CN113181428B - 脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及再生医学技术领域，特别是涉及一种脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法。所述脊髓损伤修复材料按照重量份数计，包括：高分子材料10～40份、脊髓生物材料5～20份、水凝胶10～20份、药物0～5份。本发明的脊髓损伤修复材料，通过使用聚己内酯作为高分子材料纤维，聚己内酯与水凝胶材料作为原料一样容易得到，通过聚己内酯制备的微米纤维成型墨水配制简单，可原位负载调控神经元干细胞分化的药物，且脱脊髓细胞生物材料能够为神经干细胞提供相近的生长环境，以延长神经干细胞的存活时间，引导并促进神经干细胞向神经元细胞分化，制备的组织工程支架重复性较好。

Description

脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法
技术领域
本发明涉及再生医学技术领域，特别是涉及一种脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法。
背景技术
脊髓损伤是一种高致残性疾病，多由于直接或间接创伤造成，表现为截瘫即损伤节段以下感觉、运动和括约肌功能障碍等一系列临床表现。常常给患者生活带来毁灭性的打击，而脊髓再生障碍造成功能恢复困难，对个人和社会造成巨大的负担。
目前的脊髓损伤防治研究重点在减轻继发性损伤，缩短病程，减少损伤面积的进一步扩大，为轴突再生创造良好的微环境，促进轴突的生长或抑制胶质瘢痕的形成。用于脊髓损伤修复的材料较多，包括天然生物材料及人工合成材料，选用材料均具有组织相溶性，将生物材料制作成支架用来支撑、促进神经干分化、轴突再生。对神经干细胞的分化有积极影响，能改善脊髓神经功能。但存在神经干细胞存活时间短、成团生长等难题，成为脊髓修复的障碍。因此，采用先进的材料制备工艺、选择能改善脊髓损伤后微环境的材料和调控神经干细胞分化的药物三者之间的相互关系，建构促进脊髓损伤后修复的调控平台，有效促进神经干细胞分化、轴突再生的组织工程模型具有十分重要的理论意义，可为解释脊髓损伤治疗的生物学本质提出新的思路，这对最终临床转化治疗脊髓损伤也有至关重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：现有的用于脊髓损伤修复的材料存在神经干细胞存活时间短、成团生长的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脊髓损伤修复材料，按照重量份数计，包括以下组分：高分子材料10～40份、脊髓生物材料5～20份、水凝胶10～20份、药物0～5份。
优选的，所述高分子材料为聚己内酯（简写为PCL）。
优选的，所述脊髓生物材料为脱细胞脊髓（简写为ASC），脊髓生物材料可以为大鼠、小鼠、兔子、猪、牛、羊等动物的脊髓制备的脱细胞脊髓。其中，将脊髓经冰融、化学萃取去除脊髓内细胞，保留脊髓细胞外基质，其成分含多种蛋白，如胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖等，通过上述多种蛋白和氨基聚糖促进神经干细胞的生长、增殖、分化；脊髓生物材料不仅可以支持脊髓神经再生，而且还含有大量信号分子，积极参与调控神经细胞的生长、迁移和代谢再生。
优选的，所述水凝胶包括水、甲基丙烯酰化明胶（GeLMA）、双键-β-环糊精、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和光引发剂（LAP），其中水：甲基丙烯酰化明胶（GeLMA）：双键-β-环糊精：聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）：光引发剂（LAP）的配比为100份：12份：8份：1份：0.1份，经300～400nm紫外光（UV）照射5～15分钟制成水凝胶。
优选的，所述药物为可促进神经干细胞分化、轴突再生药物WAY316606。
本发明还提供一种脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备定向的微米纤维：高分子材料，即聚己内酯制成高分子材料溶液，混合均匀得到微米纤维成型墨水，将所述微米纤维成型墨水转移至3D打印设备中采用静电纺丝技术打印出方向相同的微米纤维，以通过相同方向的微米纤维引导神经干细胞定向生长、增殖，起到桥引的作用，避免神经细胞成团生长；这里的方向相同是指微米纤维可以打印成同为水平方向或者同为竖直方向，或者同为弧形方向，以便打印不同需求的脊髓损伤修复组织工程支架；
S2、制备脱细胞脊髓支架：将取到的脊髓经冰融、化学萃取法脱去脊髓细胞，保留脊髓细胞外基质的天然成分，如胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖等得到脊髓生物材料，即脊髓脱细胞支架，将脊髓生物材料在冰冻干燥机内干燥24～48小时，取出后置入-20～-80℃的冰箱中冰冻保存；
其中，制备脱细胞脊髓支架具体操作步骤如下：
①将动物的脊髓在-75～85℃的冰箱冷冻1小时，然后室温解冻，通过解冻让脊髓内的神经细胞裂解，以便通过化学萃取除掉脊髓内的脊髓细胞，只保留细胞外基质部分：
②浸入蒸馏水中浸泡6h，每2小时换液（蒸馏水）一次：
③将脊髓放入wt1％的TritonX-100磷酸缓冲液中，室温下连续振荡萃取3h(25摄氏度，100r／min)；
④蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液（蒸馏水）一次；
⑤wt1％的脱氧胆酸钠缓冲液中室温下连续振荡萃取3h；
⑥蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液（蒸馏水）一次；
⑦将脊髓放入wt1％的TritonX-100磷酸缓冲液中，室温下连续振荡萃取3h(25摄氏度，100r／min)；
⑧蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液（蒸馏水）一次；
⑨脊髓去细胞置于冷冻干燥机内冷冻干燥24～48h，制得脱细胞脊髓支架。
S3、制备水凝胶：将水、甲基丙烯酰化明胶（GeLMA）、双键-β-环糊精、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和光引发剂（LAP），经300～400nm紫外光（UV）照射5～15分钟制成水凝胶；
S4、制备载药脱细胞脊髓水凝胶：将所述脊髓脱细胞支架剪碎，按比例加入蒸馏水，充分振荡，使所述脊髓脱细胞支架溶解于蒸馏水中形成乳白色的脊髓脱细胞支架溶液；向所述脊髓脱细胞支架溶液中按比例加入水凝胶和药物WAY316606，充分振荡混匀，形成载药脊髓脱细胞支架水凝胶；
S5、制备载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架：将所述载药脊髓脱细胞支架水凝胶填充到 3D 打印方向相同的微米纤维上，打印方向相同的微米纤维即微米纤维的纤维束均朝向同一个方向，随后将打印方向相同的微米纤维制成似脊髓圆柱形，置入密闭空间内经300～400nm紫外光（UV）照射5～15分钟紫外线照射固化，得到载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架，固化后的所述复合支架经消毒后备用，即得脊髓损伤修复组织工程支架。
优选的，所述脊髓损伤修复组织工程支架成品的孔隙率为40～95%，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的脊髓损伤修复材料，通过使用聚己内酯作为高分子材料纤维，聚己内酯与水凝胶材料作为原料一样容易得到，通过聚己内酯制备的微米纤维成型墨水配制简单，可原位负载调控神经元干细胞分化的药物，且脱脊髓细胞生物材料能够为神经干细胞提供相近的生长环境，以延长神经干细胞的存活时间，引导并促进神经干细胞向神经元细胞分化，制备的组织工程支架重复性较好；
2、本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，采用的脱细胞脊髓易得，水凝胶配方易于调整，微米纤维成型（即打印）墨水配制简单，制备的组织工程支架可原位负载调控神经干细胞生长的药物；
3、本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，利用3D打印中的静电纺丝技术进行打印成型且后处理无需进行冷冻干燥即可使支架定型，便于制备个性化的组织工程支架；
4、本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法制得的组织工程支架具有定向的特性，可为神经干细胞分化提供“桥梁”，并沿“桥梁”定向生长，解决神经干细胞成团、无序生长的问题；
5、本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法制得的组织工程支架中含有天然的细胞外基质，有利于神经干细胞的分化。
附图说明
图1是本发明的实施例制备的脊髓修复组织工程支架方向相同的微米纤维的目视图，图中所示的是聚己内酯经3D打印静电纺织技术打印制得的微米纤维均呈纵行定向排列。
图2是本发明的实施例制备的脊髓修复组织工程支架中的微米纤维在显微镜下放大40倍的图像，图中可以看出微米纤维的直径为16.27~20.71μm。
图3是本发明实施例制备的脊髓修复组织工程支架的目视图，图中所示的是脊髓修复组织工程支架与脊髓外形相似，呈纵行类圆柱形。
图4是本发明实施例制备的脊髓修复组织工程支架在扫描电子显微镜（SEM）10μm尺度下的放大图，图中所示的是脊髓修复组织工程支架纤维呈纵形定向排列，纤维间粘稠絮状物即为在微米纤维上充满、均匀分布的载药脱细胞脊髓水凝胶。
图5是本发明实施例制备的脊髓修复组织工程支架扫描电子显微镜（SEM）10μm尺度下的放大图，图中所示的黑色点为三维微孔，其余部分为微米纤维和载药脱脊髓水凝胶，从图中可以看出脊髓修复组织工程支架局部呈三维多孔结构，这些三维多孔结构可为神经干细胞生长提供空间。
具体实施方式
下面结合附图1至5和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明充分发挥3D打印在一体化构建梯度结构方面的优势，根据天然脊髓脱细胞生物材料的成分、宏微结构和力学特性差异，选用适当的基材墨水、生长因子以及干细胞负载技术，通过次序低温3D打印和后处理构建成分、宏微结构和力学性能均可精确仿生脊髓损伤一体化修复材料，并借由不同区位原位负载的药物诱导黏附在支架表面或包埋在支架/水凝胶内的干细胞分别向神经干细胞分化，形成具有梯度成分结构和力学性能且界面强度优良的脊髓损伤修复材料。
实施例：如图1所示，本发明实施例优选实施例的一种脊髓损伤修复材料，按照重量份数计，包括以下组分：高分子材料10～40份、脊髓生物材料5～20份、水凝胶10～20份、药物0～5份。所述高分子材料为聚己内酯 （简写为PCL），所述脊髓生物材料为大鼠脱细胞脊髓，所述药物为可促进神经干细胞分化、轴突再生药物WAY316606。所述双交联水凝胶的成分包括水、甲基丙烯酰化明胶（GeLMA）、双键-β-环糊精、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和光引发剂（LAP），其中水：甲基丙烯酰化明胶（GeLMA）：双键-β-环糊精：聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）：光引发剂（LAP）的配比为100份：12份：8份：1份：0.1份，经300～400nm紫外光（UV）照射5～15分钟制成水凝胶。
将上述脊髓损伤修复材料按照本发明的脊髓修复组织工程支架的制备方法制备成脊髓修复组织工程支架成品，包括如下步骤：
S1、制备定向的微米纤维：将高分子材料，即聚己内酯制成高分子材料溶液，混合搅拌均匀得到微米纤维成型墨水，将所述微米纤维成型墨水转移至3D打印设备中采用静电纺丝技术打印出方向相同的微米纤维；
S2、制备大鼠脱细胞脊髓支架：将取到大鼠脊髓经冰融、化学萃取法脱去脊髓细胞，保留细胞外基质天然成分，在冰冻干燥机内干燥24小时，取出后置入-60℃冰箱冰冻保存；
其中，制备脱细胞脊髓支架具体操作步骤如下：
①将动物的脊髓在-80℃的冰箱冷冻1小时，然后室温解冻，通过解冻让脊髓内的神经细胞裂解，以便通过后续的化学萃取步骤除掉脊髓内的脊髓细胞，只保留细胞外基质部分：
②浸入蒸馏水中浸泡6h，每2小时换液（蒸馏水）一次：
③将脊髓放入wt1％的TritonX-100磷酸缓冲液中，室温下连续振荡萃取3h(25摄氏度，100r／min)；
④蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液（蒸馏水）一次；
⑤wt1％的脱氧胆酸钠缓冲液中室温下连续振荡萃取3h；
⑥蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液（蒸馏水）一次；
⑦将脊髓放入wt1％的TritonX-100磷酸缓冲液中，室温下连续振荡萃取3h(25摄氏度，100r／min)；
⑧蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液（蒸馏水）一次；
⑨脊髓去细胞置于冷冻干燥机内冷冻干燥24h，制得脱细胞脊髓支架。
S3、制备水凝胶：将水、甲基丙烯酰化明胶（GeLMA）、双键-β-环糊精、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和光引发剂（LAP），经300～400nm紫外光（UV）照射5～15分钟固化制成水凝胶；
S4、制备载药脱细胞脊髓水凝胶：将所述脊髓脱细胞支架剪碎，按比例加入蒸馏水，用振荡混悬仪充分振荡，使所述脊髓脱细胞支架溶解，形成乳白色的脊髓脱细胞支架溶液；向所述脊髓脱细胞支架溶液中按比例加入水凝胶和按比较加入药物WAY316606，在振荡混悬仪上充分振荡混匀，形成载药脊髓脱细胞支架水凝胶；
S5、制备载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架：将所述载药脊髓脱细胞支架水凝胶填充到 3D 打印方向相同的微米纤维上，随后将打印方向相同的微米纤维制成似脊髓圆柱形，置入密闭空间内紫外线照射固化，得到载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架，固化后的所述复合支架经消毒后备用，即得脊髓损伤修复组织工程支架。
以上制备得到如附图4和5所示的脊髓损伤修复组织工程支架，具有三维多孔、机械强度好、吸水后不易塌陷、细胞黏附性好等优点，支架孔隙率为40～95%，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm；所述组织工程支架成品的框架孔隙率为40～95%，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm。
本发明的脊髓损伤修复材料，通过使用聚己内酯作为高分子材料纤维，聚己内酯与水凝胶材料作为原料一样容易得到，通过聚己内酯制备的微米纤维成型墨水配制简单，可原位负载调控神经元干细胞分化的药物，且脱脊髓细胞生物材料能够为神经干细胞提供相近的生长环境，以延长神经干细胞的存活时间，引导并促进神经干细胞向神经元细胞分化，制备的组织工程支架重复性较好；本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，采用的脱细胞脊髓易得，水凝胶配方易于调整，微米纤维成型（即打印）墨水配制简单，制备的组织工程支架可原位负载调控神经干细胞生长的药物；本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，利用3D打印中的静电纺丝技术进行打印成型且后处理无需进行冷冻干燥即可使支架定型，便于制备个性化的组织工程支架；本发明的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法制得的组织工程支架具有定向的特性，可为神经干细胞分化提供“桥梁”，并沿“桥梁”定向生长，解决神经干细胞成团、无序生长的问题；组织工程支架中含有天然的细胞外基质，有利于神经干细胞的分化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种脊髓损伤修复材料，其特征在于：按照重量份数计，包括以下组分：高分子材料聚己内酯10～40份、脊髓生物材料5～20份、水凝胶10～20份、药物0～5份；
所述高分子材料聚己内酯用于：制备高分子材料溶液，混合均匀得到微米纤维成型墨水，所述微米纤维成型墨水被转移至3D打印设备中采用静电纺丝技术打印出方向相同的微米纤维；
所述脊髓生物材料为脱细胞脊髓；
所述水凝胶是经紫外光UV照射制成的水凝胶；
所述药物用于制备载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架：将所述脱细胞脊髓溶解于蒸馏水中形成脊髓脱细胞支架溶液；向所述脊髓脱细胞支架溶液中按比例加入所述水凝胶和所述药物，形成载药脊髓脱细胞支架水凝胶；将所述载药脊髓脱细胞支架水凝胶填充到所述方向相同的微米纤维上，随后将打印方向相同的微米纤维制成似脊髓圆柱形，置入密闭空间内紫外线照射固化，得到所述载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架。
2.根据权利要求1所述的脊髓损伤修复材料，其特征在于：所述药物为可促进神经干细胞分化、轴突再生药物WAY316606。
3.根据权利要求1所述的脊髓损伤修复材料，其特征在于：所述水凝胶包括水、甲基丙烯酰化明胶GelMA、双键-β-环糊精、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA和光引发剂LAP，其中水：甲基丙烯酰化明胶GelMA：双键-β-环糊精：聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA：光引发剂LAP的配比为100份：12份：8份：1份：0.1份，经300～400nm紫外光UV照射5～15分钟制成水凝胶。
4.一种脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备定向的微米纤维：将聚己内酯制成聚己内酯溶液，混合均匀得到微米纤维成型墨水，将所述微米纤维成型墨水转移至3D打印设备中采用静电纺丝技术打印出方向相同的微米纤维；
S2、制备脱细胞脊髓支架：将取到的脊髓经冰融、化学萃取法脱去脊髓细胞，保留脊髓细胞外基质的天然成分得到脊髓生物材料，即脊髓脱细胞支架，将脊髓生物材料在冰冻干燥机内干燥24～48小时，取出后置入-20～-80℃的冰箱中冰冻保存；
S3、制备水凝胶：将水、甲基丙烯酰化明胶GelMA、双键-β-环糊精、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA和光引发剂LAP，经紫外光UV照射制成水凝胶；
S4、制备载药脱细胞脊髓水凝胶：将所述脊髓脱细胞支架剪碎，按比例加入蒸馏水，充分振荡，使所述脊髓脱细胞支架溶解于蒸馏水中形成乳白色的脊髓脱细胞支架溶液；向所述脊髓脱细胞支架溶液中按比例加入水凝胶和药物WAY316606，充分振荡混匀，形成载药脊髓脱细胞支架水凝胶；
S5、制备载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架：将所述载药脊髓脱细胞支架水凝胶填充到 3D 打印方向相同的微米纤维上，随后将打印方向相同的微米纤维制成似脊髓圆柱形，置入密闭空间内紫外线照射固化，得到载药微米纤维/脱细胞脊髓水凝胶复合支架，固化后的所述复合支架经消毒后备用，即得脊髓损伤修复组织工程支架。
5.根据权利要求4所述的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤S2制备脱细胞脊髓支架的具体操作步骤如下：
①将动物的脊髓在-75～-85℃的冰箱冷冻1小时，然后室温解冻：
②浸入蒸馏水中浸泡6h，每2小时换液一次,所述换液液体为蒸馏水：
③将脊髓放入wt1％的TritonX-100磷酸缓冲液中，以25℃、100r/min的条件连续振荡萃取3h；
④蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液一次,所述换液液体为蒸馏水；
⑤wt1％的脱氧胆酸钠缓冲液中室温下连续振荡萃取3h；
⑥蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液一次,所述换液液体为蒸馏水；
⑦将脊髓放入wt1％的TritonX-100磷酸缓冲液中，以25℃、100r/min的条件连续振荡萃取3h；
⑧蒸馏水振荡漂洗3h，每小时换液一次,所述换液液体为蒸馏水；
⑨将步骤⑧得到的产物置于冷冻干燥机内冷冻干燥24～48h，制得脱细胞脊髓。
6.根据权利要求4所述的脊髓损伤修复组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述脊髓损伤修复组织工程支架成品的孔隙率为40～95%，一级孔径为100～2000μm，次级孔孔径为1～100μm。
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