CN102475691A - 海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用 - Google Patents

海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品，其特征在于微胶囊产品为粒径10-2000微米的球形微胶囊，其结构分为微胶囊膜与内核两部分，其中，微胶囊膜由海藻酸盐、壳聚糖、壳聚糖酰基衍生物通过层层自主装形成聚电解质复合水凝胶膜，内核为含有生物活性物质的液体或水凝胶环境。这种微胶囊产品主要用于细胞移植、细胞培养、蛋白、核酸等生物活性物质的包埋载体。

Description

海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种微胶囊产品，具体地说是一种用于生物活性物质包埋的海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品。
背景技术
20世纪60年代，Chang报道了半透膜微胶囊，指出用其包埋蛋白质、酶等生物活性物质和细胞，可保持生物物质活性[Chang TMS.Semipermeablemicrocapsules，Science，1964，146：524-525]。20世纪80年代初，Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾病(如糖尿病)，成功制备了海藻酸钠/α-聚赖氨酸(alginate/α-polylysine)半透膜微胶囊(简称α-APA微胶囊)，包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis大鼠体内，分泌释放胰岛素以调控血糖量[Lim F，Sun A M.Microencapsulated isletsbioartificial endocrine pancreas，Science，1980，210：908-910]。由此推动了微囊化技术相关材料和制备方法研究的快速发展，在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医学领域的临床前研究中得到广泛应用[Wang W，Liu XD，Ma XJ，et al.Microencapsulation using natural polysaccharides for drugdelivery and cell implantation，J.Mater.Chem.，2006，16：3252-3267]。在众多的生物微胶囊中，海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊使用较多，但由于聚赖氨酸价格昂贵(300-400US$/g)，加之材料固有的生物相容性差，具有一定毒性，这极大地限制了海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊在临床上的应用[Strand B L，Ryan TL，Veld P I，et al.Cell Transplant.，2001，10：263-275]。壳聚糖是取自天然的多糖材料，因其成本低，成膜性能好，膜机械强度高，而被研究者看好用于聚赖氨酸替代品，用于细胞包埋用微胶囊的制备[L.Baruch，M.Machluf，Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation：Effecton mechanical properties and on long-term viability，Biopolymers 82(2006)：570-579]。但现有用于细胞包埋的壳聚糖微胶囊因其具有很大的表面粗糙度和表面电荷，导致移植体内后易引起蛋白吸附，进一步激发机体纤维化反应。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊及其制备和应用。
技术方案：
本发明将酰基化修饰的壳聚糖用于生物微胶囊的制备，发明了一种新型的用于生物活性物质包埋的海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物聚电解质络合微胶囊产品，在保证微胶囊强度和免疫隔离性能的前提下，解决表面粗糙度和表面电荷的问题。本发明的微胶囊产品，微胶囊结构分为微胶囊膜与内核两部分：其中，微胶囊膜由壳聚糖、海藻酸盐、壳聚糖酰基衍生物形成的聚电解质复合水凝胶膜，内核为含有细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶环境。
本发明的微胶囊产品为粒径10-2000微米的球形微胶囊；膜厚度在0.1-100微米，组成膜的海藻酸盐分子量10kDa～2000kDa(例如：50kDa-200kDa；200kDa-500kDa；600kDa-1000kDa；1000kDa-2000kDa)，壳聚糖材料的脱乙酰度70-98％，分子量为1KDa～500KDa(例如：1kDa-50kDa；10kDa-100kDa；120kDa-300kDa；350kDa-500kDa)，壳聚糖酰基衍生物分子量1KDa～800KDa(例如：1kDa-50kDa；10kDa-100kDa；120kDa-300kDa；350kDa-500kDa)，壳聚糖、海藻酸盐、壳聚糖酰基衍生物三者质量比为0∶1∶0.1-10∶1∶10，内核中海藻酸盐浓度在1-50g/L，内核中细胞占据内核的体积百分比为10-98％。
微胶囊产品中的壳聚糖酰基衍生物为N-酰基化壳聚糖，其单体结构式为：
Figure BSA00000367772500021
其中，-R代表甲酰、乙酰、丙酰、丁酰、戊酰、己酰，酰基衍生物的取代度10-60％，壳聚糖骨架材料的分子量为1-400KDa，脱乙酰度为90-98％。
微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐。
微胶囊产品的内核中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌中的一种或二种以上的海藻酸盐水凝胶，海藻酸盐溶液为海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
微胶囊产品中微胶囊膜由壳聚糖、海藻酸盐、壳聚糖酰基衍生物通过聚电解质络合反应形成水凝胶膜，产品的制备步骤为：
1)制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
2)将步骤1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.1-1.5g/L；
3)将步骤2)中的B微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中(海藻酸盐浓度为0.1-5g/L)，B微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到的微胶囊为C微球，取出用生理盐水洗涤；
4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为D微球，取出用生理盐水洗涤；
5)将步骤1)或2)或3)或4)中的A或B或C或D微球浸入到壳聚糖酰基衍生物溶液中，微球与壳聚糖酰基衍生物溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到内部凝胶核心的微胶囊，称之为E微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖酰基衍生物的配制方法是：壳聚糖酰基衍生物溶于生理盐水、HEPES缓冲液、PBS缓冲液，或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖酰基衍生物浓度为0.1-20g/L；
6)将步骤5)中的E微球浸入到碱金属海藻酸盐溶液中，重复步骤3)，得到表面中和的内部凝胶核心的微胶囊为F微球；
7)将步骤6)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊为G微球。
海藻酸盐凝胶微球为二价金属钙、钡或锌中的一种或二种以上海藻酸盐水凝胶；
用于中和表面电荷的碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐，分子量分布为10KDa～2000KDa，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L。
参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。
本发明的微胶囊产品用于细胞的包埋。
其中，细胞为人或哺乳动物来源的离体的胰岛细胞、肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞具有分泌生物活性物质功能的细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞；
本发明的有益效果：
1、与传统的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊(APA微胶囊)和海藻酸钠-壳聚糖微胶囊(ACA微胶囊)相比，本发明的这种新型海藻酸盐-壳聚糖-壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品，其微胶囊膜的表面粗糙度显著低于APA微胶囊和ACA微胶囊，显示出更佳的生物相容性。
2、本发明产品的微胶囊膜在保持优良生物相容性的同时，兼顾了优越的膜强度，能保证作为组织细胞移植、细胞培养应用过程中膜的完整性。
3、本发明产品的微胶囊膜具有优越的免疫隔离性能，用于异种组织细胞移植时，能保持免疫隔离性能，即微囊内包埋的细胞不能出微胶囊，微囊外的抗体分子、补体分子、免疫细胞不能进入微胶囊内杀死细胞，同时细胞代谢分泌的活性成分能自由进出微胶囊。
4、本发明产品的制备过程条件温和，壳聚糖酰基衍生物可溶于生理盐水中，有利于细胞的活性保持。
附图说明
图1为实施例1和比较例1及比较例2中海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物(AC乙酰)膜及AC膜、AP膜的表面粗糙度比较结果。
图2为实施例1中新型海藻酸盐-壳聚糖-壳聚糖酰基衍生物微胶囊产品小鼠腹腔移植1个月后回收的微胶囊光学照片(图中标尺为100μm)。
图3为比较例1中传统的ACA微胶囊小鼠腹腔移植1个月后回收的微胶囊光学照片(图中标尺为100μm)。
具体实施方式
形成海藻酸盐凝胶微球的方式为静电液滴法(参考文献：In Vivo Culture ofEncapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition.HumanGene Therapy.2007，18：474-481)、锐孔挤出法(参考文献：一种高经济鱼类微球开口饵料的制备方法，中国发明专利，200510136769.7)、乳化-外部凝胶化法(参考文献：Preparation of lactic acid bacteria-enclosing alginate beads in emulsion system：effect of preparationparameters on bead characteristics，Polym.Bull.，2009，63：599-607)、乳化-内部凝胶化法(参考文献：乳化-内部凝胶化工艺制备固定化酵母微胶囊，化工学报，2009，60(3)：710-717)或膜乳化法(参考文献：Preparation of uniform calcium alginate gel beads by membrane emulsificationcoupled with internal gelation。Journal ofApplied Polymer Science，2003，87(5)：848-852)。
实施例1
1)无菌条件下通过高压静电法制备海藻酸钙凝胶微球。
2)将微球浸入乙酰基改性壳聚糖溶液中(壳聚糖骨架分子量50kDa，乙酰基取代度40％，溶液由生理盐水配制，浓度5g/L)，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成AC乙酰A微胶囊。
3)制备成的AC乙酰A聚电解质络合膜用表面轮廓仪测定膜的表面粗糙度，结果显示膜表面粗糙度最小42±9nm，明显低于同样方法制备的比较例中的APA膜和ACA膜(见图1)
4)将AC乙酰A微胶囊用注射器植入小鼠腹腔，一个月后回收，发现生理盐水冲洗小鼠腹腔即可冲刷下来，微胶囊具有良好强度，无破损，微胶囊表面光滑，表面无纤维化包裹现象(见图2)。
比较例1
1)将实施例1中制备的海藻酸钙凝胶微球浸入壳聚糖溶液中(壳聚糖分子量50kDa，脱乙酰度95％，壳聚糖溶于pH为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为5g/L)，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACA微胶囊。
2)制备成的ACA聚电解质络合膜用表面轮廓仪测定膜的表面粗糙度，结果显示膜表面粗糙度为157±20明显高于实施例1结果AC乙酰A聚电解质络合膜(见图1)。
3)将ACA微胶囊用注射器植入小鼠腹腔，一个月后回收，发现生理盐水冲洗小鼠腹腔难以将ACA微胶囊冲刷下来，微胶囊表面呈现明显的纤维化包裹现象(见图3)。
比较例2
1)将实施例1中制备的海藻酸钙凝胶微球浸入聚赖氨酸溶液中(聚赖氨酸分子量20kDa，浓度0.5g/L)，微球与聚赖氨酸溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成APA微胶囊。
2)制备成的APA聚电解质络合膜用表面轮廓仪测定膜的表面粗糙度，结果显示膜表面粗糙度为161±26，明显高于实施例1结果AC乙酰A聚电解质络合膜(见图1)。
实施例2
1)锐孔挤出法制备包埋有猪肝细胞的海藻酸钙凝胶微球，微球中细胞含量5×107/ml微球。
2)将微球先后浸入壳聚糖(壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度90％，壳聚糖溶于pH为6.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为4g/L)和甲酰基改性壳聚糖(壳聚糖骨架分子量60kDa，甲酰基取代度30％，溶于pH为6.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为4g/L)溶液中，微球与溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACC甲酰A微胶囊。
3)制备成的包埋有猪肝细胞的ACC甲酰微胶囊制备成体外人工肝系统，用于肝衰狗的动物模型，结果显示，移植4天后，肝衰小鼠的谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平均恢复到正常水平，血氨指标恢复正常，狗的肝衰症状得以纠正，ACC甲酰A微胶囊在人工肝系统保持形态完整，血液灌流后未发现蛋白吸附现象。
实施例3
1)高压静电法制备包埋有猪胰岛细胞的海藻酸钙凝胶微球，每个微球中含有1-2个胰岛。
2)将微球先后浸入壳聚糖(壳聚糖分子量40kDa，脱乙酰度98％，壳聚糖溶于pH为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5g/L)，0.2％海藻酸钠溶液和乙酰基改性壳聚糖(壳聚糖骨架分子量60kDa，乙酰基取代度50％，溶于生理盐水中，浓度5g/L)溶液中，微球与溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，55mM柠檬酸钠液化后，生理盐水洗涤，制备成ACC乙酰A微胶囊。
3)制备成的ACC乙酰A微胶囊用于糖尿病大鼠模型的细胞治疗，通过腹腔移植，大鼠血糖水平在移植后1天即恢复正常水平，糖尿病症状得以显著改善，体内移植6个月后回收，发现微胶囊完整，微胶囊表面光滑，表面无纤维化包裹现象，且微囊内胰岛细胞保持胰岛素双硫腙染色阳性。
实施例4
1)高压静电法制备包埋有大鼠甲状腺细胞的海藻酸钙凝胶微球，微球中细胞含量3×107/ml微球。
2)将微球先后浸入壳聚糖(壳聚糖分子量100kDa，脱乙酰度95％，壳聚糖溶于pH为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5g/L)和丙酰基改性壳聚糖(壳聚糖骨架分子量20kDa，丙酰基取代度40％，溶于PBS缓冲液中，浓度5g/L)溶液中，微球与溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，55mM柠檬酸钠液化后，生理盐水洗涤，制备成ACC丙酰A微胶囊。
3)制备成的包埋有大鼠甲状腺细胞的ACC丙酰A微胶囊用于异种大鼠甲低模型三角肌移植，疾病大鼠的甲低症状得以纠正，T3，T4水平恢复正常，ACC丙酰A微胶囊移植三个月后回收，回收到形态保持完整的ACC丙酰A微胶囊，表面没有纤维化现象。
实施例5
1)高压静电法制备包埋有牛肾上腺髓质细胞的海藻酸钙凝胶微球，微球中细胞含量2×107/ml微球。
2)将微球先后浸入壳聚糖(壳聚糖分子量10kDa，脱乙酰度90％，壳聚糖溶于pH为6.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5g/L)和丁酰基改性壳聚糖(壳聚糖骨架分子量10kDa，丙酰基取代度30％，溶于，壳聚糖溶于pH为6.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5g/L)溶液中，微球与溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，55mM柠檬酸钠液化后，生理盐水洗涤，制备成ACC丁酰A微胶囊。
3)制备成的包埋有牛肾上腺髓质细胞的ACC丁酰A微胶囊用于帕金森疾病模型猴的颅内定点移植，疾病猴的偏瘫等帕金森症状得以纠正，ACC丁酰A微胶囊移植六个月后回收，回收到形态保持完整的ACC丁酰A微胶囊，表面没有纤维化现象。
实施例6
1)高压静电法制备包埋有牛肾上腺髓质细胞的海藻酸钙凝胶微球，微球中细胞含量1×107/ml微球。
2)将微球先后浸入壳聚糖(壳聚糖分子量70kDa，脱乙酰度98％，壳聚糖溶于pH为6.3的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5g/L)，0.2％海藻酸钠溶液和戊酰基改性壳聚糖(壳聚糖骨架分子量20kDa，戊酰基取代度40％，溶于HEPES缓冲液中，浓度5g/L)溶液中，微球与溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACC戊酰A微胶囊。
3)制备成的包埋有牛肾上腺髓质细胞的ACC戊酰A微胶囊用于顽固性疼痛模型大鼠的脊髓蛛网膜下腔移植，疾病大鼠的疼痛症状得以纠正，肢体抽动次数显著降低，ACC戊酰A微胶囊移植六个月后回收，回收到形态保持完整的ACC戊酰A微胶囊，表面没有纤维化现象。
实施例7
1)高压静电法制备包埋有重组血管内皮细胞生长抑制因子(endostatin)的CHO细胞的海藻酸钙凝胶微球，微球中细胞含量5×107/ml微球。
2)将微球先后浸入含有壳聚糖(壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度92％，壳聚糖溶于pH为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为5g/L)和己酰基改性壳聚糖(壳聚糖骨架分子量20kDa，己酰基取代度50％，溶于生理盐水中，浓度5g/L)溶液中，微球与溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后再与0.2％海藻酸钠溶液反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACC己酰A微胶囊。
3)制备成的包埋有重组endostatin的CHO细胞的ACC己酰A微胶囊用于黑色素瘤模型鼠的腹腔移植，疾病大鼠的肿瘤明显缩小，ACC己酰A微胶囊移植两个月后回收，回收到形态保持完整的ACC己酰A微胶囊，表面没有纤维化现象。

Claims (10)

1.海藻酸盐-壳聚糖酰基衍生物微胶囊，其特征在于：微胶囊结构分为微胶囊膜与内核两部分：其中，微胶囊膜由壳聚糖、海藻酸盐、壳聚糖酰基衍生物形成的聚电解质复合水凝胶膜，内核为含有细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶环境。
2.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品为粒径10-2000微米的球形微胶囊；膜厚度在0.1-100微米，组成膜的海藻酸盐分子量10kDa～2000kDa，壳聚糖材料的脱乙酰度70-98％，分子量为1KDa～500KDa，壳聚糖酰基衍生物分子量1KDa～800KDa，壳聚糖、海藻酸盐、壳聚糖酰基衍生物三者质量比为0∶1∶0.1-10∶1∶10；内核中海藻酸盐浓度在1-50g/L。
3.按照权利要求1或2所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品中的壳聚糖酰基衍生物为N-酰基化壳聚糖，其单体结构式为：
Figure FSA00000367772400011
其中，-R代表甲酰、乙酰、丙酰、丁酰、戊酰或己酰，酰基衍生物的取代度10-60％，壳聚糖骨架材料的分子量为1-400KDa，脱乙酰度为90-98％。
4.按照权利要求1或2所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐。
5.按照权利要求1或2所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品的内核中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌中的一种或二种以上的海藻酸盐水凝胶，海藻酸盐溶液为海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
6.一种权利要求1所述微胶囊的制备方法，其特征在于：微胶囊膜由壳聚糖、海藻酸盐、壳聚糖酰基衍生物通过聚电解质络合反应形成水凝胶膜，产品的制备步骤为：
1)制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
2)将步骤1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
3)将步骤2)中的B微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中(海藻酸盐浓度为0.1-5g/L)，B微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到的微胶囊为C微球，取出用生理盐水洗涤；
4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为D微球，取出用生理盐水洗涤；
5)将步骤1)或2)或3)或4)中的A或B或C或D微球浸入到壳聚糖酰基衍生物溶液中，微球与壳聚糖酰基衍生物溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到内部凝胶核心的微胶囊，称之为E微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖酰基衍生物的配制方法是：壳聚糖酰基衍生物溶于生理盐水、HEPES缓冲液、PBS缓冲液，或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖酰基衍生物浓度为0.1-20g/L；
6)将步骤5)中的E微球浸入到碱金属海藻酸盐溶液中，重复步骤3)，得到表面中和的内部凝胶核心的微胶囊为F微球；
7)将步骤6)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊为G微球。
7.按照权利要求6所述微胶囊的制备方法，其特征在于：海藻酸盐凝胶微球为二价金属钙、钡或锌中的一种或二种以上的海藻酸盐水凝胶；
步骤3)和6)用于中和表面电荷的碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐，分子量分布为10KDa～2000KDa，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L。
8.按照权利要求6所述微胶囊的制备方法，其特征在于：参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。
9.一种权利要求1所述的微胶囊用于细胞的包埋。
10.按照权利要求9所述的微胶囊用于细胞的包埋，其特征在于：所述细胞为人或哺乳动物来源的离体的胰岛细胞、肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞具有分泌生物活性物质功能的细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞。
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