CN115137884B - 一种用于神经损伤修复的可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于神经损伤修复的可注射水凝胶及其制备方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种用于神经损伤修复的可注射水凝胶及其制备方法，所述可注射水凝胶以添加有胶原、RGD、AbCripto‑1和干细胞的海藻酸钠基水凝胶为囊芯，以含有MMP底物的壳聚糖‑海藻酸钠复合水凝胶为隔离微囊膜，其中，囊芯材料模拟干细胞微环境，促进干细胞定向分化，隔离微囊膜延迟干细胞释放并抵御机体的炎症反应，有效提高了移植干细胞在机体内的成活率，因此，所述可注射水凝胶在神经损伤修复中极具应用前景。

Description

一种用于神经损伤修复的可注射水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于神经损伤修复的可注射水凝胶及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
中枢神经系统(Central Nerve System,CNS)由脑和脊髓组成(脑和脊髓是各种反射弧的中枢部分)，是人体神经系统的最主体部分。中枢神经系统接受全身各处的传入信息，经它整合加工后成为协调的运动性传出，或者储存在中枢神经系统内成为学习、记忆的神经基础。人类的思维活动也是中枢神经系统的功能。
中枢神经系统损伤会导致各神经支配区域出现功能障碍。根据受损部位和受损程度的不同，患者会产生半身不遂、半身肢体麻木等典型运动系统症状，肢体肌张力减弱、肌力下降或消失、肢体痛觉、温度觉等典型感觉系统症状，视力下降、视野缺损等视觉系统症状。严重的中枢神经系统损伤，还可能导致患者出现植物状态。
由于中枢神经难以再生，到目前为止，中枢神经系统损伤仍未找到合理的解决办法，而间充质干细胞、诱导性多能干细胞和神经干细胞等干细胞因具有再生和分化潜能为中枢神经再生提供了可能。因此，使用干细胞移植修复神经损伤以治疗中枢神经系统损伤引起广泛关注。
但是，由于移植的干细胞缺乏细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用引起的细胞凋亡和移植后的机体的炎症反应造成的细胞死亡，导致移植的干细胞在移植后几天内成活率大幅降低，这严重影响了干细胞移植在治疗中枢神经系统损伤中的应用。除移植成活率低以外，移植的干细胞较低的有效分化率也是中枢神经系统损伤的干细胞移植治疗中亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种制备用于神经损伤修复的可注射水凝胶的方法，所述方法包括如下步骤：
囊芯材料的制备：将胶原溶液、RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液、AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液和干细胞悬液混合，得到囊芯材料；
微胶囊的制备：使用微囊发生装置，在电场力的作用下将囊芯材料滴入CaCl2溶液中，得到凝胶微球；将凝胶微球先于壳聚糖溶液中覆膜，再于MMP(基质金属蛋白酶)底物接枝的部分氧化海藻酸钠溶液中覆膜，利用静电吸附作用形成智能海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)囊膜，得到微胶囊；
水凝胶的制备：将微胶囊与甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)溶液混合后固化，得到可注射水凝胶。
在本发明的一种实施方式中，所述微囊发生装置的参数为：电压4～20kV、高度1.5～8cm、注射速度0.001～4mm/s。
在本发明的一种实施方式中，所述微囊发生装置的参数为：电压18kV、高度4cm、注射速度0.01mm/s。
在本发明的一种实施方式中，所述胶原溶液、RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液、AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液和干细胞悬液的混合体积比为1～4:1～4:1～4:1～4。
在本发明的一种实施方式中，所述微胶囊与甲基丙烯酸酰化明胶溶液的混合体积比为1:1～4。
在本发明的一种实施方式中，所述甲基丙烯酸酰化明胶溶液的浓度为5～20g/100mL，氨基取代度为10～60g/100mL，紫外光固化时间为30～300s。
在本发明的一种实施方式中，所述胶原溶液的浓度为0.1～1g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，所述RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1～5g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入RGD至浓度为10～200μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，在反应产物中加入硼氢化钠进行还原，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1～10g/100mL，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入RGD至浓度为100μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，在反应产物中加入硼氢化钠进行还原，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为2g/100mL，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1～5g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入AbCripto-1至浓度为10～200μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，使用硼氢化钠进行还原，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到部分AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1～10g/100mL，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入AbCripto-1至浓度为60μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，使用硼氢化钠进行还原，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到部分AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为2g/100mL，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1～5g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入MMP底物至浓度为10～200μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，使用硼氢化钠进行还原，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1～10g/100mL，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入MMP底物至浓度为100μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，使用硼氢化钠进行还原，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1g/100mL，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述MMP底物为MMP1底物、MMP2底物、MMP9底物或MMP13底物中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述接枝反应的条件为：于2～8℃下反应0.5～1.5h。
在本发明的一种实施方式中，所述接枝反应的条件为：于4℃下反应1h。
在本发明的一种实施方式中，所述硼氢化钠在反应产物中的添加量为0.1～1mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述溶剂为水或生理盐水中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述部分氧化海藻酸钠的制备方法为：将浓度为0.1～0.5M的高碘酸钠溶液和浓度为1～5g/100mL的海藻酸钠溶液按照体积比1～5:100～500混合后进行氧化反应，反应结束后，在反应产物中加入乙二醇终止氧化，得到部分氧化海藻酸钠反应液；将部分氧化海藻酸钠反应液和无水乙醇按照体积比1～5:1～5混合，使得部分氧化海藻酸钠析出；取沉淀溶解并透析后冻干，得到部分氧化海藻酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述部分氧化海藻酸钠的制备方法为：将浓度为0.25M的高碘酸钠溶液和浓度为1g/100mL的海藻酸钠溶液按照体积比1:100混合后进行氧化反应，反应结束后，在反应产物中加入乙二醇终止氧化，得到部分氧化海藻酸钠反应液；将部分氧化海藻酸钠反应液和无水乙醇按照体积比1:1混合，使得部分氧化海藻酸钠析出；取沉淀溶解并透析后冻干，得到部分氧化海藻酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述氧化反应的条件为：冰上、避光、100～500rpm震荡1～5h。
在本发明的一种实施方式中，所述乙二醇在反应产物中的添加量为1～10μL/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述干细胞悬液的浓度为1×105～1×107cell/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述CaCl2溶液的浓度为50～200mM。
在本发明的一种实施方式中，所述壳聚糖溶液的浓度为1～5g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，所述海藻酸钠溶液的浓度为1～5g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，所述海藻酸钠溶液的浓度为1g/100mL。
在本发明的一种实施方式中，所述凝胶微球的粒径为100～200μm。
本发明还提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶由上述方法制得。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种用于神经损伤修复的可注射水凝胶及其制备方法，所述可注射水凝胶以添加有胶原、RGD、AbCripto-1和干细胞的海藻酸钠基水凝胶为囊芯(即凝胶微球)，以含有MMP底物的壳聚糖-海藻酸钠复合水凝胶为隔离微囊膜(即凝胶微球的微胶囊膜)，其中，囊芯中的AbCripto-1能够促进干细胞定向分化，胶原、RGD和海藻酸钠基水凝胶则能够模拟干细胞微环境，隔离微囊膜中的MMP底物能够被干细胞分泌的MMP水解，从而达到延迟干细胞释放的作用，壳聚糖-海藻酸钠复合水凝胶则具有选择透过特性，可以阻挡移植免疫排斥反应的细胞免疫和体液免疫两大效应机制，能够有效的避免机体炎症反应造成移植细胞的死亡，从而起到有效的免疫隔离屏障作用，进而提高移植干细胞在机体内的成活率，因此，所述可注射水凝胶在神经损伤修复中极具应用前景。
进一步的，所述囊芯(即凝胶微球)为使用微囊发生装置(参见公开号为CN106479890A的专利申请文本)制得，微囊发生装置基于高压静电成囊法，使得由胶原溶液、RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液、AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液和干细胞悬液混合而得的囊芯材料能够克服黏滞力和表面张力，呈一定粒径的液滴状落入CaCl2溶液中形成凝胶微球，有助于快速稳定制备粒径均一的凝胶微球，通过控制仪器参数制备特定均一粒径的微球，提高实验的可重复性、确保干细胞的释放时间可控。
进一步的，所述微囊发生装置的参数为：电压4～20kV、高度1.5～8cm、注射速度0.001～4mm/s，此参数下可将快速稳定制备粒径在200μm以内的囊芯(即凝胶微球)，避免粒径过大造成三维支架中心的细胞和支架边沿的细胞由于传质不均匀因素造成研究模型的不科学。
进一步的，所述微囊发生装置的参数为：电压18kV、高度4cm、注射速度0.01mm/s，此参数下制得的囊芯(即凝胶微球)粒径和粒径均一性最佳。
进一步的，所述可注射水凝胶的制备方法使用浓度为1～5g/100mL的海藻酸钠水溶液、在部分氧化海藻酸钠溶液中浓度为10～200μg/mL的MMP底物、在部分氧化海藻酸钠溶液中浓度为10～200μg/mL的RGD和在部分氧化海藻酸钠溶液中浓度为10～200μg/mL的AbCripto-1，此参数下制得的可注射水凝胶具有良好的结构及力学性能，有助于干细胞的迁移和连接，能够实现微环境诱导NSC向神经元的定向分化。
进一步的，所述可注射水凝胶的制备方法使用浓度为1g/100mL的海藻酸钠水溶液和在部分氧化海藻酸钠溶液中浓度为100μg/mL的MMP底物，此参数下制得的可注射水凝胶结构及力学性能最佳。
进一步的，所述可注射水凝胶将微胶囊与浓度为5～20g/100mL的甲基丙烯酸酰化明胶(浓度为5～20g/100mL，氨基取代度为10～60g/100mL，紫外光固化时间为30～300s)水溶液溶液按照体积比1～4:1混合，此参数下制得的可注射水凝胶具有与脑组织相当的力学性能，有利于干细胞分化成神经元，提高有效分化率，而实现向神经元的定向诱导分化。
进一步的，所述可注射水凝胶通过甲基丙烯酸酰化明胶进行紫外光固化，通过控制紫外照射时间控制材料力学性能，操作简单方便。
附图说明
图1：可注射水凝胶用于神经损伤修复的原理示意图。
图2：可注射水凝胶中微胶囊的形态及结构。
图3：不同电压下获得的凝胶微球的粒径。
图4：微囊发生装置的电压对凝胶微球粒径的影响。
图5：不同高度下获得的凝胶微球的粒径。
图6：微囊发生装置的针头高度对凝胶微球粒径的影响。
图7：不同注射速度下获得的凝胶微球的粒径。
图8：微囊发生装置的注射速度对凝胶微球粒径的影响。
图9：不同浓度海藻酸钠制得的海藻酸钠水凝胶的表征结果。图9中，a为浓度1g/100mL海藻酸钠水溶液，b为浓度1.5g/100mL海藻酸钠水溶液，c为浓度2g/100mL海藻酸钠水溶液。
图10：不同浓度MMP底物制得的海藻酸钠水凝胶中干细胞的迁移情况。图10中，a为浓度0μg/mL的MMP底物，b为浓度50μg/mL的MMP底物，c为浓度100μg/mL的MMP底物。
图11：神经干细胞在可注射水凝胶中的分化细胞形态。图11中，a为600×，b为1200×，c为4000×。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，对本发明进行进一步的阐述。
实施例1：一种可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶的制备方法包括如下步骤：
部分氧化海藻酸钠的制备：将浓度为0.25M的高碘酸钠水溶液和浓度为1g/100mL的海藻酸钠水溶液按照体积比1:100混合后，于冰上、避光、200rpm震荡1h进行氧化反应，反应结束后，在反应产物中以4μL/mL的添加量加入乙二醇终止氧化，得到部分氧化海藻酸钠反应液；将部分氧化海藻酸钠反应液和无水乙醇按照体积比1:1混合，使得部分氧化海藻酸钠析出；取沉淀用超纯水溶解至1g/100mL，得到溶解液；取溶解液于4℃冰箱透析72h后冻干，得到部分氧化海藻酸钠；
RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备：将部分氧化海藻酸钠用水溶解至浓度为1g/100mL，得到部分氧化海藻酸钠水溶液；在部分氧化海藻酸钠水溶液中加入RGD(购自上海源叶生物科技有限公司)至浓度为100μg/mL后，于4℃下接枝反应1h，反应结束后，在反应产物中以0.4mg/mL的添加量加入硼氢化钠进行还原，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液于4℃冰箱透析后冻干，得到部分RGD接枝部分氧化海藻酸钠；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠用水溶解至浓度为2g/100mL，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液；
AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备：将部分氧化海藻酸钠用水溶解至浓度为1g/100mL，得到部分氧化海藻酸钠水溶液；在浓度为1g/100mL的部分氧化海藻酸钠水溶液中加入AbCripto-1(购自Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司)至浓度为60μg/mL后，于4℃下接枝反应1h，反应结束后，在反应产物中以0.4mg/mL的添加量加入硼氢化钠进行还原，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液于4℃冰箱透析后冻干，得到部分AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为2g/100mL，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液；
MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备：将部分氧化海藻酸钠用水溶解至浓度为1g/100mL，得到部分氧化海藻酸钠水溶液；在浓度为1g/100mL的部分氧化海藻酸钠水溶液中加入MMP2/9底物(购自金斯瑞生物科技股份有限公司)至浓度为100μg/mL后，于4℃下接枝反应1h，反应结束后，在反应产物中以0.4mg/mL的添加量加入硼氢化钠进行还原，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液于4℃冰箱透析后冻干，得到部分MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1g/100mL，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液；
囊芯材料的制备：将胶原(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)用水溶解至浓度为0.2g/100mL，得到胶原水溶液；将C57BL/6小鼠神经干细胞用神经干细胞完全培养基(购自Gibco公司)溶解至细胞浓度为1×106cell/mL，得到干细胞悬液；将胶原水溶液、RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液、AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液和干细胞悬液按照体积比1:1:1:1混合，得到囊芯材料；
微胶囊的制备：使用微囊发生装置(参见公开号为CN106479890A的专利申请文本)，在电压18kV、针头高度4cm(此处针头高度是指针头距离负极板的高度)、注射速度0.01mm/s的条件下将囊芯材料滴入浓度为100mM的CaCl2水溶液中，得到凝胶微球；将凝胶微球先用无菌生理盐水清洗3遍，然后于浓度为1g/100mL的壳聚糖水溶液中覆膜，再用无菌生理盐水清洗3遍，最后于MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液中覆膜，得到微胶囊；
水凝胶的制备：将甲基丙烯酸酰化明胶(购自苏州永沁泉智能设备有限公司EFL，氨基取代度30％)用水溶解至浓度为5g/100mL，得到甲基丙烯酸酰化明胶水溶液；将微胶囊与甲基丙烯酸酰化明胶水溶液溶液按照体积比1:1混合后，用紫外光固化30s，得到可注射水凝胶(可注射水凝胶用于神经损伤修复的原理见图1)。
使用荧光显微镜观察可注射水凝胶中的微胶囊，观察结果见图2。由图2可知，可注射水凝胶中的微胶囊大小均一，粒径小于200μm，微胶囊中心的和边沿的细胞传质均匀，营养物质能够传递进入微胶囊中心，微囊膜清晰可见，具有免疫隔离作用，可以有效阻止炎症细胞对干细胞的攻击，使其躲避机体的炎症反应。
实施例2：一种可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶的制备方法为在实施例1的基础上，将微囊发生装置的电压分别调节为4kV、5kV、6kV、7kV、8kV、9kV、10kV、12kV、14kV、16kV、18kV、20kV。
使用显微镜观察凝胶微球并统计凝胶微球的粒径，观察及统计结果见图3～4。由图3～4可知，随着电压的升高，微球粒径呈现梯度变化，4～6kV时粒径急速缩小，7～14kV时粒径在400μm左右，16～20kV时粒径在200μm以内。考虑到粒径在200μm以内可以避免粒径过大造成三维支架中心的细胞和支架边沿的细胞由于传质不均匀因素造成研究模型的不科学，应选择16～20kV。
实施例3：一种可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶的制备方法为在实施例1的基础上，将微囊发生装置的针头高度分别调节为1.5cm、1.6cm、1.7cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm。
使用显微镜观察凝胶微球并统计凝胶微球的粒径，观察及统计结果见图5～6。由图5～6可知，高度对微球粒径的影响主要在1.5～2cm之间，此时的微球粒径差异较大，不够均一，2～8cm时，高度对于粒径的影响较小，且此时微球粒径不会再有显著减小。考虑到粒径的均一性，应选择2～8cm。
实施例4：一种可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶的制备方法为在实施例1的基础上，将微囊发生装置的注射速度分别调节为0.001mm/s、0.005mm/s、0.01mm/s、0.02mm/s、0.04mm/s、0.06mm/s、0.08mm/s、0.1mm/s、0.2mm/s、0.4mm/s、0.8mm/s、1mm/s、2mm/s、4mm/s。
使用显微镜观察凝胶微球并统计凝胶微球的粒径，观察及统计结果见图7～8。由图7～8可知，注射速度越大，微球粒径也越大，其中在0.001～0.4mm/s之间，微球粒径变化较小且粒径较均一，在400μm左右，0.8～4mm/s之间，粒径显著增加，微球粒径差异较大。考虑到粒径均一有利于提高实验的可重复性、确保干细胞的释放时间可控，应选择0.001～0.4mm/s。
实施例5：一种可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶的制备方法为在实施例1的基础上，将海藻酸钠水溶液的浓度分别调节为1g/100mL、1.5g/100mL、2g/100mL。
使用扫描电子显微镜观察海藻酸钠水凝胶的结构及孔径大小，观察结果见图9。由图9可知，使用浓度1g/100mL的海藻酸钠水溶液制得的可注射水凝胶孔径较小，有利于神经干细胞的增殖分化。
实施例6：一种可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶的制备方法为在实施例1的基础上，将MMP底物接枝在部分氧化海藻酸钠溶液中的浓度分别调节为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。
使用显微镜观察海藻酸钠水凝胶中干细胞的迁移情况，观察结果见图10。由图10可知，MMP底物在海藻酸钠溶液中的浓度为100μg/mL时，细胞迁移数目最多，效果最佳。
实验例1：一种可注射水凝胶的分化性能实验
本实验例提供了一种可注射水凝胶的分化性能实验，实验过程为：将实施例1制得的可注射水凝胶放入CO2培养箱中，于37℃、CO2浓度5％(v/v)的条件下进行培养，培养2周后，采用4g/100mL多聚甲醛固定，置于4℃冰箱放置14h后生理盐水清洗3次，清洗结束后，放入液氮中急速冷冻并利用冻干机冻干，冻干结束后，使用扫描电子显微镜观察可注射水凝胶中神经干细胞之间的连接，观察结果见图11。由图11可知，可注射水凝胶中干细胞之间的连接清晰，并分化成典型的神经元形态。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种制备用于神经损伤修复的可注射水凝胶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
囊芯材料的制备：将胶原溶液、RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液、AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液和干细胞悬液混合，得到囊芯材料；
微胶囊的制备：使用微囊发生装置，在电场力的作用下将囊芯材料滴入CaCl2溶液中，得到凝胶微球；将凝胶微球先于壳聚糖溶液中覆膜，再于MMP底物接枝的部分氧化海藻酸钠溶液中覆膜，得到微胶囊；
水凝胶的制备：将微胶囊与甲基丙烯酸酰化明胶溶液混合后固化，得到可注射水凝胶；
所述微囊发生装置的参数为：电压16～20kV、高度2～8cm、注射速度0.001～4mm/s；
所述胶原溶液、RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液、AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液和干细胞悬液的混合体积比为1～4:1～4:1～4:1～4；
所述微胶囊与甲基丙烯酸酰化明胶溶液的混合体积比为1:1～4；
所述RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1～5g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入RGD至浓度为10～200μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，在反应产物中加入硼氢化钠进行还原，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠；将RGD接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1～10g/100mL，得到RGD接枝部分氧化海藻酸钠溶液；
所述AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1～5g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入AbCripto-1至浓度为10～200μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，使用硼氢化钠进行还原，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到部分AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠；将AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1～10g/100mL，得到AbCripto-1接枝部分氧化海藻酸钠溶液；
所述MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液的制备方法为：在浓度为1～5g/100mL的部分氧化海藻酸钠溶液中加入MMP底物至浓度为10～200μg/mL后进行接枝反应，反应结束后，使用硼氢化钠进行还原，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠反应液透析后冻干，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠；将MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠用溶剂溶解至浓度为1～10g/100mL，得到MMP底物接枝部分氧化海藻酸钠溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微囊发生装置的参数为：电压18kV、高度4cm、注射速度0.01mm/s。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述部分氧化海藻酸钠的制备方法为：将浓度为0.1～0.5M的高碘酸钠溶液和浓度为1～5g/100mL的海藻酸钠溶液按照体积比1～5:100～500混合后进行氧化反应，反应结束后，在反应产物中加入乙二醇终止氧化，得到部分氧化海藻酸钠反应液；将部分氧化海藻酸钠反应液和无水乙醇按照体积比1～5:1～5混合，使得部分氧化海藻酸钠析出；取沉淀溶解并透析后冻干，得到部分氧化海藻酸钠。
4.一种可注射水凝胶，其特征在于，所述可注射水凝胶由权利要求1～3任一项所述的方法制得。
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