CN112245658A - 一种可注射晶胶微球细胞扩增载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种可注射晶胶微球细胞扩增载体及其制备方法,该可注射晶胶微球细胞扩增载体是具备可控的贯通多孔结构、且具有形状记忆性能的晶胶微球。该晶胶微球是通过对水溶性含双键高分子化合物中的一种或多种执行程序化冷冻和紫外光交联得到。该可注射晶胶微球细胞扩增载体,不同于传统的水凝胶微球,其具有可控的贯通多孔结构,且孔结构由冷冻程序控制,支持细胞的贴附、增殖和迁移,在注射过程中保护细胞免受剪切力的影响,维持细胞活性。该可注射晶胶微球细胞扩增载体,可作为模块化细胞载体,支持多细胞共培养,成为细胞间相互作用的研究平台;还可以作为组织工程支架,负载细胞、生长因子或药物后,注射入组织缺损部位,促进多种组织再生。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域,具体涉及到一种可注射晶胶微球细胞扩增载体及其制备方法。
背景技术
细胞的大规模扩增和有效递送是基于干细胞治疗的再生医学的前提与关键。水凝胶材料生物相容性好、含水量高、与天然细胞外基质的结构相似。虽然可注射水凝胶的细胞递送系统已经得到了广泛研究,但是在常规块状水凝胶中,高分子网络构成的纳米孔却限制了营养物质及代谢废物的传输,干细胞在水凝胶内难以铺展、增殖和迁移,且水凝胶交联过程会影响细胞活性,限制了其临床应用。
以聚合物微球为代表的细胞微载体因为其组成结构的可设计性、可模块化作为微载体进行多细胞共培养以及可注射性吸引了研究人员的关注。传统的聚合物微球材料为脂肪族聚酯,但是脂肪族聚酯缺乏细胞结合位点、降解产物呈酸性,需要进一步改性。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对细胞的大规模扩增和有效递送的细胞载体中,块状水凝胶不利于干细胞的铺展、增殖和迁移,而聚酯微球缺乏细胞结合位点、降解产物呈酸性,本公开的主要目的在于提供一种易于细胞贴附和增殖,增强细胞功能,并且在注射过程中保护细胞的具有大孔结构的可注射晶胶微球细胞载体及其制备方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的,本公开采用的技术解决方案如下:
一种可注射晶胶微球细胞扩增载体,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体是具备可控的贯通多孔结构、且具有形状记忆性能的晶胶微球。
上述方案中,所述晶胶微球的直径为25-999μm,所述多孔结构由冷冻程序控制。
上述方案中,所述晶胶微球是通过对水溶性含双键高分子化合物中的一种或多种执行程序化冷冻和紫外光交联得到。
上述方案中,所述水溶性含双键高分子化合物是选自聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化壳聚糖或甲基丙烯酸酐化透明质酸HAMA中的一种或多种。
上述方案中,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体是在细胞培养板、细胞培养瓶或生物反应器中作为载体来扩增细胞,所述细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脂肪源性干细胞、诱导多能干细胞、牙源性干细胞或人脐静脉内皮细胞;在使用所述可注射晶胶微球细胞扩增载体扩增干细胞时,能够维持干细胞的干性,并在诱导条件下诱导干细胞多向分化;在使用所述可注射晶胶微球细胞扩增载体扩增细胞后,是使用胰酶消化液将细胞从所述可注射晶胶微球细胞扩增载体上消化分离单独使用,或者直接将负载有细胞的所述可注射晶胶微球细胞扩增载体通过注射器注射使用;在注射过程中,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体的大孔结构和形状记忆性能保护细胞免受剪切力和摩擦力的伤害。
一种可注射晶胶微球细胞扩增载体的制备方法,该方法包括:
步骤1:将水溶性含双键高分子化合物溶于去离子水中,加入光引发剂和水溶性表面活性剂,混合均匀后得到第一溶液A;在油中加入油溶性表面活性剂,混合均匀后得到第二溶液B;
步骤2:将第一溶液A加入第二溶液B中,得到水溶性含双键高分子化合物和油的油包水乳液;
步骤3:将所述油包水乳液经-20℃、-80℃和液氮程序降温后,并经365nm紫外光交联得到晶胶微球;
步骤4:离心收集晶胶微球,清洗冷冻干燥,得到所述可注射晶胶微球细胞扩增载体。
上述方案中,步骤1中所述水溶性含双键高分子化合物是选自聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化壳聚糖或甲基丙烯酸酐化透明质酸HAMA中的一种或多种;步骤1中所述油为食用油、液体石蜡或矿物油中的一种;步骤1中所述光引发剂为I2959,所述水溶性表面活性剂为Tween 60,所述油溶性表面活性剂为Span 80;步骤1中所述光引发剂I2959与水溶性含双键高分子化合物的质量配比在1∶10-1∶100之间;步骤1中所述将水溶性含双键高分子化合物溶于去离子水中得到高分子水溶液,所述高分子水溶液的浓度为1-20wt%,每毫升高分子水溶液中添加0.5-5毫克水溶性表面活性剂Tween 60;步骤1中所述在油中加入油溶性表面活性剂,是每毫升油中添加0.5-5毫克油溶性表面活性剂Span80。
上述方案中,步骤2中所述水溶性含双键高分子化合物和油的油包水乳液,是通过采用乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制备得到。
上述方案中,步骤3中所述油包水乳液经-20℃、-80℃和液氮程序降温,包括:从常温转移至-20℃环境冷冻中0-24h,从-20℃环境转移至-80℃环境中冷冻0-12h,从-80℃环境转移至液氮环境中冷冻0-30min。
上述方案中,步骤4中所述清洗冷冻干燥包括:丙酮洗涤3-5次后,去离子水洗3-5次;液氮冷冻10-15分钟后,置于冷冻干燥机中冷冻干燥24-48小时。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出,本发明的有益效果:
1、本公开提供的可注射晶胶微球细胞扩增载体及其制备方法,不同于传统的水凝胶微球,其具有可控的贯通多孔结构,且孔结构由冷冻程序控制,支持细胞的贴附、增殖和迁移,在注射过程中保护细胞免受剪切力的影响,维持细胞活性。
2、本公开提供的可注射晶胶微球细胞扩增载体,可作为模块化细胞载体,支持多细胞共培养,例如人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞共培养,成为细胞间相互作用的研究平台。
3、本公开提供的可注射晶胶微球细胞扩增载体,还可以作为组织工程支架,负载细胞、生长因子或药物后,注射入组织缺损部位,促进多种组织再生。
附图说明
本公开的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是依照本公开实施例的制备可注射晶胶微球细胞扩增载体的方法流程图;
图2为依照本公开实施例1-3中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H的扫描电子显微镜照片;
图3为依照本公开实施例2中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-M负载hBMSC的激光共聚焦照片;
图4为依照本公开实施例8中干性基因表达的示意图;
图5为依照本公开实施例9中成骨基因表达的示意图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本公开进一步详细说明。
下面详细描述本公开的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本公开,而不能理解为对本公开的限制。
在本公开的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本公开的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
在本公开的描述中,除非另有明确的规定和限定,第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触,也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且,第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方,或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方,或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本公开的不同结构。为了简化本公开的公开,下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然,它们仅仅为示例,并且目的不在于限制本公开。此外,本公开可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母,这种重复是为了简化和清楚的目的,其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。此外,本公开提供了的各种特定的工艺和材料的例子,但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
在细胞的大规模扩增和有效递送技术中,相对于脂肪族聚酯,使用水凝胶材料制备的微球既保留了微载体的模块化优势,又提供了足够的细胞结合位点,是下一代细胞扩增和递送的理想载体材料。微球的表面拓扑结构是影响细胞贴附效率和递送能力的关键因素。相比于光滑表面,具有多孔结构的微球显示出更高的细胞贴附率和活性,多孔结构能够支持细胞向微球内部迁移并且在注射过程中保护细胞,避免细胞因受到注射的剪切力而受损。
冷冻-交联方法是制备孔径大于1μm的大孔水凝胶最简单的方法,这种具备特殊结构的多孔水凝胶又称为晶胶。聚合物溶液首先在溶剂的冰点以下冷冻形成冰晶,聚合物分子在冷冻状态下经历交联过程,样品解冻后,即形成具有连通大孔结构的凝胶。晶胶制备方法简单,设备要求低,样品具有连通的多孔结构,有利于营养物质交换和代谢废物的排出,促进细胞增殖和迁移,保持细胞活性。
目前针对细胞的大规模扩增和有效递送的细胞载体中,块状水凝胶不利于干细胞的铺展、增殖和迁移,而聚酯微球缺乏细胞结合位点、降解产物呈酸性,本公开的目的是发展一种易于细胞贴附和增殖,增强细胞功能,并且在注射过程中保护细胞的具有大孔结构的可注射晶胶微球细胞载体。晶胶微球由程序化冷冻紫外光交联方法制备,晶胶微球具备可控的贯通多孔结构,其孔结构由冷冻程序控制。
在本公开的一个实施例中,提供了一种可注射晶胶微球细胞扩增载体,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体是具备可控的贯通多孔结构、且具有形状记忆性能的晶胶微球。其中,所述晶胶微球的直径为25-999μm,所述多孔结构由冷冻程序控制。所述晶胶微球是通过对水溶性含双键高分子化合物中的一种或多种执行程序化冷冻和紫外光交联得到。
在本公开的一个实施例中,所述水溶性含双键高分子化合物是选自聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化壳聚糖或甲基丙烯酸酐化透明质酸HAMA中的一种或多种。
在本公开的一个实施例中,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体是可以在细胞培养板、细胞培养瓶或生物反应器中作为载体来扩增细胞,所述细胞可以是胚胎干细胞、间充质干细胞、脂肪源性干细胞、诱导多能干细胞、牙源性干细胞或人脐静脉内皮细胞等。
在本公开的一个实施例中,在使用所述可注射晶胶微球细胞扩增载体扩增干细胞时,能够维持干细胞的干性,并在诱导条件下诱导干细胞多向分化。
在本公开的一个实施例中,在使用所述可注射晶胶微球细胞扩增载体扩增细胞后,是使用胰酶消化液将细胞从所述可注射晶胶微球细胞扩增载体上消化分离单独使用,或者直接将负载有细胞的所述可注射晶胶微球细胞扩增载体通过注射器注射使用;在注射过程中,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体的大孔结构和形状记忆性能保护细胞免受剪切力和摩擦力的伤害。
基于上述本公开实施例提供的可注射晶胶微球细胞扩增载体,本公开实施例还提供了一种制备可注射晶胶微球细胞扩增载体的方法,如图1所示,该方法包括以下步骤:
步骤1:将水溶性含双键高分子化合物溶于去离子水中,加入光引发剂和水溶性表面活性剂,混合均匀后得到第一溶液A;在油中加入油溶性表面活性剂,混合均匀后得到第二溶液B;
步骤2:将第一溶液A加入第二溶液B中,得到水溶性含双键高分子化合物和油的油包水乳液;
步骤3:将所述油包水乳液经-20℃、-80℃和液氮程序降温后,并经365nm紫外光交联得到晶胶微球;
步骤4:离心收集晶胶微球,清洗冷冻干燥,得到所述可注射晶胶微球细胞扩增载体。
在本公开的一个实施例中,步骤1中所述水溶性含双键高分子化合物是选自聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化壳聚糖或甲基丙烯酸酐化透明质酸HAMA中的一种或多种。
在本公开的一个实施例中,步骤1中所述油为食用油、液体石蜡或矿物油中的一种。
在本公开的一个实施例中,步骤1中所述光引发剂为I2959,所述水溶性表面活性剂为Tween 60,所述油溶性表面活性剂为Span 80。
在本公开的一个实施例中,步骤1中所述光引发剂I2959与水溶性含双键高分子化合物的质量配比在1∶10-1∶100之间;所述将水溶性含双键高分子化合物溶于去离子水中得到高分子水溶液,所述高分子水溶液的浓度为1-20wt%,每毫升高分子水溶液中添加0.5-5毫克水溶性表面活性剂Tween 60。
在本公开的一个实施例中,步骤1中所述在油中加入油溶性表面活性剂,是每毫升油中添加0.5-5毫克油溶性表面活性剂Span 80。
在本公开的一个实施例中,步骤2中所述水溶性含双键高分子化合物和油的油包水乳液,是通过采用乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制备得到。
在本公开的一个实施例中,步骤3中所述油包水乳液经-20℃、-80℃和液氮程序降温,包括:从常温转移至-20℃环境冷冻中0-24h,从-20℃环境转移至-80℃环境中冷冻0-12h,从-80℃环境转移至液氮环境中冷冻0-30min。
在本公开的一个实施例中,步骤4中所述清洗冷冻干燥包括:丙酮洗涤3-5次后,去离子水洗3-5次;液氮冷冻10-15分钟后,置于冷冻干燥机中冷冻干燥24-48小时。
下面结合具体实施例,进一步阐述本公开提供的可注射晶胶微球细胞载体的制备方法。
实施例1:小孔可注射GelMA晶胶微球细胞扩增载体的制备
(1)将1克GelMA溶于20毫升去离子水中,加入0.02克光引发剂I2959和50毫克水溶性表面活性剂Tween 60混合均匀后得到第一溶液A(水相);在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80,混合均匀,得到第二溶液B(油相)。
(2)将第一溶液A加入第二溶液B中,冰水浴环境,300rpm机械搅拌10分钟得到GelMA/油的油包水乳液。
(3)将步骤(2)所得油包水乳液直接置于液氮中冷冻10min,365nm紫外光交联得到GelMA晶胶微球。
(4)离心收集晶胶微球,丙酮洗涤3次后,去离子水洗3次,冷冻干燥,得到所述小孔可注射GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-L,CMS-L直径为100-200μm,孔径为3-5μm。
图2示出了本公开实施例中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-L的扫描电子显微镜照片。
实施例2:中孔可注射GelMA晶胶微球细胞扩增载体的制备
(1)将1克GelMA溶于20毫升去离子水中,加入0.02克光引发剂I2959和50毫克水溶性表面活性剂Tween 60混合均匀后得到第一溶液A(水相);在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80,混合均匀,得到第二溶液B(油相)。
(2)将第一溶液A加入第二溶液B中,冰水浴环境,300rpm机械搅拌10分钟得到GelMA/油的油包水乳液。
(3)将步骤(2)所得油包水乳液依次放入-20℃中30min、-80℃中30min和液氮中10min程序降温,365nm紫外光交联得到GelMA晶胶微球。
(4)离心收集GelMA晶胶微球,丙酮洗涤3次后,去离子水洗3次,冷冻干燥,得到所述中孔可注射GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-M。CMS-M直径为100-200μm,孔径为12-20μm。
图2示出了本公开实施例中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-M的扫描电子显微镜照片。
实施例3:大孔可注射GelMA晶胶微球细胞扩增载体的制备
(1)将1克GelMA溶于20毫升去离子水中,加入0.02克光引发剂I2959和50毫克水溶性表面活性剂Tween 60混合均匀后得到第一溶液A(水相);在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80,混合均匀,得到第二溶液B(油相)。
(2)将第一溶液A加入第二溶液B中,冰水浴环境,300rpm机械搅拌10分钟得到GelMA/油的油包水乳液。
(3)将步骤(2)所得油包水乳液依次放入-20℃中12h、-80℃中30min和液氮中10min程序降温,365nm紫外光交联得到GelMA晶胶微球。
(4)离心收集GelMA晶胶微球,丙酮洗涤3次后,去离子水洗3次,冷冻干燥,得到所述大孔可注射GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-H。CMS-H直径为150μm,孔径为20-40μm。
图2示出了本公开实施例中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-H的扫描电子显微镜照片。
实施例4:可注射PEGDA晶胶微球细胞扩增载体的制备
(1)将1克PEGDA溶于20毫升去离子水中,加入0.02克光引发剂I2959和50毫克水溶性表面活性剂Tween 60混合均匀后得到第一溶液A(水相);在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80,混合均匀,得到第二溶液B(油相)。
(2)将第一溶液A加入第二溶液B中,冰水浴环境,300rpm机械搅拌10分钟得到PEGDA/油的油包水乳液。
(3)将步骤(2)所得油包水乳液依次放入-20℃中30min、-80℃中30min和液氮中10min程序降温,365nm紫外光交联得到PEGDA晶胶微球。
(4)离心收集PEGDA晶胶微球,丙酮洗涤3次后,去离子水洗3次,冷冻干燥,得到所述可注射PEGDA晶胶微球细胞扩增载体CMS-PEGDA。
实施例5:可注射GelMA-PEGDA晶胶微球细胞扩增载体的制备
(1)将0.5克GelMA和0.5克PEGDA溶于20毫升去离子水中,加入0.02克光引发剂I2959和50毫克水溶性表面活性剂Tween 60混合均匀后得到第一溶液A(水相);在200毫升油中加入500毫克油溶性表面活性剂Span 80,混合均匀,得到第二溶液B(油相)。
(2)将第一溶液A加入第二溶液B中,冰水浴环境,300rpm机械搅拌10分钟得到GelMA-PEGDA/油的油包水乳液。
(3)将步骤(2)所得油包水乳液依次放入-20℃中30min、-80℃中30min和液氮中10min程序降温,365nm紫外光交联得到GelMA-PEGDA晶胶微球。
(4)离心收集GelMA-PEGDA晶胶微球,丙酮洗涤3次后,去离子水洗3次,冷冻干燥,得到所述可注射GelMA-PEGDA晶胶微球细胞扩增载体CMS-GelMA-PEGDA。
以下实施例6-10是对本公开提供的可注射晶胶微球细胞扩增载体的具体应用。
实施例6:GelMA晶胶微球细胞扩增载体静态培养骨髓间充质干细胞
选取实施例1-3制备的GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H,如图2所示,图2为依照本公开实施例1-3中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H的扫描电子显微镜照片。可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H,各取3毫克,经消毒后置于细胞培养24孔板中,选取人来源骨髓间充质干细胞(hBMSC)作为模型细胞,每孔分别滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)。每两天更换一次细胞培养基,在第7天将培养基全部吸出,平衡盐溶液清洗3遍后,分别使用CCK-8试剂检测细胞增殖和免疫荧光染色对黏着斑蛋白(vinculin)进行染色。结果显示,CMS-M表面细胞增殖能力和黏着斑蛋白表达均最强。
实施例7:GelMA晶胶微球细胞扩增载体在生物反应器中旋转培养骨髓间充质干细胞
选取实施例1-3制备的GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H,如图2所示,图2为依照本公开实施例1-3中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H的扫描电子显微镜照片。可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-L、CMS-M和CMS-H,各取0.5g克,经消毒后分别置于不同生物反应器中,选取人来源骨髓间充质干细胞作为模型细胞,生物反应器中加入50毫升细胞悬液(含2×106个细胞),接种一天后,补加培养基至100毫升,培养期间搅拌速度为30rpm。每两天更换50毫升细胞培养基,在第7天将培养基全部吸出,平衡盐溶液清洗3遍后,分别使用CCK-8试剂检测细胞增殖和免疫荧光染色对黏着斑蛋白(vinculin)进行染色。结果显示,CMS-M表面细胞增殖能力和黏着斑蛋白表达均最强。
实施例8:GelMA晶胶微球细胞扩增载体负载干细胞后的维持干细胞干性
将实施例2制备的GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-M,取3毫克,经消毒后置于细胞培养24孔板中,选取人来源骨髓间充质干细胞(hBMSC)作为模型细胞,每孔分别滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)。如图3所示,图3为依照本公开实施例2中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-M负载hBMSC的激光共聚焦照片。每两天更换一次细胞培养基,在第7天将培养基全部吸出,平衡盐溶液清洗3遍后,使用RT-qPCR检测干性基因Nanog和SOX-2,在普通培养板上培养的细胞作为对照。如图4所示,图4为依照本公开实施例8中干性基因表达的示意图。
实施例9:GelMA晶胶微球细胞扩增载体负载干细胞后再成骨诱导条件下促进干细胞成骨分化
将实施例2制备的GelMA晶胶微球细胞扩增载体CMS-M,取3毫克,经消毒后置于细胞培养24孔板中,选取人来源骨髓间充质干细胞(hBMSC)作为模型细胞,每孔分别滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)。如图3所示,图3为依照本公开实施例2中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-M负载hBMSC的激光共聚焦照片。使用成骨诱导培养基(OM)培养,每两天更换一次细胞培养基,在第7天将培养基全部吸出,平衡盐溶液清洗3遍后,使用RT-qPCR检测成骨基因ALP和COL-1。使用普通增殖培养基(PM)在培养板和CMS-30上培养的以及使用成骨诱导培养基在培养板上培养作为对照。如图5所示,图5为依照本公开实施例9中成骨基因表达的示意图。
实施例10:GelMA晶胶微球细胞载体在多细胞共培养及体内注射的应用
选取实施例2制备的GelMA晶胶微球细胞载体CMS-M,取3毫克,经消毒后置于细胞培养24孔板中,分为负载人来源骨髓间充质干细胞(hBMSC)组和负载人脐静脉内皮细胞(HUVEC)组,每孔分别滴加1毫升细胞悬液(含1万个细胞)。如图3所示,图3为依照本公开实施例2中制备的可注射晶胶微球细胞扩增载体CMS-M负载hBMSC的激光共聚焦照片。在第3天将培养基全部吸出,将对应的hBMSC组和HUVEC组转移至新的细胞培养12孔板中,即hBMSC组和HUVEC组在细胞培养板的同一孔中共培养,每两天更换一次细胞培养基,培养7天后注射入裸鼠皮下,记为CMS-M-hBMSC-HUVEC,同时将同样培养条件下仅负载hBMSC和HUVEC的CMS-M注射入裸鼠皮下,记为CMS-M-hBMSC和CMS-M-HUVEC。裸鼠饲养一个月后安乐死,取背部注射区域皮下,通过免疫组织化学染色验证共培养细胞的成血管能力。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“某些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合所述实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述的具体实施例,对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本公开的具体实施例而已,并不用于限制本公开,凡在本公开的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可注射晶胶微球细胞扩增载体,其特征在于,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体是具备可控的贯通多孔结构、且具有形状记忆性能的晶胶微球。
2.根据权利要求1所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体,其特征在于,所述晶胶微球的直径为25-999μm,所述多孔结构由冷冻程序控制。
3.根据权利要求1所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体,其特征在于,所述晶胶微球是通过对水溶性含双键高分子化合物中的一种或多种执行程序化冷冻和紫外光交联得到。
4.根据权利要求3所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体,其特征在于,所述水溶性含双键高分子化合物是选自聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化壳聚糖或甲基丙烯酸酐化透明质酸HAMA中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体,其特征在于,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体是在细胞培养板、细胞培养瓶或生物反应器中作为载体来扩增细胞,所述细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脂肪源性干细胞、诱导多能干细胞、牙源性干细胞或人脐静脉内皮细胞;
在使用所述可注射晶胶微球细胞扩增载体扩增干细胞时,能够维持干细胞的干性,并在诱导条件下诱导干细胞多向分化;
在使用所述可注射晶胶微球细胞扩增载体扩增细胞后,是使用胰酶消化液将细胞从所述可注射晶胶微球细胞扩增载体上消化分离单独使用,或者直接将负载有细胞的所述可注射晶胶微球细胞扩增载体通过注射器注射使用;在注射过程中,所述可注射晶胶微球细胞扩增载体的大孔结构和形状记忆性能保护细胞免受剪切力和摩擦力的伤害。
6.一种权利要求1至5中任一项所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体的制备方法,其特征在于,该方法包括:
步骤1:将水溶性含双键高分子化合物溶于去离子水中,加入光引发剂和水溶性表面活性剂,混合均匀后得到第一溶液A;在油中加入油溶性表面活性剂,混合均匀后得到第二溶液B;
步骤2:将第一溶液A加入第二溶液B中,得到水溶性含双键高分子化合物和油的油包水乳液;
步骤3:将所述油包水乳液经-20℃、-80℃和液氮程序降温后,并经365nm紫外光交联得到晶胶微球;
步骤4:离心收集晶胶微球,清洗冷冻干燥,得到所述可注射晶胶微球细胞扩增载体。
7.根据权利要求6所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体的制备方法,其特征在于,
步骤1中所述水溶性含双键高分子化合物是选自聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA、甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化壳聚糖或甲基丙烯酸酐化透明质酸HAMA中的一种或多种;
步骤1中所述油为食用油、液体石蜡或矿物油中的一种;
步骤1中所述光引发剂为I2959,所述水溶性表面活性剂为Tween 60,所述油溶性表面活性剂为Span 80;
步骤1中所述光引发剂I2959与水溶性含双键高分子化合物的质量配比在1∶10-1∶100之间;
步骤1中所述将水溶性含双键高分子化合物溶于去离子水中得到高分子水溶液,所述高分子水溶液的浓度为1-20wt%,每毫升高分子水溶液中添加0.5-5毫克水溶性表面活性剂Tween 60;
步骤1中所述在油中加入油溶性表面活性剂,是每毫升油中添加0.5-5毫克油溶性表面活性剂Span 80。
8.根据权利要求6所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体的制备方法,其特征在于,步骤2中所述水溶性含双键高分子化合物和油的油包水乳液,是通过采用乳液搅拌、静电喷射、3D打印或微流控方法制备得到。
9.根据权利要求6所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体的制备方法,其特征在于,步骤3中所述油包水乳液经-20℃、-80℃和液氮程序降温,包括:
从常温转移至-20℃环境冷冻中0-24h,从-20℃环境转移至-80℃环境中冷冻0-12h,从-80℃环境转移至液氮环境中冷冻0-30min。
10.根据权利要求6所述的可注射晶胶微球细胞扩增载体的制备方法,其特征在于,步骤4中所述清洗冷冻干燥包括:
丙酮洗涤3-5次后,去离子水洗3-5次;液氮冷冻10-15分钟后,置于冷冻干燥机中冷冻干燥24-48小时。
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