CN1407103A - 一种珠状壳聚糖载体的制备及其用于酶固定化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珠状壳聚糖载体的制备及其用于酶固定化的方法。本发明采用有机相-水相两相分离法制备珠状壳聚糖,质量体积比0.1%-6.0%浓度的壳聚糖在有机溶剂中分散,采用酰基化试剂增加载体机械强度后制得珠状壳聚糖。采用戊二醛一步活化获得带有大量活泼醛基的壳聚糖珠,即可直接偶联蛋白质分子的氨基,制备固定化酶。该方法简单,适于工业生产。所制固定化酶活性好,机械强度高,稳定性好,价格便宜。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化酶载体的制备及其用于酶固定化的方法,特别是涉及一种珠状壳聚糖载体的制备及其用于酶固定化的方法。
背景技术
固定化酶(Immobilized enzyme)技术是本世纪六十年代发展起来的一项新型生物技术,其定义为“通过化学或物理学的手段束缚于一定区域内,保持了催化活性并且可以重复、连续使用的酶”。
天然酶在食品、化工和医药工业中己被广泛应用。世界范围内,每年用于食品、去垢剂、精细化工和诊断的酶销售额就达七亿美元。但由于酶是一种可溶性的蛋白质,不易回收和重复使用,造成了催化剂浪费;此外酶蛋白还会污染产物,给后处理造成困难,在医药产品的生产中此问题尤为严重。
自从六十年代初Katchalski-Katzir等人首次将酶进行固定化后(Katchalskiet al.mnnu.Rev.Biochem..35:773-908,1966),固定化酶的可重复使用以及可连续操作等优良特性就开始受到人们广泛的关注。1967年日本Tanaka Seiyaku公司千
等人首次成功地将固定化酶技术用于工业生产(I.Chibata et al.Biotechno1.Bioeng.9:603-615,1967)。他们使用固定化氨基酸酰化酶将人工合成的外消旋D,L-氨基酸拆分生产L.型对映体。1970年前后,另外两个固定化酶系统相继投入中试生产。一个是英国用固定化青霉素酰化酶水解青霉素G或V生产6-氨基酸青霉烷酸(Proc.R.Soc.London Sen B 179:321-334.1971);另一个是美国用固定化葡萄糖异构酶转化葡萄糖生产果糖(Wingard,Lemuel B.Applied Biochemistry and Bioengineering,Vol.1,pp222-327.Academic Press,1976)。这些成功的工业应用促进了固定化酶技术的广泛深入研究,使以固定化酶为催化剂的工业生产层出不穷。
利用固定化酶进行工业生产,不仅使酶可以回收并重复使用,降低催化剂成本,还提高了酶的稳定性,避免酶蛋白对产物造成污染,简化了后处理过程。由于固定化酶研究的迅速发展,及其在工业生产和生化分析中的广泛应用,使之成为现代生物技术中最活跃的领域之一。
酶的固定化可采用物理或化学等多种方法,包括:吸附法、离子交换法、交联法、吸附交联法、共聚法、共价连接法以及包埋法、微胶囊法等。对于不同的酶和载体来说,固定化方法各有不同,但目的都是制备获得具有高稳定性、高酶活力的固定化酶(袁中一等,固相酶与亲和层析,科学出版社,1975)。
固定化载体是固定化酶技术中的一个重要部分。固定化载体的直径和孔径的大小直接影响到固定化酶载量。其次,载体的表面基团会影响固定化酶的微环境,改变酶的亲水或疏水性、最适温度和pH以及动力学参数等性质。同时,载体的机械强度也对固定化酶的使用寿命有一定影响。作为理想的固定化载体,应具备一些基本特性:难以被微生物利用,在酸性或碱性条件下不被化学试剂破坏,同时应具有较好的机械强度,且易于被修饰而产生不同性质的合成载体。
90年代后新近出现或研究较多的载体主要包括聚甲基丙烯酸类载体(如Eupergit C)、聚丙烯酸类载体、聚丙稀酰胺载体、无机载体(如硅载体)等天然高分子或合成高分子载体。载体的形式也趋多样,从珠状到大孔或多孔颗粒,以及纤维和膜等。但是,在大规模生产中,固定化酶大多采用珠状载体,以便于重复回收利用(袁中一,化工手册11分册,陈冠荣等编,化学工业出版社,1996)。
壳聚糖(chitosan)是一种天然的氨基多糖,学名为(1-4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖,是甲壳质(chitin)的脱乙酰基产物。甲壳质是一种世界上广泛存在的有机资源,是节肢动物如虾、蟹、昆虫等外壳的重要成分(约含10%~30%),也存在于低等动物的细胞壁中。甲壳质是自然界产量仅次于纤维素的天然高分子,据统计每年由生物合成的甲壳质约有数十亿吨,而目前国内开发利用的仅数万吨。
壳聚糖具有许多独特的化学物理性质,根据其酰化、硫酸酯化和氧化、羟乙基化、羟甲基化等反应还可制备成多种用途的产品,而且从氨基多糖的特点出发具有比纤维素更为广泛的用途。对壳聚糖的应用开发研究,自本世纪六十年代以来就十分活跃,近年来国际上更是十分重视对它的深入开发和应用。目前,国际上应用甲壳质及其衍生物制备的海洋生物材料高科技产品不断推出,应用产品已达五百种以上,美国、日本、意大利、挪威、印度和南朝鲜等国相继建立甲壳质/壳聚糖生产厂,其中日本和美国是主要生产国家,同时又是主要的消费国。通过对甲壳质和壳聚糖进行化学修饰与改性来制备性能独特的衍生物已经成为当今世界应用开发的一个重要方面。壳聚糖被广泛用于制药,感光材料,食品添加剂,作为金属合剂以及被用于食品果蔬的防腐与保鲜;用甲壳质制备的壳聚糖易溶于水,易被吸收,并且具有抗菌,抗肿瘤和提高植物防御能力等功效;在医药工业,可制成吸收性手术缝合线、创可贴、免疫促进剂。甲壳质/壳聚糖及其衍生物的应用领域几乎已涉及到日常生活的各个方面。
中国具有丰富的甲壳素资源,有巨大的甲壳素/壳聚糖产品的潜在市场,但是储量丰富的甲壳素/壳聚糖资源还远没有像淀粉、纤维素那样得到广泛的研究和应用。
壳聚糖用于固定化载体的报道很多,但多是采用交联试剂进行壳聚糖的内交联或壳聚糖与酶的共交联,由于用制备获得的载体,在固定化酶重复使用的过程中,易造成载体破碎和酶的脱落,这种载体没有规则外形,固定化酶活力回收效率低。我国至今仍然没有商品化的固定化酶专用载体。
本申请的发明人研究发现,可以利用壳聚糖酰基化和脱酰基化后两种性质和状态的不同,实现壳聚糖物理外形重塑,制备获得符合工业生产需要的珠状壳聚糖载体。同时,利用壳聚糖表面带电性及其大量可活化的氨基,实现同时吸附和共价结合酶和蛋白质的方法。并且,由于氨基活化时所采用的戊二醛本身还是一种消毒剂,因此在活化载体的同时,又对载体进行了消毒,有利于生产中保持无菌状态。
涉及的基本原理是:
甲壳素脱乙酰化后的产物——壳聚糖能够在微酸性条件下溶解。采用两相分离法使壳聚糖以液滴形式分散在有机相中。然后采用酰基化试剂,使壳聚糖由表及里逐渐被酰基化,从而形成水溶性低、机械强度高的珠状颗粒,其方程式如下(酰基化试剂以乙酸酐为例,下同):
由于壳聚糖载体表面带正电,对于酶蛋白具有一定吸附作用。同时,采用戊二醛这种双功能试剂处理载体表面,氨基被活化,造成珠状载体表面携有大量醛基活化功能团,可与酶蛋白表面的氨基共价结合,获得固定化酶。其方程式如下:其中:carrier为珠状壳聚糖载体,E代表酶。
发明内容
本发明目的是提供一种原料丰富、成本低廉、机械强度高,化学性质稳定、适合工业应用的珠状壳聚糖载体的制备、固定化方法。
本发明的目的是这样实现的:一种珠状壳聚糖载体的制备方法,包括如下步骤:1)用体积比5%-70%的醋酸溶液配置质量体积比0.1%-6%浓度的壳聚糖溶液,搅拌至壳聚糖溶解,用过滤器过滤得到用于载体制备的透明状的壳聚糖溶液;2)采用有机相—水相成珠法制备珠状凝胶,在成珠过程中,有机相与水相体积比为5∶1-1∶1之间,混合搅拌1-5小时后,转速为200-1500转/分钟,缓慢加入混悬物总体积10%-70%的酰基化试剂,继续反应1-5小时,形成珠状壳聚糖载体;3)滤去有机溶剂,壳聚糖载体依次采用甲醇,乙醚和水洗涤,并用筛子分得大小不同范围的珠状载体。
步骤1)中的壳聚糖溶液的质量体积比浓度较佳为0.5%-4%,最佳为1.5%-2.5%。
步骤2)中的有机相与水相的比例较佳为4∶1-1.5∶1之间,最佳为3.5∶1-2∶1之间;酰基化试剂占混合物总体积较佳为30%-65%,最佳为40-60%。
使用的有机溶剂为甲苯、氯仿、汽油、乙酸丁酯、环己烷中的一种或几种。
使用的酰基化试剂为乙酰氯、苯甲酰氯、乙酸酐、丁二酸酐、邻苯二甲酸酐中的一种或几种。
本发明还提供了一种用珠状壳聚糖载体进行酶固定化的方法,包括如下步骤:1)壳聚糖载体脱乙酰化,用0.1-5摩尔/升的一元碱溶液水浴加热处理壳聚糖载体1-5小时后,水洗壳聚糖载体至中性;2)壳聚糖载体活化,用体积比0.5%-10%戊二醛溶液室温摇动处理壳聚糖载体2-10小时,水洗净壳聚糖载体除去游离戊二醛;3)酶的固定化,将以上得到的已活化珠状壳聚糖载体与酶溶液以1∶3体积混合,酶蛋白终浓度为0.5-10mg/ml,4℃下偶联1-24小时,除去上清液,固定化酶依次以0.5-2摩尔/升NaCl溶液和pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤,得到以珠状壳聚糖为载体的固定化酶。
步骤1)中一元碱溶液的摩尔浓度较佳为0.5-4摩尔/升,最佳为1.5-3摩尔/升。碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液。
步骤2)中戊二醛溶液的体积比浓度较佳为1%-8%,最佳为3%-6%。
珠状壳聚糖载体的酶固定化的方法,适用于青霉素酰化酶、胰蛋白酶、纤维素酶、天门冬酰氨酶、木聚糖酶、脲酶、α-淀粉酶、D-氨基酸氧化酶、GL7-ACA酰化酶等酶的固定化。
采用本发明可制备获得符合工业生产需要的珠状外形的壳聚糖载体,其机械强度高,在连续搅拌反应中没有出现载体破碎现象。同时,利用壳聚糖表面大量可供活化的氨基和醛基,可实现共价偶连固定酶蛋白。将本发明实施例1制备的珠状壳聚糖载体与市售Eupergit C载体同时固定化青霉素酰化酶所得固定化酶同时进行水解活性及稳定性比较,采用高底物浓度以快速评价固定化酶情况:
Eupergit C | 珠状壳聚糖载体 | ||||
裂解次数 | 初速度 | 相对活力 | 裂解次数 | 初速度 | 相对活力 |
1 | 0.1836 | 100.00 | 1 | 0.1581 | 100.00 |
2 | 0.1323 | 72.06 | 2 | 0.145 | 91.71 |
3 | 0.1318 | 71.79 | 3 | 0.1412 | 89.31 |
以100g/L青霉素G钾盐为底物,反应条件为34℃,pH8.4,2摩尔/升NaOH滴定维持pH,当耗碱量达9.5ml时,停止滴定,至pH降至7.0时,停止反应。以上整个过程定为一次裂解反应。
按本发明制备的珠状壳聚糖载体所固定化的青霉素酰化酶与市售Eupergit C的固定化青霉素酰化酶比较,经3次剧烈条件的裂解反应后,在初速度和残余酶活上都略有优势。
具体实施方式
实施例1
首先制备珠状壳聚糖载体:
1)用体积比10%的醋酸溶液配置质量体积比2%壳聚糖(脱乙酰度>90%)溶液100mL,搅拌至壳聚糖溶解,用80目滤器过滤,制得用于载体制备的壳聚糖溶液。
2)采用两相(有机相—水相)成珠法制备珠状外形的壳聚糖。其中,有机溶剂采用甲苯,有机相与水相体积比为3∶1。混合搅拌2小时,转速为600转/分钟。随后,缓慢加入以上混合物总体积55%的乙酸酐,继续反应1.5小时,此时已形成珠状壳聚糖载体。
3)滤去有机溶剂,载体分别采用甲醇,乙醚和水洗涤。
然后用制得的珠状壳聚糖载体固定化青霉素酰化酶
1)壳聚糖载体脱乙酰化:在3g珠状壳聚糖载体中加入2.0摩尔/升NaOH溶液,然后用80℃水浴加热处理4小时。用水洗涤使上清液pH呈中性。抽干。
2)壳聚糖载体活化:在壳聚糖载体中加入50ml体积比为5%戊二醛溶液室温摇动处理2小时。水洗涤载体除去游离的戊二醛,即得含醛基的载体。
3)酶的固定化:将以上得到的醛基壳聚糖载体与青霉素酰化酶溶液以1∶3体积混合(酶的终蛋白浓度为2.5mg/ml,总活力为1000U,酶活采用NIPAB法测定),4℃下缓慢搅拌10小时,发生偶联。经3号砂芯漏斗过滤,滤去上清。固定化酶则依次以0.5摩尔/升NaCl溶液、0.1摩尔/升pH7.4的磷酸缓冲液洗涤,得到以珠状壳聚糖为载体的固定化酶。
固定化酶活力为60U/g载体(NIPAB法)。固定化酶的蛋白为1mg/g湿重载体。
实施例2
采用与实施例1相同的步骤,在制备珠状壳聚糖载体时,壳聚糖溶液的质量体积比浓度为1.5%,有机相与水相体积比为3∶1,并加入占混合物总体积50%的乙酸酐作为酰基化试剂;在青霉素酰化酶的固定化时,NaOH溶液的摩尔浓度为1.5摩尔/升,戊二醛溶液体积比浓度为2%。
测得的固定化酶的酶活力为43U/g湿重载体。
实施例3
采用与实施例1相同的步骤,在制备珠状壳聚糖载体时,壳聚糖溶液的质量体积比浓度为2.5%,有机相与水相体积比为4∶1,并加入占混合物总体积55%的乙酸酐作为酰基化试剂;在青霉素酰化酶的固定化时,NaOH溶液的摩尔浓度为2摩尔/升,戊二醛溶液体积比浓度为5%。
测得的固定化酶的酶活力为50U/g湿重载体。
实施例4
采用与实施例1相同的步骤,其中,酶蛋白为纯化的胰蛋白酶溶液,蛋白终浓度为2mg/ml。所得固定化胰蛋白酶的蛋白为1.1mg/g湿重载体。
Claims (10)
1、一种珠状壳聚糖载体的制备方法,包括如下步骤:
1)用体积比浓度为5%-70%的醋酸溶液配置质量体积比浓度0.1%-6%浓度的壳聚糖溶液,搅拌至壳聚糖溶解,用过滤器过滤得到用于载体制备的透明状的壳聚糖溶液;
2)采用有机相—水相成珠法制备珠状凝胶,在成珠过程中,有机相与水相体积比为5∶1-1∶1之间,混合搅拌1-5小时后,转速为200-1500转/分钟,缓慢加入混悬物总体积10%-70%的酰基化试剂,继续反应1-5小时,形成珠状壳聚糖载体;
3)滤去有机溶剂,壳聚糖载体依次采用甲醇,乙醚和水洗涤,并用筛子分得大小不同范围的珠状载体。
2、如权利要求1所述的珠状壳聚糖载体的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中的壳聚糖溶液的质量体积比浓度较佳为0.5%-4%,最佳为1.5%-2.5%。
3、如权利要求1所述的珠状壳聚糖载体的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中的有机相与水相的比例较佳为4∶1-1.5∶1之间,最佳为3.5∶1-2∶1之间;酰基化试剂占混合物总体积较佳为30%-65%,最佳为40-60%。
4、如权利要求1所述的珠状壳聚糖载体的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂为甲苯、氯仿、汽油、乙酸丁酯、环己烷中的一种或几种。
5、如权利要求1所述的珠状壳聚糖载体的制备方法,其特征在于,所述的酰基化试剂为乙酰氯、苯甲酰氯、乙酸酐、丁二酸酐、邻苯二甲酸酐中的一种或几种。
6、一种利用权利要求1至5所述的任一种珠状壳聚糖载体进行酶固定化的方法,包括如下步骤:
1)壳聚糖载体脱乙酰化,用0.1-5摩尔/升的一元碱溶液水浴加热处理壳聚糖载体1-5小时后,水洗壳聚糖载体至中性;
2)壳聚糖载体活化,用体积比0.5%-10%戊二醛溶液室温摇动处理壳聚糖载体2-10小时,水洗净壳聚糖载体除去游离戊二醛;
3)酶的固定化,将以上得到的已活化珠状壳聚糖载体与酶溶液以1∶3体积混合,酶蛋白终浓度为0.5-10mg/ml,4℃下偶联1-24小时,除去上清液,固定化酶依次以0.5-2摩尔/升NaCl溶液和pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤,得到以珠状壳聚糖为载体的固定化酶。
7、如权利要求6所述的珠状壳聚糖载体的酶固定化的方法,其特征在于,所述的步骤1)中一元碱溶液的摩尔浓度较佳为0.5-4摩尔/升,最佳为1.5-3摩尔/升。
8、如权利要求6所述的珠状壳聚糖载体的酶固定化的方法,其特征在于,所述的步骤2)中戊二醛溶液的体积比浓度较佳为1%-8%,最佳为3%-6%。
9、如权利要求6所述的珠状壳聚糖载体的酶固定化的方法,其特征在于,所述的碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液。
10、如权利要求6所述的珠状壳聚糖载体的酶固定化的方法,其特征在于,所述的酶是青霉素酰化酶、胰蛋白酶、纤维素酶、天门冬酰氨酶、木聚糖酶、脲酶、α-淀粉酶、D-氨基酸氧化酶、GL7-ACA酰化酶等。
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |