CN115804758A - 制备多孔干细胞微载体的方法、由该方法制备得到的多孔干细胞微载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备多孔干细胞微载体的方法，包括如下步骤：配制甲基丙烯酰胺基明胶的水溶液，并与光引发剂混合，消泡，得分散相；将非离子型乳化剂与液体石蜡混合，得流动相；采用微流控技术，将分散相与流动相混合，得微球；对微球进行光固化，洗涤、过滤、干燥，得所述多孔干细胞微载体。该微载体可以应用于干细胞的3D培养，以及作为干细胞治疗的载体。本发明还公开了由该方法制备得到的多孔干细胞微载体及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞载体技术领域。更具体地，涉及一种制备多孔干细胞微载体的方法、由该方法制备得到的多孔干细胞微载体及应用。
背景技术
干细胞移植治疗是一门新兴的医学技术，将健康的干细胞移植到患者的体内，实现修复或替换受损细胞或组织，从而治愈疾病。干细胞具有无限增殖和多向分化的特性，是人体的种子细胞，被医学界成为“万用细胞”。研究者们发现，干细胞能够有效修复人体重要组织器官的损伤及治愈心血管疾病、代谢性疾病、血液系统疾病、神经系统疾病等，以干细胞治疗为核心的再生医学已经成为当今最前沿的医学研究领域。
干细胞在人体中含量少，在进行干细胞治疗或体外构建组织工程器官时，需要大量干细胞并且还要满足一定的细胞密度。通常一次干细胞移植至少需要5x109的细胞数量用以治疗疾病，如何在短时间内获得足够的干细胞并且保持其分化潜能，成为干细胞应用的现实障碍。
当前最主要的干细胞培养方法仍是2D培养，但是细胞在平面上生长无法再现体内细胞真实的3D环境。由于2D培养环境在培养基结构、营养物质的输送、细胞代谢物的积累等方面均不如3D培养，经常使得培养的干细胞丧失其原有的性状、形态、结构和功能。并且2D培养细胞增殖效率较低，单位面积利用率远低于3D培养，无法满足临床大剂量干细胞的应用需求。
微载体为干细胞的大规模3D培养提供了可能，微载体的多孔结构为干细胞的粘附、增殖提供了支撑空间。
目前已有的制备微载体的材料和技术多种多样。CN 107073165A公开了一种明胶多孔微载体的制备方法，其采用先乳化后交联的方式制备了明胶多孔微载体。该方法能够制备出不同尺寸和孔径的多孔明胶微载体，但是乳化法无法保证批次制备的微载体具有均一的尺寸，尺寸分布很宽，并且采用的交联剂均有很大的毒性。
CN109646713A公开了一种海藻酸盐/纳米黏土复合微载体的制备方法，CN104208749A公布了一种基于聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物的微载体制备方法。这两种方法其微载体材料本身的细胞亲和性较差，细胞粘附率较低，且无法快速裂解，导致无法应用于干细胞扩增培养。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种制备多孔干细胞微载体的方法，该方法克服了现有的选用合成高分子通过乳化的方法制备微球，然后造孔的微载体制备技术中，由于人工合成高分子材料不具备细胞粘附位点，且生物相容性差，细胞不能够在微载体上很好的粘附、增殖。其次合成高分子很难降解，当作为干细胞扩增的微载体时难以快速降解收集干细胞，当作为干细胞治疗用微载体时，其在体内难降解，并且降解产物容易在体内残留难以排出的问题；以及，现有的明胶乳化交联法制备微载体的方法中存在的乳化法制备的微球尺寸分布宽，且采用的醛类交联剂具有很高的毒性，后期不易去除，不利于干细胞的粘附增殖等问题。通过该方法制备得到的多孔干细胞微载体的体内可降解性好，降解产物易于排出；同时该微载体微球尺寸均一，有利于干细胞的粘附增殖，尤其适合用于干细胞的3D培养。
本发明的第二个目的在于提供一种多孔干细胞微载体。
本发明的第三个目的在于提供一种多孔干细胞微载体的应用。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
一种制备多孔干细胞微载体的方法，包括如下步骤：
配制甲基丙烯酰胺基明胶(GelMA)的水溶液，并与光引发剂混合，消泡，得分散相；
将非离子型乳化剂与液体石蜡混合，得流动相；
采用微流控技术，将分散相与流动相混合，得微球；
对微球进行光固化，洗涤、过滤、干燥，得所述多孔干细胞微载体。
上述制备方法中，微流控技术中的流动相为油相，分散相为水相，能够使得GelMA溶液分散相在液体石蜡中形成尺寸均匀的微球。
GelMA由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料，具有优异的生物相容性。进一步地，所述甲基丙烯酰胺基明胶中，甲基丙烯酸酐的改性程度≥30％(改性程度是指甲基丙烯酸酐相对于活性氨基的个数比值)，优选为30％-90％。在此条件下，得到的明胶可很好的光交联形成凝胶。更优选地，所述基丙烯酰胺基明胶中，甲基丙烯酸酐的改性程度为50％-90％。本发明中，上述改性程度的控制主要是提高光交联的速率。
进一步地，所述甲基丙烯酰胺基明胶的水溶液中，甲基丙烯酰胺基明胶的质量浓度为3～40％，优选为5～25％。通过调配不同的微载体前体溶液，可以更好的调控微载体的孔径、降解速率、力学强度等理化性能。
进一步地，所述甲基丙烯酰胺基明胶溶液的配制包括如下步骤：将甲基丙烯酰胺基明胶溶于40～70℃热水中，即得。
进一步地，所述非离子型乳化剂为司班80。此时更有利于干细胞的粘附增殖。
进一步地，所述非离子型乳化剂与液体石蜡的体积比例为1：200～1：10。乳化剂和流动相的比例主要影响制备过程中微球的尺寸。如果不在此范围内，可能流动相不容易分散形成微球。示例性的，所述非离子型乳化剂与液体石蜡的体积比例为包括但不限于为1：100～1：10等。
进一步地，采用微流控技术将分散相与流动相混合的过程中，分散相和流动相的流量比为1：500～1：2。通过流动相和分散相的流量调整，可很好的控制微球的直径。
进一步地，所述光固化采用的光源的波长为365nm或405nm。
进一步地，所述光引发剂选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)或2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(I2959)。
更进一步地，当所述光引发剂选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂时，光固化采用的光源的波长优选为405nm；当所述光引发剂选自2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮时，光固化采用的光源的波长优选为365nm或405nm。
进一步地，所述分散相中，光引发剂的质量浓度为0.5～1％。
进一步地，所述干燥的方式为冷冻干燥。采用该方法可使得GelMA微球产生均匀的多孔结构。
进一步地，所述方法中，在分散相的制备过程中，还包括向所述水溶液中加入包括但不限于生物活性因子、分子药物、无机盐中的一种或几种。通过该方法，可实现微载体的功能化。
进一步地，所述洗涤、过滤包括先采用低毒性非离子表面活性剂的水溶液进行洗涤，过滤；再采用去离子水进行洗涤、过滤。
进一步地，所述洗涤、过滤包括先采用浓度0.5～5％(优选为1～3％)的吐温80水溶液进行洗涤，过滤；再采用去离子水进行洗涤、过滤。
为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：
一种多孔干细胞微载体，其由上述第一个目的所述的方法制备得到。
为达到上述第三个目的，本发明还保护如上第一个目的所述的方法制备得到的多孔干细胞微载体在在干细胞的3D培养或在制备干细胞治疗药物中的应用。
可以理解，所述多孔干细胞微载体作为载体而使用。
本发明的有益效果如下：
1、现有的微载体制备技术大多选用合成高分子通过乳化的方法制备微球，然后造孔。该方法最大的缺点是，由于人工合成高分子材料不具备细胞粘附位点，且生物相容性差，细胞不能够在微载体上很好的粘附、增殖。其次合成高分子很难降解，当作为干细胞扩增的微载体时难以快速降解收集干细胞，当作为干细胞治疗用微载体时，其在体内难降解，并且降解产物容易在体内残留难以排出。本发明的方法中，采用的主要材料为GelMA，是由明胶改性而成，具备明胶材料优异的生物相容性。GelMA分子链上的RGD细胞粘附序列能够增强干细胞在微载体上的粘附、增殖。当GelMA多孔微载体作为干细胞扩增用途时，能够应用裂解液(如I型胶原酶、II型胶原酶、蛋白酶等)在不损伤干细胞的情况下快速的降解，从而实现干细胞的收集。当GelMA多孔微载体作为干细胞治疗的载具时，其能够被人体降解，并且降解产物为氨基酸或多肽能够被身体吸收代谢，特别对于某些特定的干细胞治疗目的(皮肤创伤、骨创伤等)，其代谢产物还可以作为组织再生的原料。
2、现有的明胶乳化交联法制备微载体的方法，其最大的缺点是，乳化法制备的微球尺寸分布宽，且采用的醛类交联剂具有很高的毒性，后期不易去除，不利于干细胞的粘附增殖。本发明通过微流控技术能够制备尺寸均一的微球，并且采用光交联的方法使得微球快速无毒的交联。
3、明胶材料来源丰富，价格适中，且明胶改性制备GelMA的方法也比较简单，利于控制吸附剂的成本，可以大规模的进行工业化制备。
4、本发明能够在分散相溶液中加入生物活性因子或分子药物，实现微载体的功能化。例如通过负载分化诱导剂，实现干细胞在微载体上粘附增殖后的定向分化。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实施例1制备得到的100微米直径多孔微载体的SEM图。
图2示出实施例2制备得到的200微米直径多孔微载体的SEM图。
图3示出实施例3制备得到的400微米直径多孔微载体的SEM图。
图4示出实施例4制备得到的350微米直径载纳米羟基磷灰石多孔微载体。
图5示出实施例4制备得到的350微米直径载纳米羟基磷灰石多孔微载体局部放大图。
图6示出实施例5中200微米直径载地塞米松干细胞成骨诱导多孔微载体。
图7示出对比例1制备得到的载体的SEM图。
图8-图12依次为实施例1-5在PBS溶液中的降解情况。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
制备直径200微米的干细胞扩增用微载体，包括如下步骤：
1)将1g MA修饰度80％的GelMA，加入到9mL去离子水中，静置30min后，在60℃完全溶解。
2)将0.1g的LAP，加入到1mL的去离子水中，超声分散。
3)将GelMA溶液与LAP溶液混合，避光，超声分散去泡，作为分散相溶液。
4)将20ml司班80加入到500ml液体石蜡中，搅拌至混合均匀，作为流动相。
5)采用T型结构的微流控芯片(分散相相孔道直径125微米，流动相孔道直径500微米)，设置分散相和流动相的流量比为1：30。
6)在芯片末端采用405nm的紫外光照射10s，使得GelMA微球交联固化。
7)制备结束后将收集到的GelMA微球静置，倒去上层的液体石蜡，并用1.5％的吐温80水溶液洗涤，过滤，重复2次。
8)用去离子水清洗GelMA微球，过滤，重复3次。
9)将过滤后的GelMA微球在-80℃冷冻4h，然后冷冻干燥，得到多孔的直径200微米的微载体，其SEM图如图1所示。且该微载体的孔径为15.3±5.7μm。
实施例2
制备直径100微米的干细胞扩增用微载体，包括如下步骤：
1)将1.5g MA修饰度80％的GelMA，加入到9mL去离子水中，静置30min后，在60℃完全溶解。
2)将0.125g的I2959，加入到1mL的去离子水中，超声分散。
3)将GelMA溶液与I2959溶液混合，避光，超声分散去泡，作为分散相溶液。
4)将20ml司班80加入到500ml液体石蜡中，搅拌至混合均匀，作为流动相。
5)采用共聚焦结构的微流控芯片(分散相相孔道直径100微米，流动相孔道直径250微米)，设置分散相和流动相的流量比为1：20。
6)在芯片末端采用365nm的紫外光照射30s，使得GelMA微球交联固化。
7)制备结束后将收集到的GelMA微球静置，倒去上层的液体石蜡，并用1.5％的吐温80水溶液洗涤，过滤，重复2次。
8)用去离子水清洗GelMA微球，过滤，重复3次。
9)将过滤后的GelMA微球在液氮中迅速冷冻，然后冷冻干燥，得到多孔的直径100微米的微载体，其SEM图如图2所示。且该微载体的孔径为30.1±7.3μm。
实施例3
制备直径400微米的干细胞扩增用微载体，包括如下步骤：
1)将0.8g MA修饰度80％的GelMA，加入到9mL去离子水中，静置30min后，在60℃完全溶解。
2)将0.05g的LAP，加入到1mL的去离子水中，超声分散。
3)将GelMA溶液与LAP溶液混合，避光，超声分散去泡，作为分散相溶液。
4)将10ml司班80加入到500ml液体石蜡中，搅拌至混合均匀，作为流动相。
5)采用T型结构的微流控芯片(分散相相孔道直径125微米，流动相孔道直径500微米)，设置分散相和流动相的流量比为1：20。
6)在芯片末端采用405nm的紫外光照射10s，使得GelMA微球交联固化。
7)制备结束后将收集到的GelMA微球静置，倒去上层的液体石蜡，并用1.5％的吐温80水溶液洗涤，过滤，重复2次。
8)用去离子水清洗GelMA微球，过滤，重复3次。
9)将过滤后的GelMA微球在-80℃冷冻4h，然后冷冻干燥，得到多孔的直径400微米的微载体，其SEM图如图3所示。且该微载体的孔径为51.5±10.1μm。
实施例4
制备直径200微米的载纳米羟基磷灰石多孔微载体，包括如下步骤：
1)将1g MA修饰度80％的GelMA，0.1g的纳米羟基磷灰石，加入到9mL去离子水中，静置30min后，在60℃完全溶解。
2)将0.1g的LAP，加入到1mL的去离子水中，超声分散。
3)将GelMA溶液与LAP溶液混合，避光，超声分散去泡，作为分散相溶液。
4)将20ml司班80加入到500ml液体石蜡中，搅拌至混合均匀，作为流动相。
5)采用T型结构的微流控芯片(分散相相孔道直径125微米，流动相孔道直径500微米)，设置分散相和流动相的流量比为1：30。
6)在芯片末端采用405nm的紫外光照射10s，使得GelMA微球交联固化。
7)制备结束后将收集到的GelMA微球静置，倒去上层的液体石蜡，并用1.5％的吐温80水溶液洗涤，过滤，重复2次。
8)用去离子水清洗GelMA微球，过滤，重复3次。
9)将过滤后的GelMA微球在-80℃冷冻4h，然后冷冻干燥，得到多孔的直径350微米的载纳米羟基磷灰石GelMA微载体，其SEM图如图4所示，局部放大图如图5所示。且该微载体的孔径为42.6±11.3μm。
实施例5
制备直径200微米的干细胞成骨分化诱导微载体，包括如下步骤：
1)将1g MA修饰度80％的GelMA，加入到9mL去离子水中，静置30min后，在60℃完全溶解。
2)将0.1g的LAP，100ng地塞米松，加入到1mL的去离子水中，超声分散。
3)将GelMA溶液与LAP溶液混合，避光，超声分散去泡，作为分散相溶液。
4)将20ml司班80加入到500ml液体石蜡中，搅拌至混合均匀，作为流动相。
5)采用T型结构的微流控芯片(分散相相孔道直径125微米，流动相孔道直径250微米)，设置分散相和流动相的流量比为1：15。
6)在芯片末端采用405nm的紫外光照射15s，使得GelMA微球交联固化。
7)制备结束后将收集到的GelMA微球静置，倒去上层的液体石蜡，并用1.5％的吐温80水溶液洗涤，过滤，重复2次。
8)用去离子水清洗GelMA微球，过滤，重复3次。
9)将过滤后的GelMA微球在-80℃冷冻4h，然后冷冻干燥，得到多孔的直径200微米的干细胞成骨分化诱导微载体，其SEM图如图6所示。且该微载体的孔径为27.8±7.1μm。
对比例1
1)将1g明胶加入9mL去离子水中，静置30min后，在60℃完全溶解。
2)将20ml司班80加入到500ml液体石蜡中，搅拌至混合均匀。
3)将液体石蜡置于磁力搅拌器上，搅拌速度200转/秒，将明胶溶液逐滴加入。
4)磁力搅拌10min后，逐滴加入1％戊二醛水溶液3ml，继续搅拌30min。
5)将溶液过滤，得到明胶微球，并用去离子水冲洗3遍。
6)将过滤后的明胶微球在-80℃冷冻4h，然后冷冻干燥，得到直径400微米的微球，不具有微孔结构，其SEM图如图7所示。
实施例6
测试上述各实施例中制备得到的微载体的降解情况。具体方法为：
分别将0.2g的微载体加入到5ml的PBS溶液中，在37℃的恒温摇床中持续振荡，分别在1、3、7、14天将样品取出，用去离子水冲洗3遍，离心后，冷冻干燥，计算样品的质量残余率。实施例1-实施例5所得微载体的降解情况分别如图8-图12所示。
实施例7
将各实施例中制备得到的微载体分别用于干细胞3D培养，包括如下步骤：
1)将微载体进行钴60辐照灭菌，待用。
2)准备人脐带间充质干细胞悬液，细胞密度为2x106个/ml。
3)取50mg的微载体加入孔板中，并加入400μL的细胞悬液充分混合。
4)将混合后微载体细胞悬液，在二氧化碳培养箱中静置1.5h。
5)每孔中加入2ml的完全培养基后放入二氧化碳培养箱中培养。
6)7天后，用PBS冲洗样品，并加入1ml I型胶原酶溶液进行裂解，1h后离心收集细胞并计数，计算细胞增殖倍率。
经计算，经过7天培养，利用各实施例的微载体在干细胞3D培养中，细胞增殖倍率结果如下表1所示。
表1
| 实施例 | 细胞增殖倍率 |
| 实施例1 | 390％ |
| 实施例2 | 440％ |
| 实施例3 | 470％ |
| 实施例4 | 430％ |
| 实施例5 | 370％ |
| 对比例1 | 140％ |
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种制备多孔干细胞微载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制甲基丙烯酰胺基明胶的水溶液，并与光引发剂混合，消泡，得分散相；
将非离子型乳化剂与液体石蜡混合，得流动相；
采用微流控技术，将分散相与流动相混合，得微球；
对微球进行光固化，洗涤、过滤、干燥，得所述多孔干细胞微载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基明胶的水溶液中，甲基丙烯酰胺基明胶的质量浓度为3～40％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基明胶中，甲基丙烯酸酐相对于活性氨基的比值≥30％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子型乳化剂与液体石蜡的体积比例为1：200～1：10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用微流控技术将分散相与流动相混合的过程中，分散相和流动相的流量比为1：500～1：2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光固化采用的光源的波长为365nm或405nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光引发剂选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮；
优选地，所述分散相中，光引发剂的质量浓度为0.5～1％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥的方式为冷冻干燥。
9.如权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的多孔干细胞微载体。
10.如权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的多孔干细胞微载体在在干细胞的3D培养或在制备干细胞治疗药物中的应用。
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