壳聚糖-罗望子胶-戊二醛交联的方法制备固定化介质，之后通过活化加入游离褐藻胶裂解酶，制得固定化褐藻胶裂解酶，其具体步骤如下:
(1)将壳聚糖与罗望子胶混合后研磨成粉，过60目筛，室温下浸泡4h，冲洗掉杂质，抽滤后烘干；
(2)将壳聚糖-罗望子胶混合物用3％的乙酸溶液溶解，终浓度为2％-5％，超声至气泡消失变成透明凝胶；取凝胶加入至凝结液中，硬化过夜，水洗至中性，4℃保存；
(3)称取壳聚糖-罗望子胶小球置于戊二醛溶液中，缓冲液pH为5-7之间，30℃下浸泡并温和搅拌1-5h，静置并去除上清液，使用同样pH缓冲液反复冲洗交联后的小球，并抽滤除去多余的戊二醛，4℃保存；
(4)向交联后的壳聚糖-罗望子胶小球中加入一定量的褐藻胶裂解酶，用缓冲液稀释后，温和搅拌静置3h，之后再温和搅拌一次，4℃静置过夜；去除上清液得到固定化褐藻胶裂解酶。
2.根据权利要求1所述一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于所述壳聚糖的分子量为20000～50000Da，优选30000～40000Da。
3.根据权利要求1所述一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于所述壳聚糖与罗望子胶的质量比为3～5:1。
4.根据权利要求1所述一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于所述凝结液组成为15％NaOH溶液与95％乙醇的混合液，其体积比为4︰1。
5.根据权利要求1所述一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于所述壳聚糖-罗望子胶与戊二醛的质量比为1:0.1～0.5。
6.根据权利要求1所述一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于所述戊二醛质量浓度在1％-6％。
7.根据权利要求1所述一种褐藻胶裂解酶固定化酶的制备方法，其特征在于所述交联后的壳聚糖-罗望子胶小球与褐藻胶裂解酶的质量比为1:0.08～0.20；优选的质量比为1:0.15。
8.按权利要求1-7所述工艺制备的固定化褐藻胶裂解酶。
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