CN101508986A - 以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶及其制备的方法。本发明是在硅溶胶与硅烷偶联剂共聚得到表面带功能基团的多孔硅凝胶，青霉素酰化酶以共价结合上去的粒径为13－15μm，孔径14－30nm的多孔固定化青霉素酰化酶。制备方法是：先制备载体，再将载体活化，然后制备以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶。本发明制备的以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶，有合适的粒径和孔径，有较大的比表面积(300－600m2/g)，不易染菌，强度优于国外常采用的琼脂糖6B微珠、丙烯酸树脂微球，且原料价格便宜，稳定性好，提供的制备方法简单，反应过程稳定，适用于工业化批量生产。

Description

以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶及制备方法

技术领域

本发明涉及一种固定化酶生物技术，特别是涉及一种以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶及其制备的方法。

背景技术

固定化酶(immobilized enzyme)技术是本世纪六十年代Katchallski-Katzir等人为研究自然状态下附着在生物膜上的酶的作用机制，首先将一些蛋白质水解酶固定于不容性的载体上或包裹在人工膜中，研究其稳定性和非均相催化作用的特性发展起来的一项新型生物技术(Annu.Rev.Biochem.35，773-908，1966)。其定义为“物理限制或定位于特定空间区域内，保持了催化活性并且可以重复、连续使用的酶”。天然酶在食品、化工和医药工业中广泛使用，但酶是一种可溶性蛋白质，易失活，不易回收，造成了浪费和污染。将酶固定在载体上，制成固定化酶，不仅可以使酶重复使用，还提高了酶的稳定性，简化了后处理，有利于工业上大规模使用。目前，世界上工业化产量最高的三种固定化酶为葡萄糖异构酶、腈水解酶和青霉素酰化酶(PGA)，年产量分别为80000吨、7500吨、1500吨。

酶固定化的制备方法可大致分为以下四种主要的方法：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。吸附法由于酶和载体以离子键、范德华力等结合，二者之间的结合力较弱，酶易流失，但此种方法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化较少等优点。共价结合法是将酶以共价键的方式结合与载体上，此方法制得的固定化酶与载体结合牢固，不易脱落，但此法操作复杂，反应条件苛刻，容易引起酶失活。交联法是先将酶吸附于不溶性载体上，然后用双功能的试剂使酶分子间进行分子交联，形成网状结构而固定化，此法也存在反应条件剧烈，酶活损失等不足。包埋法是将酶包埋于微囊中，此法制备的固定化酶不宜使用大分子底物，且酶容易失活，一般用于固定化细胞。四种方法各有优缺点，在工业化应用中，为了降低固定化酶的成本，一般要求固定化酶有良好的操作稳定性，可以重复使用多次。综上所述，用共价法或交联法制备的固定化酶具有较好的操作稳定性。

青霉素酰化酶是催化青霉素G钾盐裂解制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)的催化剂，6-APA是半合成青霉素的关键中间体，通过不同侧链的连接，可获得如氨苄青霉素、甲氧苄青霉素、羟氨苄青霉素等高效、广谱的半合成β-内酰胺类抗生素。目前6-APA的制备方法主要有化学裂解法和酶法，由于化学法存在反应条件苛刻、收率低、副反应多以及含有三废排放等问题，现国际上主要以酶法生产6-APA。但若使用游离酶催化青霉素的水解反应，则由于游离酶存在的弱点，在经济上无法与化学法竞争。近年来，酶固定化技术的发展，人们可以利用固定化青霉素酰化酶水解青霉素G钾盐生产6-APA。由于固定化青霉素酰化酶具有稳定性高、容易分离、可连续操作等优点，在工艺、经济上均优于化学法。CN1279287A发明了一种多元共聚多孔微珠作为固定青霉素酰化酶的载体，但高聚物本身的结构及性质决定了它存在如下弱点：控制聚合物的孔结构及表面功能性基团的数量及其分布比较困难，质量扩散效率低；高聚物载体热稳定性、机械稳定性及耐溶剂性较弱；高聚物载体废弃后处理较为困难。针对高聚物载体的弱点，人们开发使用了一些无机类载体，如CN1320688A将MAM-41作为固定青霉素酰化酶的载体，但制备的固定化酶活性不高，而且主要靠吸附方式结合，所以固定化酶的操作稳定性不好。为了提高固定化酶的稳定性，通常对无机载体进行表面修饰，嫁接功能性基团，但用此类方法修饰的载体，具有功能性基团数量有限等缺点。因此，要制备活性较高、稳定性好可用于工业化的固定化青霉素酰化酶需要解决以下问题：(1)载体表面应具有可与青霉素酰化酶发生共价作用的有机基团，确保固定化酶具有良好的操作稳定性；(2)载体比表面积应较大，可使其表面尽量暴露更多的有机基团；(3)载体表面的功能性基团不仅数量及其分布适当，而且要容易接近；(4)载体应具有足够的热稳定性和机械稳定性了；(5)载体的粒度应适当，便于反应后与产物的分离。(这些问题在本发明中是否都已经解决，解决的应当在效果中说明)

目前，世界各大制药公司均有自己的固定化载体和固定化酶。国内的6-APA生产厂家多使用进口的丙烯酸树脂(Eupergit C)，价格比较昂贵，使固定化酶成本很高。提高国产青霉素工业的效率，降低生产成本，是国内相关产业部门十分期待的。

发明内容

本发明提供一种以溶胶-凝胶过程生产的硅凝胶为载体，经过交联剂活化，将青霉素酰化酶结合上去，制备成固定化青霉素酰化酶，以获得高稳定性和活性的固定化青霉素酰化酶。

本发明的技术是这样实现的：

本发明以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶，是在硅溶胶与硅烷偶联剂共聚得到表面带功能基团的多孔硅凝胶，青霉素酰化酶以共价结合上去的粒径为13-17μm，孔径14-30nm的多孔固定化青霉素酰化酶。

本发明的以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶的制备方法，步骤如下：

(1)载体制备：将酸性硅溶胶溶乙醇中，室温搅拌状态下加入硅烷偶联剂，三者体积比为1：1：1～1.5，室温凝胶3～24小时，机械搅拌粉碎凝胶块，乙醇冲洗，大量去离子水冲洗，4～7℃保存。

(2)载体活化：将上述湿的载体，加入到质量分数2％～10％的活化交联剂中，室温搅拌4-24小时，离心分离，蒸馏水洗涤，4-7℃保存。

(3)将步骤(2)中的湿的活化的载体与青霉素酰化酶酶液按1：1～1：4(g/mL)的比例，加入到10-20ml的pH为7.6～8.1的0.1～0.25M的磷酸盐缓冲液中，室温低速搅拌12～24小时，产物用相同条件下的磷酸盐缓冲液冲洗，4～7℃保存。

所述的载体制备过程中的酸性硅溶胶为质量分数为15～30％的二氧化硅溶胶，pH在4-6，硅烷偶联剂包括含各种功能基团的硅烷偶联剂：γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氯丙基三乙氧基硅烷等。

所述得载体制备过程中，可以通过调节硅溶胶溶液得质量分数，以及硅溶胶、乙醇、硅烷偶联剂三者之间的摩尔比例，或者改变凝胶时间，得到不同密度、不同外形的多孔硅凝胶材料。

所述的载体活化阶段使用的交联剂包括：戊二醛、N，N-碳酰二咪唑、溴化氰、1，4-二缩水甘油醚等，其中优先考虑使用戊二醛和N，N-碳酰二咪唑。

所述的所有步骤都是在室温下进行的。

所述的载体负载青霉素酰化酶得方法同样适用于其他一些酶得负载，只要将步骤(3)中的游离青霉素酰化酶得溶液换成其他一些酶液体即可，如水解酶，氧化还原酶，合成酶等等。优选脂肪酶、胰蛋白酶、脲酶等。

1.本发明制备的以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶，其颗粒直径为13-17微米，有较大的比表面积(300-600m2/g)、，平均孔径为12-20nm，不易染菌，强度优于国外常采用的琼脂糖6B微珠、丙烯酸树脂微球。

2.本发明的载体材料表面含有功能基团氨基、环氧基等，且原料价格便宜，稳定性好，

3.本发明制备的固定化青霉素酰化酶活性在500-700IU/g(wet)。

4.本发明提供的制备方法简单，反应过程稳定，适用于工业化批量生产。

附图说明

图1(a)：合成的硅胶载体的电镜(SEM)图；

图1(b)：N，N-碳酰二咪唑活化载体后得到的CDI-SG的电镜(SEM)图；

图1(c)：CDI-SG为载体固定化青霉素酰化酶得到PGA-CDI-SG的电镜(SEM)图；

图2：单纯的硅凝胶、氨基化的硅凝胶、CDI活化的硅凝胶、固定化青霉素酰化酶的硅凝胶的红外谱图；

图3(a)：为游离青霉素酰化酶的Lineweaver—Burk图；

图3(b)：为固定化青霉素酰化酶(PGA-CDI-SG)的Lineweaver—Burk图；

图4(a)：固定化青霉素酰化酶(PGA-CDI-SG)的储存稳定性图；

图4(b)：固定化青霉素酰化酶(PGA-CDI-SG)的操作稳定性图

具体实施方式

这篇申请书中所公开的的所有文章和参考文献都是整体文献的参考部分。

这个发明的起始原料和各种中间体可以买到，或可以用商品原料制备。

实施例1

1.将20ml，质量分数30％的硅溶胶溶于20ml乙醇中，搅拌溶解均匀，室温下将23ml的硅烷偶联剂γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)滴加入上述溶液中，停止搅拌，静置凝胶3小时，用机械搅拌将凝聚块搅碎，加入20ml乙醇冲洗，离心分离，产品用大量蒸馏水冲洗，离心分离，得到用于固定化的载体(N-SG)湿的状态下4-7℃保存。(干燥下载体比表面积：378m2/g，平均孔径17nm)

2.将上述1g湿的载体加入20ml，质量分数0.5％的戊二醛溶液中，室温下搅拌4小时，离心分离，用20ml蒸馏水冲洗3遍，得到活化后的载体(GA-SG)湿的状态下4-7℃保存3.将活化后的载体0.5g加入15ml，pH7.9的磷酸盐缓冲溶液(0.2M)中，加入900μl青霉素酰化酶酶液，室温下缓慢搅拌24小时，离心分离，15ml同样的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，得到戊二醛交联固定化的青霉素酰化酶(GA-PGA-SG，378m2/g，粒径为13-17μm，平均孔径14～17nm，酶表观活性：575IU/g(wet)).

实施例2

1.同实施例1，将所得产物冷冻干燥，再在100℃下真空干燥3小时，做电镜和表面吸附试验。测得的产物的比表面积为320m2/g，孔径为17nm，电镜SEM图为附图1中的(a).

2.将上述步骤1得到的1g湿的载体用20ml丙酮冲洗一遍，然后加入20ml，质量分数0.6％的N，N-碳酰二咪唑(CDI)的丙酮溶液中，室温下搅拌4小时，离心分离，用10ml丙酮冲洗3遍，得到活化后的载体(CDI-SG)悬浮在丙酮中4-7℃保存.将所得产物同步骤1一样处理，得比表面积246m2/g，孔径为24nm，电镜SEM图为附图1中的(b).

3.将步骤2中活化后的载体0.5g，用10ml pH7.9的磷酸盐缓冲溶液冲洗一遍，加入15ml，pH7.9的磷酸盐缓冲溶液(0.2M)中，加入1200μl青霉素酰化酶酶液，室温下缓慢搅拌12小时，离心分离，15ml同样的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，得到固定化的青霉素酰化酶(CDI-PGA-SG)。将所得固定化酶同步骤1一样处理，得比表面积367m2/g，孔径为20nm，电镜SEM图为附图1中的(c).

将步骤1、2、3中干燥后的产物做红外谱图，得到图2，从中可以看到分别代表步骤1、2、3的曲线b，c，d都有2935cm-1处的C-H，而未修饰的硅凝胶(曲线a)则没有。此外还有1630cm-1的C＝N键和1540cm-1处的N-H，C＝O键等。

图3是步骤3中得到的固定化青霉素酰化酶同液体青霉素酰化酶的反映酶动力学的米氏常数图，通过图3计算得到二者的动力学参数分别为：

表中内容都应当是中文

图4：a)是步骤3制备的固定化青霉素酰化酶在4℃下储存30天时间，每隔固定的时间测其活性所得的储存稳定性图，从图中可以清楚地看到本发明制的的固定化青霉素酰化酶有很好的稳定性。

b)是步骤3种制备的固定化青霉素酰化酶放置于一玻璃管中，质量分数2％的青霉素钾盐做流动相，连续5小时，测量出口处的6-APA的浓度。可以看到本发明的固定化青霉素酰化酶有很好的操作稳定性。

实施例3

1.将20ml，质量分数30％的硅溶胶溶于20ml乙醇中，搅拌溶解均匀，室温下将30ml的硅烷偶联剂γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷滴加入上述溶液中，停止搅拌，静置凝胶3小时，用机械搅拌将凝聚块搅碎，加入20ml乙醇冲洗，离心分离，产品用大量蒸馏水冲洗，离心分离，得到用于固定化的载体，湿的状态下7℃保存。

2.将上述1g湿的载体加入20ml，质量分数1.0％的1，4-二缩水甘油醚溶液中，室温下搅拌24小时，离心分离，用20ml蒸馏水冲洗3遍，得到活化后的载体湿的状态下4-7℃保存

3.将活化后的载体0.5g加入15ml，pH8.1的磷酸盐缓冲溶液(0.25M)中，加入2000μl青霉素酰化酶酶液，室温下缓慢搅拌24小时，离心分离，10ml同样的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，得到戊二醛交联固定化的青霉素酰化酶(比表面积586m2/g，粒径为13-17μm，平均孔径18-20nm，表观酶活性：617IU/g(wet)

实施例4

1.同实施例3

2.将上述步骤1得到的1g湿的载体用20ml丙酮冲洗一遍，然后加入20ml，质量分数0.6％的溴化氰的丙酮溶液中，室温下搅拌8小时，离心分离，用10ml丙酮冲洗3遍，得到活化后的载体悬浮在丙酮中5℃保存

3.将步骤2中活化后的载体0.5g，用10ml pH7.6的磷酸盐缓冲溶液冲洗一遍，加入15ml，pH7.6的磷酸盐缓冲溶液(0.1M)中，加入1200μl青霉素酰化酶酶液，室温下缓慢搅拌12小时，离心分离，20ml同样的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，得到固定化的青霉素酰化酶(比表面积514m2/g，粒径为13-17μm，平均孔径20-30nm，表观酶活性：535IU/g(wet)

本发明提出的一种以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶及其制备的方法，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的结构和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (4)

1.一种以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶，其特征是在硅溶胶与硅烷偶联剂共聚得到表面带功能基团的多孔硅凝胶，青霉素酰化酶以共价结合上去的粒径为13-17μm，孔径14-30nm的多孔固定化青霉素酰化酶。

2.权利要求1的以硅凝胶为载体的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于依步骤如下：

(1)载体制备：将酸性硅溶胶溶乙醇中，室温搅拌状态下加入硅烷偶联剂，三者体积比为1：1：1～1.5，室温凝胶3～24小时，机械搅拌粉碎凝胶块，乙醇冲洗，大量去离子水冲洗，4～7℃保存。

(2)载体活化：将上述湿的载体，加入到质量分数2％～10％的活化交联剂中，室温搅拌4-24小时，离心分离，蒸馏水洗涤，4-7℃保存。

(3)将步骤(2)中的湿的活化的载体与青霉素酰化酶酶液按1：1～1：4(g/mL)的比例，加入到10-20ml的pH为7.6～8.1的0.1～0.25M的磷酸盐缓冲液中，室温低速搅拌12～24小时，产物用相同条件下的磷酸盐缓冲液冲洗，4～7℃保存。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在所述的硅烷偶联剂包括γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷或γ-氯丙基三乙氧基硅烷。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在所述的活化交联剂包括：戊二醛、N，N-碳酰二咪唑、溴化氰或1，4-二缩水甘油醚。

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