CN115054568A - 促进脊髓损伤恢复的温敏型水凝胶及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进脊髓损伤恢复温敏型水凝胶及其制备方法，所述温敏型水凝胶由碱性成纤维细胞生长因子、细胞外基质和肝素泊洛沙姆制成的温敏型水凝胶中负载脐带间充质干细胞。本发明创造性地提出将脐带间充质干细胞与bFGF‑ECM‑HP温敏水凝胶联合治疗脊髓损伤，这种新型干细胞联合生长因子及缓释给药系统具有良好的生物相容性、温敏性和神经修复效果，为脊髓损伤的治疗提供了一个具有临床转化应用前景的治疗策略。此外，本发明首次揭示PAK1和SIRT4之间的调节关系，SIRT4在SCI中的线粒体动力学改变的相关性，即，本发明的温敏型水凝胶还可通过激活PAK1/SIRT4改善线粒体功能。

Description

促进脊髓损伤恢复的温敏型水凝胶及制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及促进脊髓损伤恢复温敏型水凝胶及制备方法。
背景技术
脊髓损伤(SCI)是一种中枢神经系统疾病，死亡率和致残率都很高。主要原因在于脊髓损伤后导致极其复杂的病理改变，主要包括直接创伤引起的原发性损伤和微循环障碍引起的继发性损伤以及缺血缺氧炎症反应。其中，最重要的是脊髓损伤后空洞和胶质瘢痕的形成阻碍神经再生，进而严重影响脊髓损伤的治疗。具体而言，随着疾病进展过程中脊髓损伤引发的缺血条件会导致缺氧、葡萄糖供应不足以及线粒体的一系列病理变化，导致线粒体融合减少和分裂增加，严重破坏线粒体产生三磷酸腺苷(ATP)的能力，减少细胞能量供应。而且，活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)的过度产生改变线粒体膜电位(MMP)，激活各种凋亡因子(如Cas 3、BAX)，最终导致功能紊乱的线粒体积累和更多脊髓神经元细胞死亡。因此，目前还没有合适的临床手段来治疗脊髓损伤。
目前的一些临床前研究方法是通过促进神经细胞再生或改善神经功能。干细胞在修复受损组织和器官方面显示出巨大潜力，因为移植到受损部位的间充质干细胞(MSC)可以分化为神经元，促进内源性生长因子的释放，从而改善SCI。然而，由于脊髓损伤后氧化应激产生大量的酸性物质和炎症因子，这种微环境可导致移植干细胞存活率低，治疗效果差。对神经保护作用至关重要的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)已被研究用于改善SCI的恢复。bFGF 通过促进细胞有丝分裂和营养神经作用，提高各种细胞类型的存活和生长。然而，bFGF由于半衰期短，在实际应用中受到限制。这对于临床用药达到理想药物浓度是一个需要解决的问题。
近年来，生物材料支架因其可以创造与宿主组织接触的空间，建立输送各种生长因子和移植细胞的平台，并为细胞的存活提供更好的微环境，已被逐步应用于再生医学领域，特别是水凝胶。水凝胶的含水量接近于人体组织的含水量，能确保其三维立体空间结构，有利于移植细胞与外部环境之间顺利进行物质和能量交换。而且，这种结构具有高表面积的特点，可以为移植细胞的增殖、迁移、分化等生理活动提供条件，并有利于缓慢释放被包裹的神经营养因子等药物。
尽管MSC治疗具有潜在的优势，但根据既往研究表明，单纯移植UCMSC不能获得长期稳定的疗效。主要原因是受损组织中的微环境较差不适宜移植细胞的存活而导致的治疗效果不佳。并且，由于脊髓损伤形成的组织缺损，干细胞不能停留在空腔内，需要生物材料或其他载体进行填充。生物材料修复脊髓损伤具有优势，生物材料(如壳聚糖、纳米多肽、水凝胶等)能填补损伤形成的不规则空洞，提供神经再生的载体。大量生物材料的研究表明这些生物材料有抑制炎症、改善局部微循环、促进内源性干细胞增生分化并迁移至损伤区形成新的神经网络。然而单独的生物材料功能恢复不完全也不理想。目前也有研究经过基因修饰的干细胞与生物材料联合治疗SCI，基因修饰后的干细胞可在体内过表达相关生长因子促进神经修复，但因基因修饰后不同程度地影响和改变干细胞的生物性状，例如增殖、迁移和神经分化能力等，最终影响后续治疗效果。
在本申请发明人的前期研究中，将bFGF、细胞外基质(ECM)和肝素泊洛沙姆(HP)制备成bFGF-ECM-HP温敏水凝胶应用于SCI治疗。然而，采用bFGF作为活性成分，其治疗SCI的效果还有待进一步提高。
发明内容
基于上述原因，本发明提出一种促进脊髓损伤恢复温敏型水凝胶及制备方法。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及促进脊髓损伤恢复温敏型水凝胶，其由碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、细胞外基质(ECM)和肝素泊洛沙姆(HP)制成的温敏型水凝胶中负载脐带间充质干细胞(UCMSC)。出人意料的，脐带间充质干细胞(UCMSC)在本发明的温敏型水凝胶中具有高的存活率，并且不破坏水凝胶的温敏性能，本发明的温敏型水凝胶通过激活 PAK1/SIRT4改善线粒体功能，减少线粒体病理性碎片化，促进线粒体供能和物质代谢，减少有害物质ROS、LDH、MDA的生成，提高线粒体膜电位，进而减少损伤部位的细胞凋亡，发挥神经保护作用，促进脊髓损伤的恢复。
在本发明的一个优选实施方式中，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、细胞外基质 (ECM)和肝素泊洛沙姆(HP)的重量比为3-6：10-20：160-320。
在本发明的一个优选实施方式中，所述温敏型水凝胶在20℃以下时为液态，在36℃以上时为凝胶状态。
在本发明的一个优选实施方式中，所述温敏型水凝胶为多孔结构。
本发明另一方面还涉及上述温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将脐带间充质干细胞(UCMSC)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-细胞外基质(ECM)-肝素泊洛沙姆(HP)水凝胶。
本发明另一方面还涉及上述温敏型水凝胶的应用，所述温敏型水凝胶用于制备促进脊髓损伤恢复的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物为原位注射制剂。本发明的水凝胶作为溶液注入，通过温度响应在原位形成凝胶，融入组织腔形成三维支持凝胶，有效解决干细胞归巢问题，同时提高UCMSC的存活率和促进神经分化。
本发明另一方面还涉及上述温敏型水凝胶的应用，所述温敏型水凝胶用于制备改善线粒体功能的药物中的应用。
本发明另一方面还涉及上述温敏型水凝胶的应用，所述温敏型水凝胶用于体外激活 PAK1/SIRT4。
有益效果
本发明创造性地提出将脐带间充质干细胞(UCMSC)与bFGF-ECM-HP温敏水凝胶联合治疗SCI，这种新型干细胞联合生长因子及缓释给药系统具有良好的生物相容性、温敏性和神经修复效果，为脊髓损伤的治疗提供了一个具有临床转化应用前景的治疗策略。此外，本发明首次揭示PAK1和SIRT4之间的调节关系，SIRT4在SCI中的线粒体动力学改变的相关性，即，UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶可通过激活PAK1/SIRT4改善线粒体功能。因此，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶为中枢神经系统疾病的干细胞生物支架治疗提供一种有前景的策略。
附图说明
图1：UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的制备与表征。(A)示意图为 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的构成和研究的总体设计。(B，D)不同温度(4℃和37℃)下bFGF-ECM-HP水凝胶的状态及稳态粘度的测定结果。(C)对 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶进行扫描电镜观察，并与HP进行比较。
图2：(A)UCMSC的分离培养(a)、第一代UCMSC细胞(b)、成脂诱导分化(c) 和成骨诱导分化(d)。(B)流式细胞术检测UCMSC表面标志物的表达。(C)细胞外基质(ECM)HE染色结果。(D)ECM的扫描电镜图，与正常脊髓进行比较。(E)DNA凝胶电泳检测ECM的DNA残留情况，并绘制DNA含量统计图。数据以平均值±标准差表示， n＝6。*p<0.01。(F)ECM的Masson染色结果图。(G)ECM中IV型胶原蛋白(Collagen IV)、层粘连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)的免疫荧光图。(H)用CCK-8法检测 UCMSC与0、5、10、20、40μl bFGF-ECM-HP水凝胶共培养的细胞活力。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与对照组相比，*p<0.01，***p<0.001。
图3：bFGF促进UCMSC的增殖和神经分化，促进UCMSC分泌更多bFGF。
(A)UCMSC中ECM-HP组和bFGF-ECM-HP组的活死细胞染色荧光图及活细胞数统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与ECM-HP组相比，*p<0.01。(B)CCK-8检测各组UCMSC存活率。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。 (C)ELISA检测各组的bFGF。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与UCMSC组相比， *p<0.01。(D)各组Nestin和NSE的免疫荧光图及平均荧光强度的统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。Nestin：与UCMSC组相比，*p<0.05，NSE：与UCMSC组相比，#p<0.05。
图4.UCMSC bFGF ECM HP温敏型水凝胶促进脊髓损伤修复。
(A)脊髓损伤后各组BMS评分。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比， *p<0.05。(B)脊髓损伤后28天各组的足迹分析。(C)脊髓损伤后28天各组的HE染色。
图5.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶可减少细胞凋亡。
(A)用western blot分析脊髓组织样本中BAX、BCL2、C-cas3和Cas3的蛋白表达。GAPDH用于条带密度归一化。BAX、BCL2、C-cas3和Cas3的光密度分析。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01。(B)各组NeuN的免疫荧光，NeuN平均荧光强度和NeuN阳性表达细胞数的统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，*p<0.01，***p<0.001。(C)各组C-cas3的免疫荧光。平均荧光强度的统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05.*p<0.01， ***p<0.001。
图6.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶改善SCI小鼠线粒体功能。
(A)各组的ATP水平检测。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，*p<0.01，***p<0.001。(B)各组的MDA检测。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，**p<0.001。(C-H)用western blot分析脊髓组织样本中DRP1、FIS1、MFN1、MFN2和OPA1的表达。GAPDH用于条带密度归一化。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，*p<0.05。
图7.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶可改善叔丁基过氧化氢(T-BHP)诱导的ND7/23细胞线粒体功能损伤。
(A)用western blot分析ND7/23细胞中DRP1、FIS1、MFN1、MFN2和OPA1的蛋白表达。GAPDH用于条带密度归一化。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比， ns p＞0.05，*p<0.05。(B)各组ND7/23细胞LDH检测。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，*p<0.01。(C)用活性氧检测试剂盒(Beyotime，S0033)检测各组ND7/23细胞中活性氧的荧光图及半定量统计图。比例尺＝50μm。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与对照组相比，ns p＞0.05，*p<0.01。(D)用Mitotracker染料(绿色)标记细胞线粒体。比例尺＝25μm。线粒体数量统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与 T-BHP组相比，ns p＞0.05，*p<0.01。(E)用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位(MMP)。比例尺＝50μm。各组JC-1聚集体与JC-1单体比率的统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与T-BHP组相比，ns p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01。
图8.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏水凝胶可在体外改善SIRT4的线粒体功能。
(A)用western blot分析ND7/23细胞中DRP1、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1和SIRT4 的表达。β-actin用于条带密度归一化。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与T-BHP组相比， nsp＞0.05，*p<0.05，与UCMSC-bFGF-ECM-HP组相比，#p<0.05。(B)不同组中DRP1 的免疫荧光结果图及平均荧光强度统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与T-BHP组相比，ns p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01。
图9.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏水凝胶在体内改善SIRT4的线粒体功能，并且bFGF对SIRT4上调的作用比UCMSC更有效。
(A)脊髓损伤后28天各组的足迹分析结果。(B)脊髓损伤后28天各组HE染色。 (C)脊髓损伤后28天各组BMS评分。(D)用western blot分析各组脊髓组织中DRP1、 FIS1、MFN1、MFN2、OPA1和SIRT4的蛋白表达。β-actin用于条带密度归一化。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与SCI组相比，ns p＞0.05，*p<0.05，与UCMSC-bFGF-ECM-HP 组相比，#p<0.05。(E)通过western blot分析各组处理的ND7/23细胞中SIRT4的表达。β-actin 用于条带密度归一化。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与bFGF组相比，*p<0.05，与UCMSC 组相比，#p<0.05。
图10.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过上调PAK1激活SIRT4发挥治疗作用。
(A)用western blot分析ND7/23细胞中SIRT4和PAK1的蛋白表达。β-actin用于条带密度归一化。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与T-BHP组相比，ns p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01，与UCMSC-bFGF-ECM-HP组相比，#p<0.05。(B)各组SIRT4的免疫荧光图及平均荧光强度统计图。数据以平均值±标准差表示，n＝6。与T-BHP组相比，ns p＞0.05， *p<0.05，**p<0.01与UCMSC-bFGF-ECM-HP组相比，#p<0.05。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：
1、材料和方法
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来源于温州医科大学生物技术与制药工程重点实验室。泊洛沙姆407接枝的肝素共聚物采用常规方法合成的。Dulbecco的改良Eagle’s培养基 (DMEM)和胎牛血清(FBS)购自Invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)。IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、DRP1、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1、SIRT4、PAK1、GAPDH、β-actin 购自Proteintech(Proteintech，China)。Cas3、C-cas3、BAX购自CST(CST，USA)。NeuN 和BCL2购自Abcam(Abcam,UK)。
细胞和动物
背根神经节细胞ND7/23(新生大鼠背根神经节神经元与小鼠神经母细胞瘤融合的杂交细胞系)由中国科学院干细胞库提供。ND7/23细胞在DMEM中常规培养，并添加10％(v/v)胎牛血清和1％青链霉素(青霉素10000U/ml和链霉素10000μg/ml)，均由Gibco(Lifetechnologies S.A.,Australia)提供。
所有实验过程均按照国家卫生研究院的指南进行，并经温州医科大学动物使用和伦理委员会批准。C57BL/6小鼠购自中国上海Slac实验动物有限公司，在特定的无病原体(SPF)条件下饲养，室温24±2℃，湿度50±10％，12h光/12h暗循环控制。所有小鼠都被给予充足的水和饲料。
慢病毒
靶向SIRT4的shRNA序列为5'-TGGAGAGTTGCTGCCTTTAA T-3'，阴性对照序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。诱导SIRT4沉默的慢病毒(shSIRT4)购自吉玛生物技术公司(GenePharma，中国)。病毒载体为pHBLV-CMVIE-GFP-T2A-Puro。慢病毒和阴性对照病毒的末效价为1×109TU/ml。这些细胞用慢病毒液转染24h，然后用2.5μg/ml嘌呤霉素 (Sigma,St.Louis,USA)筛选48h获得稳定细胞株。经western blot和荧光成像鉴定后传代使用。
扫描电子显微镜(SEM)
采用扫描电镜(SEM)对正常脊髓组织、ECM、HP水凝胶和UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶的表面进行观察。样品浸泡戊二醛后，经酒精梯度脱水后使用冷冻干燥机冻干样品48h，小心地放入导电胶中进行喷金。最后，用扫描电子显微镜(VEGA3 TESCAN,Brno,CzechRepublic)观察样品的形态。各组测试在七个不同的样本上重复进行。
细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测
采用CCK-8法(C0037,Beyotime,China)评价bFGF、ECM-HP水凝胶、bFGF-ECM-HP 水凝胶对UCMSC细胞增殖情况。人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)由温州医科大学生物技术与制药工程重点实验室提供。将细胞UCMSC接种于96孔板，分为CON组、ECM-HP 组、bFGF组、bFGF-ECM-HP组。将bFGF、ECM-HP水凝胶、bFGF-ECM-HP水凝胶分别加入到含10％FBS和1％S/P的完全培养基(DMEM)中，然后通过0.22μm过滤器过滤以灭菌，分别用于培养ECM-HP组、bFGF组、bFGF-ECM-HP组细胞，CON组用完全细胞培养基作对照。将其置于37℃5％CO2培养箱中分别培养1d、4d、7d后，每孔加入10μl CCK-8 溶液，在37℃ 5％CO2中孵育1h后用吸光酶标仪(Varioskan LUX,Thermo Fisher,USA)在450 nm处测定OD值。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
为评估UCMSC分泌bFGF的情况，将UCMSC(5×104cells/well)置于六孔板上。设置UCMSC组和UCMSC-bFGF组，分别给用完全培养基和含3mg/ml bFGF的完全培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养。在特定时间点(2d,4d,6d)，收集细胞培养基的上清液，按照说明书(ab99979,Abcam,USA)采用ELISA法检测上清液中bFGF的含量。该实验重复6次。
SCI模型
C57BL/6小鼠均为雌性，7-8周龄，体重20-22g。麻醉诱导采用5％异氟醚混合1L/min 氧气，维持麻醉采用2％异氟醚。用加热垫将动物温度稳定在37℃，剃掉背部毛发并充分消毒。通过尾部疼痛反射确认麻醉效果良好。用剪刀剪开皮肤，分离肌肉，露出脊柱。根据T9棘突向尾部倾斜的趋势，确定T9节段脊髓的位置。切断T9-10棘突及相应椎板，完全暴露T9节段脊髓，然后用Allen's打击器造成T9节段脊髓损伤，以小鼠尾巴左右摇摆,下肢抽搐和肉眼可见的血肿为造模成功。然后止血缝合伤口。各组实验小鼠术后置于37℃恒温板上复苏，苏醒后分笼饲养。假手术组仅暴露脊髓，无脊髓损伤。术后每天定时早晚2次小鼠后肢按摩及人工按压排尿。
BMS和足迹分析
采用BMS(Basso Mouse Scale)小鼠运动功能恢复评定。术前及脊髓损伤后1d、3d、7d、 14d、21d、28d采用BMS评分法，按照评分标准0分(无运动＝完全瘫痪)至9分(运动正常)评价运动功能改善情况。两名对实验不知情的研究人员独立地给这些老鼠打分。所有动物同时进行分,在一个开放的领域为4min。足迹分析而获得的后肢的运动的轨迹在白色的跑道后浸泡的不同组的小鼠后肢红色染料和四肢的蓝色染料。这两种功能测定由两名不知情的独立观察者记录。
组织切片的制备及HE染色
各组小鼠于造模后28d处死。这些动物采用前述方法麻醉。然后从心脏灌注大量生理盐水。将血冲洗干净后，取脊髓损伤中心段(长0.5cm)，立即置于-80℃保存，用于westernblot 检测。其他实验，如HE染色、免疫荧光等，取出脊髓后用4％多聚甲醛固定过夜。随后，组织通过梯度酒精脱水，浸泡二甲苯及石蜡后制成石蜡组织块。最后，在切片机上纵向切成5μm切片(Leica Microsystems Wetzlar GmbH，德国)。石蜡切片脱蜡后，进行HE染色，并使用光学显微镜(Leica DMIL LED,Germany)拍摄图像记录结果。
免疫荧光(IF)
制备脊髓组织石蜡切片和ND7/23细胞爬片。样品脱蜡、水化后用高温高压抗原修复。再用5％牛血清白蛋白37℃封闭30min，然后在4℃一抗免疫染色过夜:IV型胶原(55131-1-AP,Proteintech,1:500)，纤维连接蛋白(15613-1-AP,Proteintech,1:500)，层粘连蛋白 (23498-1-AP,Proteintech,1:500)，NeuN(ab177487,Abcam,1:500)，DRP1(12957-1-AP, Proteintech,1:500)，C-cas3(cst9661,CST,1:500)。次日，用二抗：AlexaFluor 488驴抗兔IgG H&L(ab150073,Abcam,1:1000)或Alexa Fluor 647驴抗兔IgG H&L(ab150075,Abcam,1: 1000)37℃孵育1h。DAPI孵育7min后抗荧光淬灭剂封片，使用共聚焦荧光显微镜(德国徕卡TCS SP8)对样品进行成像。利用Image J软件对荧光强度进行量化。
免疫印迹分析
用含有1％蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白提取试剂从脊髓组织中纯化总蛋白。用Carmassi Bradford试剂(Thermo,USA)定量每个样品的蛋白浓度。用10％的SDS-PAGE分离等量的蛋白质，转移到PVDF膜上(Bio-Rad,USA)。用5％(w/v)脱脂牛奶阻断后，进一步用一抗溶液在4℃孵育一夜。主要抗体包括:DRP1(12957-1-AP,Proteintech,1:1000)，FIS1(10956-1-AP,Proteintech,1:1000)，MFN1(13798-1-AP,Proteintech,1:1000)，MFN2(1286-1- AP,Proteintech,1:1000)，OPA1(27733-1-AP,Proteintech,1:1000)，Cas3(cst9662,CST,1: 1000)，C-cas3(cst9661,CST,1:1000)，BCL2(ab196495,Abcam,1:1000)，Bax(cst2772,CST, 1:1000)，SIRT4(66543-1-Ig,Proteintech,1:2000)，PAK1(21401-1-AP,Proteintech,1:2000)， GAPDH(60004-1-Ig,Proteintech,1:2000)，β-actin(66009-1-Ig,Proteintech,1:2000)。用TBST 洗涤三次后，用1:10000稀释的辣根过氧化物酶偶联二抗体在室温下孵育60min。最后用曝光液在Chemi Doc XRS+成像系统(Bio-Rad,USA)对结果进行拍照，使用ImageJ软件分析。所有实验重复六次以上。
活死染色
根据制造商的说明，采用活/死活力/细胞毒性试剂盒(C2015S,Beyotime,中国)评估水凝胶中活UCMSC的百分比。UCMSC与ECM-HP水凝胶、bFGF-ECM-HP水凝胶共培养48h 后，用试剂37℃孵育15min，荧光显微镜(Leica DMIL LED,Germany)拍照观察。
叔丁基过氧化氢(T-BHP)诱导的细胞毒性
为确定T-BHP对体外ND7/23细胞的影响效果，采用CCK-8法(C0037,Beyotime,China) 检测ND7/23细胞增殖情况。ND7/23细胞接种于96孔板(8×103个细胞/孔)，处理前孵育24 h。用新鲜培养基替代整个培养基后，分别用0、10、20、50、100、200μM T-BHP处理细胞6h和12h，然后每孔加入10μl CCK-8溶液，在37℃5％CO2中孵育1h。OD值在450nm 处用吸光酶标仪(Tecan Spark,Switzerland)测定。
Transwell共培养
体外观察UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶对T-BHP诱导损伤ND7/23细胞的保护作用。将ND7/23细胞接种于Transwell孔板上过夜，然后在顶部孔板上加入UCMSC-bFGF-ECM-HP 水凝胶，同时用添加100μM T-BHP的新鲜培养基替换孔板上的培养基，培养6h。
乳酸脱氢酶(LDH)释放细胞毒性试验
通过测定培养基中释放的LDH的活性来定量LDH释放的细胞毒性，并根据制造商的说明书使用LDH细胞毒性检测试剂盒(C0016,Beyotime,China)进行检测。各组细胞按前述方法处理后，将细胞培养液上清移至96孔板，与培养液10％体积的LDH检测试剂混合。孵育30min后，使用酶标仪在490nm波长下测定吸光度。
细胞内活性氧(ROS)检测
为检测ND7/23细胞内ROS水平，使用ROS检测探针DCFH-DA(S0033,Beyotime,China)。将ND7/23细胞接种于6孔板(每孔1.5×105个细胞)，孵育24h。然后按上述方法transwell孵育细胞，100μM T-BHP处理6h。然后，用10μM DCFH-DA在37℃条件下处理30min。细胞染色后用PBS洗涤2次。当细胞内ROS水平升高时，DCFH-DA会转化为一种绿色荧光分子DCF，从而可以通过荧光显微镜(Leica DILLED,Germany)拍照记录，使用 Image J分析DCF产生的细胞内荧光强度。
线粒体膜电位的测量(JC-1)
线粒体特异性双荧光探针(C2006,Beyotime，中国)用于评估线粒体膜电位，如说明书所述。ND7/23细胞接种于12孔板，按上述方法给予Transwell培养和T-BHP处理。给药后，加入JC-1工作液至终浓度为4μM,37℃孵育20min,PBS洗涤2次，更换新培养基，荧光显微镜(Leica DILLED,Germany)捕捉细胞。通过红绿荧光强度比值监测线粒体膜电位。红色荧光信号(525nm激光激发)反映出偏振线粒体以JC-1聚集体为主，细胞处于正常生理状态。绿色荧光信号(488nm激光激发)反映去极化线粒体以JC-1单体为主，细胞线粒体膜电位丧失，导致线粒体功能障碍和凋亡。
细胞内三磷酸腺苷(ATP)水平测定
使用细胞内ATP检测试剂盒(S0026,Beyotime，中国)检测细胞内ATP水平。测定的原理是:用肌酸激酶催化ATP和肌酸生成磷酸肌酸，用磷钼酸比色法分光光度法测定样品中的 ATP。ND7/23细胞的培养和处理如上所述。裂解细胞，4℃，12000rpm离心10min，取上清液。96孔板每孔加ATP检测试剂A100μl，室温孵育5min。每孔取20μl上清液与ATP 检测试剂混合，用酶标仪测定发光(RLU)。再用ATP标准曲线来将发光(RLU)转化为ATP浓度。
线粒体免疫荧光标签
使用
Figure BDA0003597253180000101
Green FM(C1048,Beyotime,China)标记和分析线粒体。12孔板每孔接种1×105个细胞，37℃培养箱培养24h。按上述方法给予Transwell培养和T-BHP处理。然后用预热的(37℃)含探针的培养基更换旧培养基。加入Mito-tracker荧光探针工作液(100 nM)，37℃孵育30min,PBS冲洗2次，更换新的培养基。使用共聚焦荧光显微镜(LeicaTCS SP8,Germany)拍摄图像。
统计分析
所有数据以均数±SD表示。所有统计分析均采用SPSS软件(spss24.0，芝加哥)进行。免疫荧光和western blot数据采用Tukey检验的单因素方差分析(ANOVA)进行分析。采用 GraphPad Prism 8.0(GraphPad Inc.,CA)作图。以p<0.05确定差异是否有统计学意义。
2、UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的制备与表征
肝素泊洛沙姆(HP)采用EDC/NHS法制备的。将泊洛沙姆407与1.3mmol/l 4-硝基苯氯甲酸盐和二氨基乙烯反应后，将中间体与肝素盐在2-(n-吗啉)磺酸(MES)缓冲溶液中于室温下经EDC和NHS偶联24小时，将反应混合物透析3天并冷冻干燥得到HP粉末。在制备HP后，采用冷法制备由HP水凝胶、ECM和bFGF组成的bFGF-ECM-HP水凝胶。简而言之，ECM用液氮研磨成粉末，然后将ECM溶解在pH7.4 PBS中，ECM溶液进一步冷冻干燥。将冻干的ECM粉末加入bFGF溶液中。24h后，将HP粉末在24h下轻轻搅拌，溶解于bFGF-ECM溶液中。轻轻搅拌过夜得到bFGF-ECM-HP水凝胶。bFGF、ECM和HP 的最终浓度分别为3mg/ml、10mg/ml和160mg/ml。bFGF-ECM-HP水凝胶在4℃下保存。整个实验是在无菌条件下进行的。将UCMSC细胞悬液以1000rpm离心5min后再悬浮于少量PBS中。然后将UCMSC悬浮液加入bFGF-ECM-HP溶液中，在4℃下充分混合，得到 UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶。图1A为UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的构建过程示意图。从SEM扫描电镜图(图1C)可以看出，HP呈现出一种海绵状的三维多孔结构，并相互连接成网络。同样，UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶保留3D多孔结构和温敏型性。另外，当温度达到37℃时，4℃液态的UCMSC-bFGF-ECM-HP可以迅速转化为水凝胶状态(图1B)。稳态粘度测量(图1D)，当温度从20℃升高到37℃时，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的稳态粘度迅速增加，在19000mPa时达到稳定平台。但随着温度升高，稳态粘度没有进一步增加。这个温度响应的特点，说明UCMSC的引入未影响水凝胶的温敏性，可使治疗材料具有可注射性，作为溶液注入，通过温度响应在原位形成凝胶，融入组织腔形成三维立体的支持凝胶，填补不规则的受损部位。上述结果表明，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶在体内应用时具有温度响应性，适用于加载干细胞，有利于原位给药治疗脊髓损伤。
采用组织差速贴壁法原代培养UCMSC后，通过流式细胞技术和成骨成脂诱导多向分化实验对其进行细胞鉴定。原代培养第4天，大量UCMSC从组织块中爬出并迅速增殖(图2A)。第一代细胞呈典型的成纤维细胞样形态(图2B)。通过油红O染色显示有红色脂滴存在，成脂诱导分化成功(图2C)。茜素红S染色显示UCMSC具有分化成骨细胞的分化能力，形成红色矿化结节(图2D)。流式细胞术分析证实UCMSC对MSC细胞表面标志物CD44、CD90 和CD105呈阳性，而对造血标志物如CD34、CD45和HLA-DR呈阴性(图2B)。这些结果表明，原代培养细胞UCMSC成功，为进行后续实验提供基础。
脊髓组织脱细胞后，HE染色检测细胞外基质，SEM图像显示无细胞核残留(图2C,D)。细胞外基质中无细胞，但不影响细胞外基质的完整性。它仍然是一个三维的网络结构。与正常脊髓不同，经DNA凝胶电泳，ECM中未发现残留的DNA条带(图2E)。此外，ECM中 DNA残留定量检测结果显示，与正常脊髓组织相比，DNA含量远低于10％，表明ECM已达到脱细胞支架的标准。为确定细胞外基质相关成分是否在脱细胞过程中丢失，通过免疫荧光和masson染色实验明确ECM主要成分的保留情况。根据的实验数据显示，在ECM中大量IV型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白呈阳性荧光染色(图2F)，masson染色显示大量蓝色网状胶原纤维(图2G)，表明ECM中的主要蛋白成分被保留。综上所述，证实在不影响胶原纤维等成分的情况下，完全脱细胞过程，有利于结合生长因子的持续释放，为脊髓损伤后被包裹的UCMSC和受损神经细胞的再生提供营养支持和保护。
3.bFGF促进UCMSC的增殖和神经分化，提高UCMSC分泌bFGF的能力
为明确水凝胶与UCMSC具有良好的细胞相容性，以及bFGF对UCMSC增殖的影响，采用活/死实验和CCK-8实验进行检测。图3A中的实验结果显示，大多数UCMSC染色为绿色，即为活细胞。而且培养48h后，在UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶中，活细胞UCMSC 的数量比在ECM-HP水凝胶中明显更多。CCK-8结果显示，bFGF促进体外UCMSC的增殖，提高UCMSC的存活率(图3B)。
大量研究表明bFGF具有神经修复作用，能促进神经元细胞命运决定(cell fatedetermination)、迁移和分化。UCMSC具有分泌多种生长因子的能力，并能分化为神经细胞。为进一步了解bFGF和UCMSC之间的相互作用关系，通过ELISA法检测细胞培养上清液中bFGF的含量。ELISA结果(图3C)显示，培养过程中，bFGF的刺激可显著促进UCMSC大量分泌bFGF。为明确bFGF在UCMSC神经分化中是否发挥重要作用，通过免疫荧光检测神经分化的两种标记物Nestin和NSE的表达情况。在培养基中添加3mg/ml bFGF连续培养 7d后，UCMSC中Nestin和NSE的表达明显增加，表明bFGF诱导UCMSC神经分化能力增强(图3D)。总之，bFGF提高UCMSC的存活率和神经分化的能力，并促进UCMSC分泌更多的bFGF。UCMSC联合bFGF有助于解决bFGF半衰期短的问题，同时bFGF有助于促进UCMSC的存活和神经分化，因此，将UCMSC与bFGF联合应用于治疗脊髓损伤。
4.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶促进脊髓损伤修复
在证实bFGF能在体外促进UCMSC的增殖和神经元分化后，进一步将 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶应用于SCI模型小鼠，并在体内观察其治疗效果。小鼠随机分为假手术组(Sham)、脊髓损伤未治疗组(SCI)、ECM-HP水凝胶治疗组(ECM-HP)、bFGF-ECM-HP水凝胶治疗组(bFGF-ECM-HP)、UCMSC-ECM-HP水凝胶治疗组 (UCMSC-ECM-HP)和UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶治疗组(UCMSC-bFGF-ECM-HP)。假手术组给予单纯假手术，其余各组术后及脊髓损伤后分别给予PBS、ECM-HP水凝胶、 bFGF-ECM-HP水凝胶、UCMSC-ECM-HP水凝胶、UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶处理。
采用Basso Mouse Scale(BMS Scale)和足迹分析评价小鼠运动功能的恢复情况，探讨 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶对小鼠的治疗效果。假手术组无损伤，运动功能正常，评分9分。从第7天开始，bFGF-ECM-HP组、UCMSC-ECM-HP组和UCMSC-bFGF-ECM-HP 组BMS评分显著高于SCI组和ECM-HP组。如预期，UCMSC-bFGF-ECM-HP组BMS评分优于其他组(图4A)。足迹分析也得到类似的结果(图4B)。UCMSC-bFGF-ECM-HP组表现出协调的爬行，尾巴抬起，几乎达到Sham组的功能水平，而SCI组仍然拖着后腿。 UCMSC-bFGF-ECM-HP组比bFGF-ECM-HP组、UCMSC-ECM-HP组、ECM-HP组或SCI 组恢复更快、更彻底。上述结果提示，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶有助于脊髓损伤后运动功能的恢复。
脊髓损伤后28d取脊髓组织标本，行HE染色分析组织学变化(图4C)。脊髓损伤组和ECM-HP组损伤脊髓周围空腔面积明显大于其他组，白质和中央灰质大面积丢失。HE染色还显示脊髓损伤组和ECM-HP组神经纤维紊乱，有大量坏死的神经元细胞和萎缩，不能促进损伤脊髓的修复。bFGF-ECM-HP组、UCMSC-ECM-HP组和UCMSC-bFGF-ECM-HP组均有明显改善，尤其是UCMSC-bFGF-ECM-HP组，说明UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶对修复脊髓损伤有一定的疗效。与bFGF-ECM-HP组和UCMSC-ECM-HP组比较， UCMSC-bFGF-ECM-HP组具有明显的神经保护作用。综上所述，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶促进脊髓损伤的修复。
5.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶减少细胞凋亡
脊髓损伤后，通常在挫伤中心周围出现广泛的、长时间的细胞凋亡事件。凋亡诱导与促凋亡因子BAX和主要凋亡蛋白C-cas3的表达增加和抗凋亡因子BCL2的表达减少有关。为阐明其保护作用的机制，探讨其对细胞凋亡的治疗作用的相关性，采用western blot方法检测与凋亡相关的BAX、BCL2、Cas3和C-cas3在脊髓组织中的蛋白水平。BAX、C-cas3在脊髓损伤组和ECM-HP组表达明显增强，而UCMSC-bFGF-ECM-HP组与Sham组表达水平相近。值得注意的是，BCL2的表达在这些组中表现出相反的结果(图5A)。脊髓损伤组BCL2 表达水平升高，BAX和C-cas3表达水平降低，与ECM-HP组小鼠相似。应用 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶后，UCMSC-bFGF-ECM-HP组小鼠BAX、BCL2和 C-cas3的表达水平明显逆转。这些结果揭示减少细胞凋亡的作用，有利于脊髓损伤的功能恢复。
为进一步检测UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的神经保护作用，在通过免疫荧光技术对损伤后28d的脊髓组织检测神经元特异性标记蛋白NeuN和细胞凋亡相关蛋白 C-cas3。实验结果如图5B,C所示，SCI组的NeuN阳性细胞数量和平均荧光强度明显减弱。而SCI组和ECM-HP组C-cas3平均荧光强度显著升高。此外，各治疗组均有不同程度地减少细胞凋亡，但应用UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶的治疗组(UCMSC-bFGF-ECM-HP) 对神经元凋亡的减少更为显著。上述实验结果表明UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶可显著减少细胞凋亡，对脊髓损伤具有神经保护作用。
6.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶改善SCI小鼠线粒体功能
线粒体功能障碍是导致线粒体介导的细胞凋亡的主要因素之一。线粒体主要通过提供 ATP来维持细胞代谢。功能失调线粒体的积累也在丙二醛(MDA)的启动中发挥关键作用。因此，检测不同组脊髓组织中ATP(图6A)和MDA(图6B)的水平。此外，为明确线粒体形态是否发生改变，检测线粒体裂变蛋白:动力相关蛋白1(DRP1)，招募DRP1介导裂变的外线粒体膜受体——裂变蛋白1(FIS1)。同时，也检测到线粒体融合蛋白:mitofusin(MFN)1和2，可能形成复合物来捆绑线粒体以介导融合的外膜GTPases，以及OPA1，一种介导内线粒体膜融合的GTPase。Western blot检测DRP1、FIS1、MFN1、MFN2和OPA1的表达(图6C-H)。脊髓损伤后，SCI组和ECM-HP组ATP含量下降，MDA水平升高，线粒体裂变蛋白DRP1 和FIS1表达升高，线粒体融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1表达降低，线粒体分裂增加，病理性碎片化增多，线粒体融合减少，线粒体功能受损，物质交换和能量代谢受阻。相反， bFGF-ECM-HP组、UCMSC-ECM-HP组和UCMSC-bFGF-ECM-HP组均有不同程度的改善，其中UCMSC-bFGF-ECM-HP组更明显。总之，发现UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶提供更多的能量，通过减少线粒体裂变，促进线粒体融合，恢复线粒体功能来减少MDA的产生，改善线粒体正常生理活动的物质交换和能量代谢，从而共同减少脊髓损伤后的神经元凋亡，促进神经修复。这些结果有力地证实的结论，即UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶移植可逆转线粒体功能障碍，减少细胞凋亡，发挥神经保护作用。
7.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶改善ND7/23细胞线粒体功能
为进一步验证上述结果，采用新生大鼠背根神经节神经元与小鼠神经母细胞瘤融合的 ND7/23细胞系，在体外评价UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶对T-BHP所致损伤的保护作用。根据CCK-8检测结果，选择100μM T-BHP与6h的实验条件进行后续实验。通过western blot检测线粒体裂变和融合分子，包括DRP1、FIS1、MFN1、MFN2和OPA1(图7A)、 乳酸脱氢酶(LDH)含量(图7B)、活性氧(ROS)水平(图7C)、线粒体数量(图7D)、线粒体膜电 位(MMP)(图7E)，全面了解UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶对线粒体动力学、功能、 数量和形态方面的作用。
在线粒体形态和动力学方面，通过western blot检测线粒体裂变和融合分子DRP1、FIS1、 MFN1、MFN2和OPA1。如图7A所示，与SCI组相比，UCMSC-bFGF-ECM-HP组线粒体裂变蛋白(DRP1、FIS1)表达减少，线粒体融合蛋白MFN1、MFN2、OPA1表达增加。实验数据表明，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过促进线粒体融合和抑制线粒体裂变来调节线粒体功能。此外，使用DHE染色法检测LDH释放和ROS水平。UCMSC-bFGF-ECM-HP 组LDH和ROS含量明显低于T-BHP组和ECM-HP组。这说明UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶可改善线粒体功能，减少LDH和ROS的生成。线粒体膜电位(MMP)是一个可早期灵敏地反映线粒体功能重要指标。UCMSC-bFGF-ECM-HP组在LDH和ROS生成减少的同时，线粒体数量和线粒体膜电位(MMP)显著增加。综上所述，UCMSC-bFGF-ECM-HP 温敏型水凝胶通过减少线粒体氧化损伤、增加线粒体的生物生成、数量和功能来改善线粒体功能。此外，bFGF-ECM-HP组和UCMSC-ECM-HP组线粒体功能得到有效改善，且 UCMSC-bFGF-ECM-HP组的促进作用强于其他两组。整体来看，与SCI组相比，观察到 UCMSC-bFGF-ECM-HP组线粒体功能明显改善。进一步实验证实UCMSC-bFGF-ECM-HP 温敏型水凝胶通过改善线粒体功能修复脊髓损伤的作用。
8.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶可改善SIRT4线粒体功能
SIRT4是一种代谢调节剂，在调节代谢和维持线粒体稳态方面发挥着重要作用。为深入研究SIRT4与UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶神经保护作用之间的关系，采用western blot方法检测脊髓组织中SIRT4的表达。发现SIRT4的表达在脊髓损伤后降低，UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶处理后升高。
为进一步探讨UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶对脊髓损伤的保护作用，利用慢病毒介导的shRNA沉默基因SIRT4来降低ND7/23中SIRT4的蛋白表达。慢病毒转染48h后，在培养基中加入2.5μg/ml的嘌呤霉素，筛选稳定的细胞株。荧光显微镜下，GFP阳性细胞率达 90％以上表明慢病毒转染ND7/23细胞成功。体外实验，将细胞分成5组，CON组、T-BHP 组、LV-SIRT4组、UCMSC-bFGF-ECM-HP组、LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组。 LV-SIRT4组和LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组使用慢病毒转染后的ND7/23细胞， CON组、T-BHP组和UCMSC-bFGF-ECM-HP组使用未经慢病毒转染的正常ND7/23细胞，除CON组外，各组均使用T-BHP模拟神经细胞损伤，UCMSC-bFGF-ECM-HP组和LV-SIRT4 +UCMSC-bFGF-ECM-HP组添加UCMSC-bFGF-ECM-HP处理。随后，通过western blot检测SIRT4和线粒体蛋白(DRP1、LARP7、FIS1、MFN1、MFN2和OPA1)的表达(图8A)，并对DRP1进行免疫荧光染色(图8B)，以评估T-BHP诱导损伤后线粒体功能的影响。观察到，相比于UCMSC-bFGF-ECM-HP组，LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组线粒体裂变蛋白 (DRP1、FIS1)水平较高，线粒体融合蛋白(MFN1、MFN2、OPA1)水平较低，线粒体功能明显较差。通过细胞免疫荧光检测DRP1也得到结论一致的实验结果。 LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组沉默SIRT4的表达后，不能达到类似于 UCMSC-bFGF-ECM-HP组改善线粒体功能的效果，而且SIRT4也没有达到相应程度的上调。因此，的上述数据表明，SIRT4的上调与线粒体功能的改善相关。应用UCMSC-bFGF-ECM-HP 温敏型水凝胶后，SIRT4被激活，线粒体裂变减少，融合增加，从而改善线粒体功能。总之， UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过激活SIRT4来改善线粒体功能。
9.体内实验验证UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过激活SIRT4改善线粒体功能，bFGF对SIRT4上调的影响比UCMSC更有效
为进一步验证的发现，应用SCI模型小鼠进行体内实验，明确SIRT4在 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶修复脊髓损伤中的作用。将SCI模型小鼠随机分为5 组，分别为假手术组(Sham)、脊髓损伤未治疗组(SCI)、SIRT4慢病毒干扰组(LV-SIRT4)、治疗组(UCMSC-bFGF-ECM-HP)和SIRT4慢病毒干扰+治疗组 (LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP)。在脊髓损伤造模后立刻在损伤区域原位分点定位微量注射慢病毒(5μl,1×109TU/ml)。除Sham组外，其余各组均进行脊髓损伤造模。
28天后，使用足迹分析(图9A)和BMS评分(图9B)检测小鼠的运动功能恢复情况。与SCI组比较，UCMSC-bFGF-ECM-HP组和LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组的运动功能恢复较明显，但LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组的运动功能恢复较 UCMSC-bFGF-ECM-HP组明显更差。通过HE染色观察组织学病理变化。与 UCMSC-bFGF-ECM-HP组相比，LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组神经纤维组织紊乱，更多胶原沉积和坏死病变(图9C)。通过western blot检测，DRP1、FIS1、MFN1、MFN2和 OPA1在脊髓组织样本中的表达趋势相似(图9D)。在LV-SIRT4+UCMSC-bFGF-ECM-HP组中，SIRT4表达受抑制，线粒体裂变蛋白(DRP1、FIS1)水平升高，线粒体融合蛋白(MFN1、 MFN2、OPA1)水平降低。表明抑制SIRT4的表达后，UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶改善线粒体功能的作用明显减弱。进一步说明总之，UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶通过激活SIRT4，改善线粒体功能，促进脊髓损伤后的功能恢复。
此外，观察到bFGF-ECM-HP组和UCMSC-ECM-HP组均增加SIRT4的表达9，改善线粒体功能。为明确是UCMSC还是bFGF起主要作用，T-BHP处理的ND7/23细胞分别与PBS、 bFGF、UCMSC和UCMSC-bFGF共培养。SIRT4在bFGF组的表达明显高于UCMSC组。因此，推测UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶在调节SIRT4的表达方面发挥着重要作用，且bFGF对SIRT4上调的作用比UCMSC更有效。
10.UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过上调PAK1蛋白来激活SIRT4蛋白
发现bFGF对SIRT4上调的作用比UCMSC更强。近年来的研究表明，生长因子可显著提高PAK1的活性。因此，假设PAK1和SIRT4之间具有相关的调控关系。为明确PAK1 对SIRT4的调控作用，将T-BHP处理的ND7/23细胞分为CON(对照组)、T-BHP组、IPA-3 (PAK1抑制剂)组、UCMSC-bFGF-ECM-HP组、IPA-3+UCMSC-bFGF-ECM-HP组。通过CCK-8 检测结果，选取20μMIPA-3与24h的比例进行进一步检测。如图10A所示，20μM IPA-3 处理24h后，PAK1表达下降，表明IPA-3抑制PAK1的活性。UCMSC-bFGF-ECM-HP组 PAK1和SIRT4的表达高于T-BHP组和IPA-3组。此外，与UCMSC-bFGF-ECM-HP组相比， IPA-3+UCMSC-bFGF-ECM-HP组PAK1和SIRT4的表达有统计学意义。SIRT4的免疫荧光染色分析结果类似(图10B)。蛋白表达及免疫荧光染色结果显示，IPA-3抑制PAK1活性可抑制上调的SIRT4表达。此外，IPA-3可阻断UCMSC-bFGF-ECM-HP水凝胶处理引起的SIRT4 表达上调。因此，PAK1被证实参与SIRT4表达的调控。综上所述，证实 UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过上调PAK1来激活SIRT4。综上所述，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过激活PAK1/SIRT4调控线粒体功能，促进脊髓损伤的恢复。
11、结论
本发明首次发现了UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过激活PAK1/SIRT4改善线粒体功能，减少细胞凋亡，促进脊髓损伤后的运动恢复。首次揭示PAK1和SIRT4之间的调节关系，SIRT4与SCI中的线粒体动力学改变的相关性，为临床转化治疗脊髓损伤提供前期研究基础。本发明首次发现水凝胶中的bFGF可提高UCMSC的存活率和促进神经分化的能力,UCMSC在含有3mg/ml bFGF的培养基培养7天后，可观察到高度表达神经元特异性标记物Nestin和NSE，并且发现细胞形态变细长，具有神经细胞的形态变化，表明bFGF 促进UCMSC在快速向神经方向分化。然而，根据其他类似的研究报道，通常这样的神经分化至少需要14天甚至一个月。在本研究中，我们发现bFGF促进UCMSC的增殖，提高细胞存活率和神经分化能力，并促进UCMSC分泌更多bFGF，将两者共同应用于SCI，可以增强治疗效果。综上所述，UCMSC-bFGF-ECM-HP温敏型水凝胶通过激活PAK1/SIRT4改善线粒体功能，促进脊髓损伤的恢复。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (9)

1.促进脊髓损伤恢复温敏型水凝胶，其由碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、细胞外基质(ECM)和肝素泊洛沙姆(HP)制成的温敏型水凝胶中负载脐带间充质干细胞(UCMSC)。
2.根据权利要求1所述的温敏型水凝胶，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、细胞外基质(ECM)和肝素泊洛沙姆(HP)的重量比为3-6：10-20：160-320。
3.根据权利要求1所述的温敏型水凝胶，所述温敏型水凝胶在20℃以下时为液态，在36℃以上时为凝胶状态。
4.根据权利要求1所述的温敏型水凝胶，所述温敏型水凝胶为多孔结构。
5.权利要求1-4任意一项所述温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将脐带间充质干细胞(UCMSC)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-细胞外基质(ECM)-肝素泊洛沙姆(HP)水凝胶通过混合制成的温敏型水凝胶。
6.权利要求1-4任意一项所述温敏型水凝胶的应用，所述温敏型水凝胶用于制备促进脊髓损伤恢复的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述药物为原位注射制剂。
8.权利要求1-4任意一项所述温敏型水凝胶的应用，所述温敏型水凝胶用于制备改善线粒体功能的药物中的应用。
9.权利要求1-4任意一项所述温敏型水凝胶的应用，所述温敏型水凝胶用于体外激活PAK1/SIRT4。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080131405A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Sin Soo Jeun Composition for treating a disease caused by neuronal insult comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient
JP2012031127A (ja) * 2010-08-03 2012-02-16 Nagoya Univ 臍帯由来間葉系幹細胞を含む組成物
CN108421087A (zh) * 2017-02-15 2018-08-21 北京中科再康生物技术有限公司 一种复合间充质干细胞的功能胶原支架及其应用
CN108624563A (zh) * 2018-05-11 2018-10-09 南京鼓楼医院 能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用
CN110656087A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 李陶 一种manf基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用
CN113101303A (zh) * 2021-04-15 2021-07-13 四川大学 自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法及用途
CN113181428A (zh) * 2021-04-26 2021-07-30 右江民族医学院附属医院 脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法
CN113712995A (zh) * 2021-07-20 2021-11-30 河北医科大学 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080131405A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Sin Soo Jeun Composition for treating a disease caused by neuronal insult comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient
JP2012031127A (ja) * 2010-08-03 2012-02-16 Nagoya Univ 臍帯由来間葉系幹細胞を含む組成物
CN108421087A (zh) * 2017-02-15 2018-08-21 北京中科再康生物技术有限公司 一种复合间充质干细胞的功能胶原支架及其应用
CN108624563A (zh) * 2018-05-11 2018-10-09 南京鼓楼医院 能高效分泌bFGF的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用
CN110656087A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 李陶 一种manf基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用
CN113101303A (zh) * 2021-04-15 2021-07-13 四川大学 自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法及用途
CN113181428A (zh) * 2021-04-26 2021-07-30 右江民族医学院附属医院 脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法
CN113712995A (zh) * 2021-07-20 2021-11-30 河北医科大学 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE-LIN XU ET AL.: "Thermo-sensitive hydrogels combined with decellularised matrix deliver bFGF for the functional recovery of rats after a spinal cord injury", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
LIHUA LUO ET AL.: "Effects of Transplanted Heparin-Poloxamer Hydrogel Combining Dental Pulp Stem Cells and bFGF on Spinal Cord Injury Repair", 《STEM CELLS INTERNATIONAL》 *
MINGHAO YAO ET AL.: "Dual-enzymatically cross-linked gelatin hydrogel enhances neural differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and functional recovery in experimental murine spinal cord injury", 《J. MATER. CHEM. B》 *
YI LI ET AL.: "Novel Thermosensitive Hydrogel Promotes Spinal Cord Repair by", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 *

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