CN115813865B - 一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种负载重组人松弛素‑2的可吸入多孔微球及其制备方法，属于生物医药技术领域。制备方法的步骤为：（1）将重组人松弛素‑2溶解在含有牛血清白蛋白的PBS中，作为内部水相，将载体材料酯封端聚乳酸共聚物OH‑PLGA75/25‑COOR溶解在二氯甲烷中，作为油相；制备W1/O乳液；（2）将步骤（1）获得的W1/O乳液注入PVA溶液中，制备负载RLX的无孔微球（RLX@SMs）；（3）将步骤（2）中获得的RLX@SMs再采用程序降温法制备负载重组人松弛素‑2的多孔微球。本发明获得的RLX@PMs具有较大的几何直径，可以长期释放药物，且其空气动力学直径较小，有利于在肺部深部的高沉积。

Description

一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

特发性肺纤维化（IPF）导致肺功能恶化，目前还没有针对该疾病病因的有效治疗方法。重组人松弛素-2（RLX）是20世纪初发现的在孕期分娩前大量分泌的对产道有松弛作用的多肽类激素，可在多种组织器官内起到扩张血管、诱导细胞外基质降解以及逆转成纤维细胞激活的作用，从而抑制纤维化发展，是一种很有前途的抗结构重塑和抗肺纤维化的生物治疗候选药物。然而，由于其为蛋白多肽类药物，血液循环半衰期极短（约10分钟），经静脉注射后极少能到达靶器官发挥药效，要达到最佳疗效需要持续输液或重复注射。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种负载重组人松弛素-2（RLX）的可吸入多孔微球及其制备方法，本发明针对负载RLX的多孔微球（RLX@PMs），通过吸入给药评估了其对IPF的治疗效用。RLX@PMs具有较大的几何直径，作为RLX的药物储库，可以长期释放药物，且由于其多孔结构，空气动力学直径较小，有利于在肺部深部的高沉积。结果显示，药物的释放时间延长到了第24天，而且释放的药物保持了其肽的结构和活性。本发明的技术方案如下：

一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球的制备方法，步骤如下：

（1）将重组人松弛素-2（RLX）溶解在含有牛血清白蛋白（BSA）的PBS中，作为内部水相，并将载体材料酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR溶解在二氯甲烷（DCM）中，作为油相；将内部水相加入到油相中，在10000 rpm的速度下高速剪切2分钟后形成油包水(W1/O)乳液；以20%（v/v）的聚乙烯醇（PVA）溶液作为外部水相；

（2）将步骤（1）获得的油包水(W1/O)乳液注入预先置于冰浴中预冷的20%（v/v）的PVA溶液中，利用高速剪切力混合乳化2分钟，形成水包油 (O/W2)乳液，在冰水中搅拌，使DCM蒸发，通过5000-8000 rpm离心5-8分钟收集无孔微球，用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗，收集全部沉淀，即可得到负载RLX的无孔微球（RLX@SMs）；

（3）将步骤（2）中获得的负载RLX无孔微球再采用程序降温法制备负载重组人松弛素-2的多孔微球（RLX@PMs），具体步骤为：首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻4-6小时，然后立即转移到-80℃冰箱中放置8小时，最后转移至冷冻干燥机中进行24小时的冷冻干燥，即可得到多孔微球。

优选的，所述步骤（1）中将重组人松弛素-2（RLX）溶解在含有0.1%（v/w）的牛血清白蛋白（BSA）的PBS中。

优选的，所述步骤（1）中酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR中LA：GA=75：25，分子量MW28500。

优选的，所述步骤（1）中将载体材料酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR溶解在二氯甲烷（DCM）中，浓度为100 mg/mL，作为油相。

优选的，所述步骤（2）中水包油 (O/W2)乳液，在冰水中搅拌，使DCM蒸发，通过8000rpm离心5分钟收集无孔微球。

优选的，所述步骤（2）中将收集的无孔微球用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗洗三次。

优选的，所述步骤（3）中首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻4小时。

本发明还包括，通过上述方法制备的负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球；其粒径大小为8-10μm；其颗粒密度和孔隙率分别为0.199±0.041 g·cm^-3和95.0±0.8%。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明所采用的复乳化法结合梯度冷却技术是制备负载蛋白多肽类药物的多孔微球的一种简便、超快、成本低、环保的方法，这种方法可以避免使用致孔剂，从而避免在多孔微球的工业生产过程中致孔剂的残留问题所致的安全隐患。本发明获得的可吸入多孔微球具有较大的几何直径，粒径大小为8-10μm，作为RLX的药物储库，可以长期释放药物；由于其多孔结构，空气动力学直径较小，有利于在肺部深部的高沉积，且具有优良的蛋白负载效率，其中载药量为0.89±0.22%，包封效率为82.23±3.75%。颗粒密度和孔隙率分别为0.199±0.041 g·cm^-3和95.0±0.8%，低密度与高孔隙率有利于微球吸入给药后的肺部沉积。

（2）体外药物释放显示了多孔微球中负载的药物的释放时间可长达24天以上，且没有出现明显的初始爆发性释放。而多孔微球在肺部的生物分布显示其缓释作用至少持续了1.5个月，且由于多孔微球的实际密度小，可导致很多微球进入肺深部组织，达到于靶部位的更多比例的有效沉积。相较于无载体保护的游离药物，其不会从肺部迅速消除，而无孔微球大多沉积于胃部而不是呼吸道。

（3）在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，组织病理学分析显示RLX@PMs在单次吸入后缓解了小鼠肺部组织胶原蛋白过度沉积、结构扭曲和顺应性下降等影响。对各组小鼠的吸入RLX@PMs可显著增强博来霉素诱导的肺损伤后的肺功能恢复，并可改善肺功能，从而提高生存周期。此外，RLX@PMs显示出比频繁灌服吡非尼酮更好的安全性。因此，RLX以多孔微球为载体于肺深处缓慢释放在有效治疗肺部纤维化方面极具潜力。

附图说明

图1为无孔(a)和多孔微球(b)的干燥的微球粉末和重悬后的混悬液；两种微球的SEM图像和明场及罗丹明B荧光场图像，比例尺，均为10微米；

图2为负载在无孔（a）和多孔微球（b）制剂中的模型蛋白BSA的累积

释放曲线；数据为平均值±SD，每个时间点n=3；

图3为负载罗丹明b的多孔微球在一次性吸入后4至48天内于小鼠气道中保留的活体成像图；

图4为对各组小鼠肺组织进行活体高分辨率micro-CT扫描结果，在不同治疗时间点监测RLX@PMs对BLM诱导的肺纤维化的保护作用；

图5为治疗各组小鼠的体重变化曲线图；所有定量数据均为平均值±SD（n=5）；

图6为各组药物干预4周后的小鼠肺部系数。所有定量数据均为平均值±SD（n=5）；

图7为用不同药物治疗数周后的小鼠肺部的组织病理学分析；其中7a为苏木精和伊红染色染色；7b为Masson染色以确定肺组织中胶原蛋白的沉积变化；比例尺，100微米；

图8为各治疗组肺部组织的天狼星红染色后进行偏振光显微镜拍摄图像（放大倍数×400）；

图9为马森染色后肺组织中I型胶原蛋白的沉积变化定量分析，n=3只动物/组；

图10为天狼星红染色后胶原蛋白定量分析，n=3只动物/组。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球及其制备方法

（1）将重组人松弛素-2（RLX）溶解在含有0.1%（v/w）的牛血清白蛋白（BSA）的0.2mlPBS中，作为内部水相，并将一定量的载体材料酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR（LA：GA=75：25，分子量MW28500）溶解在1mL二氯甲烷（DCM）中，浓度为100 mg/mL，作为油相。将内部水相加入到油相中，在10000 rpm的速度下高速剪切2分钟后形成油包水（W1/O）乳液。准备了20%（v/v）的聚乙烯醇（PVA）溶液作为外部水相。

（2）将步骤（1）获得的油包水(W1/O)乳液注入5mL预先置于冰浴中预冷的20%（v/v）的PVA溶液中，利用高速剪切力混合乳化2分钟，形成水包油 (O/W2)乳液，在冰水中搅拌，挥发DCM 4小时，通过8000 rpm离心5分钟收集这些微球，用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗三次，收集全部沉淀。其后，采用程序降温法制备负载重组人松弛素-2的多孔微球（RLX@PMs），具体做法如下：首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻4小时，然后立即转移到-80℃冰箱中放置8小时，进行24小时的冷冻干燥，即可得到多孔微球。

实施例2：一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球及其制备方法

（1）同实施例1步骤（1）；

（2）将步骤（1）获得的油包水(W1/O)乳液注入预先置于冰浴中预冷的20%（v/v）的PVA溶液中，利用高速剪切力混合乳化2分钟，形成水包油 (O/W2)乳液，在冰水中搅拌，使DCM蒸发，通过6500 rpm离心7分钟收集无孔微球，用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗，收集全部沉淀，即可得到负载RLX的无孔微球（RLX@SMs）；

（3）将步骤（2）中获得的负载RLX无孔微球再采用程序降温法制备负载重组人松弛素-2的多孔微球（RLX@PMs），具体步骤为：首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻5小时，然后立即转移到-80℃冰箱中放置8小时，最后转移至冷冻干燥机中进行24小时的冷冻干燥，即可得到多孔微球。

实施例3：一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球及其制备方法

（1）同实施例1步骤（1）；

（2）将步骤（1）获得的油包水(W1/O)乳液注入预先置于冰浴中预冷的20%（v/v）的PVA溶液中，利用高速剪切力混合乳化2分钟，形成水包油 (O/W2)乳液，在冰水中搅拌，使DCM蒸发，通过5000 rpm离心8分钟收集无孔微球，用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗，收集全部沉淀，即可得到负载RLX的无孔微球（RLX@SMs）；

（3）将步骤（2）中获得的负载RLX无孔微球再采用程序降温法制备负载重组人松弛素-2的多孔微球（RLX@PMs），具体步骤为：首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻6小时，然后立即转移到-80℃冰箱中放置8小时，最后转移至冷冻干燥机中进行24小时的冷冻干燥，即可得到多孔微球。

实验例1：本发明获得的负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球的表征

1.1 结构表征。

观察冻干后的无孔和多孔微球。根据制造商的说明，将RLX@PMs微球重悬在溶液中，使用超景深三位置显微镜系统观察粒径分布。将冻干的微球粉末涂抹在导电胶上，用聚焦离子束-能量色散X射线光谱-扫描电子显微镜（FIB-EDS-FIB）观察微球的形貌。

1.2 多孔微球的孔隙率和密度测定

多孔微球的孔隙率和密度是用乙醇渗透法测定的。称取一定重量的冻干多孔微球，浸入5 mL无水乙醇中，超声处理10分钟，使无水乙醇完全浸入多孔微球的孔隙中。然后用无水乙醇补充到最初的5 mL刻度。冻干的RLX@PMs的重量被记录为m1。将装满无水乙醇的管子的重量记录为m2。超声处理后的RLX@PMs与无水乙醇的总重量被记录为m3。无水乙醇补充后的总重量记录为m4。吸收了乙醇的湿RLX@PMs的重量表示为m5。无水乙醇的密度为ρ_e。

RLX@PMs的孔隙率（P）计算如下：

P_RLX@PMs（%）=（m5-m2）/[m3-（m4-m5）-m2] *100%。

多孔微球的密度计算为：

ρ_RLX@PMs=m1*ρ_e/（m3+m5-m4-m2）。

1.3 药物装载和封装效率

将微球洗净后，通过离心收集上清液和所有的洗涤液，并计算溶液中的药物含量，上清液和洗涤液中药物含量是利用ELISA试剂盒通过BCA蛋白浓度检测法测定的。然后用以下公式计算封装效率（EE）和药物载药量（DL）。

EE%=W_封装的BSA/W_总BSA×100%。

DL%=W_封装的BSA/W_RLX@PMs× 100%。

1.4 体外释放行为

由于RLX含量较低，且释放缓慢，在长期释放实验中不易检测，牛血清白蛋白（BSA）被用作长期缓释递送体系的体外释放实验最稳定和最广泛使用的模型蛋白之一。因此在此实验中我们采用BSA的释放行为进行监测，BSA本身也是制备负载RLX微球的蛋白稳定剂，用于制备负载BSA的多孔微球的过程与负载RLX的过程完全相同。将加载了模型蛋白的无孔或多孔微球（50 mg）与2 mL释放介质一起放入透析袋（分子量截止为28.5kDa），并悬浮在30mL试管中。释放介质是磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4，37℃）。试管在气浴恒温振动器中以100r/min的速度摆动。在所需的时间间隔，提取2 mL的释放介质，然后加入同体积的新鲜介质。释放的样品被保存在冰箱中，直到用ELISA试剂盒进行定量。

1.5 实验结果

1.5.1微球的表征

通过水包油包水（W1/O/W2）法形成PLGA无孔微球，并进一步通过梯度冷却法制备多孔微球，冷冻干燥后得到干燥的多孔的PLGA微球。相比之下，使用同样的双乳化法制备的无孔微球，但没有程序化冷却，溶剂蒸发后直接冻干，得到白色粉末（图1a）。多孔微球经冻干后亦得到了白色蓬松的粉末，且重悬性能比无孔微球更好。通过SEM分析观察两种微球的形态，图像可显示所制备的无孔和多孔微球的形态和分散性。如图1b所示，RLX@PMs具有多孔的球形结构，形状圆整，尺寸分布均匀，粒径分布多在8-10μm之间，微球较大的几何尺寸可以大大延长其在肺部的停留时间。此外，负载荧光染料（罗丹明B）的多孔微球表明这些微球具有明显的、均匀的和紧凑的孔隙结构，这可能有利于重组人松弛素-2的负载与递送。根据制造商说明方法，以BSA为模型蛋白，验证了微球的负载效率，PLGA微球的载药量为0.89±0.22%，包封效率为82.23±3.75%。微球的颗粒密度和孔隙率分别为0.199±0.041 g·cm^-3和95.0±0.8%。这些观察结果表明，梯度降温冷冻技术（不使用致孔剂）是制备多孔微球的一种高效和环保的方法。

1.5.2微球的体外释放行为考察

在37℃的磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）中，研究了无孔及多孔微球在体外的释放效率。体外药物释放曲线（图2a和2b）显示了从载药多孔和无孔微球中累计药物释放百分比的均具有时间依赖性。很明显，多孔微球中负载的药物的释放时间可长达24天以上，且没有出现明显的初始爆发性释放。然而在相同的释放时间里，负载在无孔微球中的BSA的累积释放率只有24%，可以预见其释放过程将持续更长的时间。

实验例2：体内研究

2.1 建立博莱霉素诱导的小鼠模型

C57BL/6J小鼠（20±2g，雌性）由北京生命河实验动物技术有限公司提供。并在特定的无病原体动物设施中维持。对于纤维化的诱导，用100μlL博莱霉素（浓度为1 mg/mL）经气管插管处理小鼠（5 mg/Kg）。

2.2 评估多孔微球在体内的生物分布和保留时间

通过雾化吸入罗丹明B（rhodamine B）标记的无孔PLGA微球（rhodamine B@SMs）或多孔PLGA微球（rhodamine B@PMs），以游离的罗丹明B（rhodamine B -free）为对照，评估其生物分布和保留时间。每隔一段时间通过小动物活体成像系统获得实时荧光图像。相同剂量的游离罗丹明作为对照组进行同样的处理。

2.3 评估抗纤维化能力的效果

给予博来霉素两周后，将小鼠分为四组。为每只小鼠进行一次性雾化吸入负载RLX的多孔微球（含RLX 70μg/只）给药（RLX@PMs组）。同样，每天以5μg/只的剂量进行游离的RLX溶液的雾化吸入给药，持续给药时间为两周（RLX-free组）。此外还设置了只雾化吸入PBS的空白对照组（PBS组）。吡非尼酮被用作阳性对照，每天以300 mg/kg的剂量为小鼠灌胃给药，持续两周（PFD组）。每两天记录一次小鼠的体重。

为了进一步检查，在麻醉后，使用小型动物的微型计算机断层扫描（micro-CT）成像系统对每只小鼠进行活体逐层扫描（扫描参数：扫描分辨率，18μm；电压，70kV；电流，100μA）以获得整个肺部扫描图像。治疗后，所有小鼠都被处死，收集组织作进一步分析，并通过肺部湿重计算肺系数（Lung coefficient)。

2.4 苏木精和伊红染色、马森三色染色和天狼星红染色

除进行活体影像学检查外，我们还根据厂家的说明，使用苏木精和伊红（H&E）、马森（Masson）三色染色和天狼星红染色来检测肺部的组织学变化和胶原蛋白的沉积。小鼠安乐死后，取整个肺组织于4%多聚甲醛中固定过夜。然后按照标准程序进行梯度脱水，将组织进行石蜡包埋。将小鼠的肺组织包埋在石蜡中并切成3μm的切片后，进行H&E染色。根据Masson三色染色试剂盒的操作说明进行染色。蓝色的胶原组织在光学显微镜下是可见的。使用VS120虚拟载玻片显微镜对染色的切片进行观察和拍照，在100倍放大倍数下评价间质纤维化严重程度是通过测量蓝色染色面积的百分比分析的。此外，天狼星红染色是通过使用天狼星红染色试剂盒进行的，染色后通过偏振光显微镜扫描染色切片，根据图像评估肺部胶原蛋白的沉积程度，所有的胶原蛋白密度数据的量化是用ImageJ软件进行的。

2.5 实验结果

2.5.1多孔微球在小鼠肺部沉积

通过近红外射线（NIR）染料（罗丹明B）的活体成像研究rhodamine B@PMs的肺部组织的沉积情况。我们发现，rhodamine B@PMs在给药后更多地沉积在胃肠道而不是肺部，相比之下，rhodamineB@PMs和游离染料却在肺部沉积的荧光信号比例更高，如图3所示。推测其原因是无孔微球的实际密度过大，导致很多微球进入下呼吸道。游离染料组rhodamineB-free的荧光信号在2周内全部消失，这表明没有载体保护的游离药物会从肺部迅速消除。相比之下，rhodamineB@PMs的缓释作用至少持续了1.5个月，这也是微球具有显著的持续释放效应的原因。

2.5.2RLX@PMs的体内抗纤维化作用

接下来进一步评估了RLX@PMs在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型体内的抗纤维化能力。所有的动物都被定期给药，对小鼠的肺部纤维化程度进行影像学检查。Micro-CT扫描结果显示，博来霉素的诱导导致了明显的肺部结构变化，在2周时小鼠肺部出现广泛的肺部纤维化改变。在治疗4周后，如图4所示，PBS组表现出持续进展性的严重肺纤维化程度，而阳性对照药物PFD组也仍然表现出一定程度的纤维化表现，RLX-free组和RLX@PMs组均可以达到接近于正常的肺部结构。此外，根据小鼠体重变化曲线（图5），PBS和PFD组的小鼠均表现出进行性消瘦，甚至PFD组的小鼠在三周内全部死亡。我们注意到，RLX@PMs治疗组的肺部湿重在四周时明显低于PBS治疗组（p<0.01）（图6）。相对于频繁给药的游离药物，在博莱霉素诱导的小鼠模型中，单次吸入RLX@PMs恢复肺部结构效果更好。综上所述，这些数据表明，博莱霉素治疗导致明显的肺纤维化和肺功能损害，而RLX@PMs的吸入则可阻止博莱霉素诱导的肺纤维化的进展并保留肺功能。这些结果有力地表明，RLX在长时间持续给药的情况下，在IPF的治疗方面极具有临床转化潜力。

2.5.3苏木精和伊红、Masson三色和天狼星红染色检查结果

通过检查肺部组织病理学来评估气道炎症和组织损伤程度。小鼠慢性暴露于博来霉素会增加气道重塑、血管生成和实质的炎症，但用PFD或RLX治疗会减弱这些影响。如图7a的H&E染色结果所示，在吸入PBS的博来霉素诱导的纤维化小鼠模型中，支气管周围和血管周围空间的炎症细胞积累明显增加，但在接受RLX@PMs的肺部切片中明显减少。与这些结果相一致的是，用Masson三色染色法分析支气管周围的纤维化（图7b、图9），发现吸入RLX或PFD的小鼠的胶原蛋白积累比PBS组的减少。RLX@PMs组的胶原蛋白沉积量较少，这表明肺功能有所改善。

在偏振光显微镜下，1型胶原纤维是紧密排列的红色纤维，显示出强烈的双折射；III型胶原纤维是稀疏的网状结构，显示出弱双折射，是细小的绿色纤维。如图8和图10所示，天狼猩红染色结果显示IPF小鼠的肺组织中有明显的胶原蛋白沉积，阳性对照小鼠表现出轻微的治疗效果。结果表明，RLX-free或RLX@PMs治疗有效地抑制了肺纤维化小鼠的疾病进展。

Claims (5)

1.一种负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

（1）将重组人松弛素-2RLX溶解在含有牛血清白蛋白的PBS中，作为内部水相，并将载体材料酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR溶解在二氯甲烷中，作为油相；将内部水相加入到油相中，在10000 rpm的速度下高速剪切2分钟后形成油包水W1/O乳液；以20% v/v的聚乙烯醇PVA溶液作为外部水相；

（2）将步骤（1）获得的油包水W1/O乳液注入预先置于冰浴中预冷的20% v/v的PVA溶液中，利用高速剪切力混合乳化2分钟，形成水包油O/W2乳液，在冰水浴中搅拌，使DCM蒸发，以5000-8000 rpm的转速离心5-8分钟收集无孔微球，用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗，收集全部沉淀，即可得到负载RLX的无孔微球RLX@SMs；

（3）将步骤（2）中获得的负载RLX无孔微球再采用程序降温法制备负载重组人松弛素-2的多孔微球RLX@PMs，具体步骤为：首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻4-6小时，然后立即转移到-80℃冰箱中放置8小时，最后转移至冷冻干燥机中进行24小时的冷冻干燥，即可得到多孔微球；

所述步骤（1）中将重组人松弛素-2RLX溶解在含有0.1% v/w的牛血清白蛋白的PBS中；

所述步骤（1）中酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR中LA：GA=75：25，分子量MW28500；

所述步骤（1）中将载体材料酯封端聚乳酸共聚物OH-PLGA75/25-COOR溶解在DCM中，浓度为100 mg/mL，作为油相；

所述步骤（3）中得到多孔微球的粒径大小为8-10μm，多孔微球的颗粒密度和孔隙率分别为0.199±0.041 g·cm^-3和95.0±0.8%。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中水包油O/W2乳液，在冰水中搅拌，使DCM蒸发，通过8000 rpm离心5分钟收集无孔微球。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中将收集的无孔微球用预先置于冰浴中预冷的去离子水洗洗三次。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中首先将收集的无孔微球在-20℃下冷冻4小时。

5.如权利要求1-4任一项所述制备方法制备的负载重组人松弛素-2的可吸入多孔微球。