CN110464835B - 一种胰岛素柔性微粒及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胰岛素柔性微粒及其制剂。本发明的胰岛素柔性微粒，含有胰岛素/磷脂复合物和离子型表面活性剂，为圆形或椭圆形结构的囊泡，粒径在5000nm以下，药物包封率在60％以上。本发明的胰岛素柔性微粒，还可含有非离子型表面活性剂、游离磷脂或胆固醇。本发明的胰岛素柔性微粒，在组成上既不同于现有文献报道的含有胰岛素的囊泡或柔性囊泡，也不同于现有文献报道的含有胰岛素的新型纳米囊泡，因此，具有更好的柔性和更高的跨粘膜转运能力。本发明的胰岛素柔性微粒，可加入赋形剂制成临床上可接受的剂型，用于黏膜给药、口服给药、经皮给药、肺部吸入等胰岛素非注射给药递送。

Description

一种胰岛素柔性微粒及其制剂
技术领域
本发明涉及一种胰岛素的柔性微粒及其制剂，属医药制剂技术领域。
背景技术
自从1982年FDA批准重组人胰岛素上市以来，多肽蛋白类药物在疾病治疗方面的应用日益广泛。胰岛素是治疗糖尿病的支柱性药物，但受理化性质限制，其口服给药几乎不吸收，目前临床上主要采用注射给药。但长期频繁注射用药顺应性差，给病人带来极大痛苦。为此，胰岛素非注射给药一直是医药领域关注的热点问题，但至今无实质性突破，主要制约因素是因为胰岛素的分子量大(5800Da)、脂溶性低、稳定性差，存在严重的酶屏障和膜屏障，粘膜透过性差，限制了其口服给药、粘膜给药及经皮给药等非注射给药制剂的发展。
随着高分子材料的发展和制剂学技术的进步，近年来，关于胰岛素微粒的研究报道越来越多，人们试图通过微粒包裹技术将胰岛素制成递送载体，以突破其理化性质限制，改善胃肠稳定性、提高黏膜透过性。在众多的微粒递送载体中，囊泡因其独特的构造及可塑性而备受关注。
囊泡又称脂质体，是以两亲性的磷脂为材料，形成的具有封闭双分子层结构和内水腔的球形或椭球型的微粒。囊泡壁是由脂质分子组成的双层结构，亲水性药物可被包载入内部水腔，而两亲性药物、亲脂性药物及带电亲水性药物能通过疏水或静电相互作用与囊泡双分子层结合(Critical Issues Related to Transfersomes Novel Vesicular System.ActaSci.Pol.Technol.Aliment.2012,11(1):67-82)。
传统囊泡由药物与磷脂组成，有时也会在处方中加入适量的胆固醇。胆固醇的作用是为了提高磷脂双分子膜的稳定性，降低被包封药物的泄漏(Pulmonary delivery offree and liposomal insulin.PHARMRES-DORDR.1993；10(2):228-32.；Investigation oflectin-modified insulin liposomes as carriers for oraladministration.INT JPHARMACEUT.2005；294(1-2):247-59.；Spray-freeze-dried dry powder inhalation ofinsulin-loaded liposomes for enhanced pulmonary delivery.J DRUG TARGET.2008；16(9):639-48.)。传统囊泡本身并不具有变形性，由于生物粘膜屏障的间隙小于囊泡的尺寸，因此，传统囊泡用于粘膜穿透与递送存在明显的局限性。
1992年由Cevc和Blume提出了“传质体”的概念(Lipid Vesicles Penetrate IntoIntact Skin Owing To The Transdermal Osmotic Gradients and HydrationForce.Biochimica Et Biophysica Acta.1992,1104(1):226-232)，其为一种柔性纳米囊泡，与传统囊泡相比，因在囊泡的磷脂双分子层中加入了具有边缘激活剂作用的表面活性剂，破坏磷脂双层结构的平衡，使其具有弹性和高度变形的柔性，能够通过挤压变形，穿过比其自身尺寸小得多的生物粘膜屏障。研究较多的边缘激活剂多为离子型表面活性剂，或离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂的组合，有时也会单纯使用非离子型表面活性剂。
近20年来，国内外学者对胰岛素囊泡开展了广泛研究。早期研究多集中在传统囊泡。由于胰岛素分子量大且亲脂性差，因此，传统囊泡对胰岛素的包封率普遍较低，药物在体系中的稳定性亦较差(Influence of liposomes on tryptic digestion ofinsulin.Biological and Pharmaceutical Bulletin.1993；16(5):457-61.；Doubleliposomes:hypoglycemic effects of liposomal insulin on normal rats.DRUG DEVIND PHARM.2003；29(7):725-31.；Chitosan/lecithin liposomal nanovesicles as anoral insulin delivery system.PHARM DEV TECHNOL.2017；22(3):390-8.)。之后科学家们开始将研究方向转向胰岛素的柔性囊泡。与传统囊泡相比，胰岛素柔性囊泡除磷脂或磷脂/胆固醇膜材外，还增加了离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或两者的组合。与传统囊泡相比，胰岛素柔性囊泡提高了口腔黏膜给药的降糖效果(①Tianzhi Yangetal.Phospherlipid Deformable Vesicles for Buccal Delivery ofInsulin.Chem.Pharm.Bull.2002,50(6):749-753和②胰岛素柔性纳米脂质体的口腔给药研究.药学学报.37(11):885-91)，提示胰岛素柔性囊泡优于传统囊泡，但是包封率均只有20％左右。
上述研究中，无论是传统囊泡还是柔性囊泡，都是以胰岛素为原料直接进行囊泡包载。但胰岛素本身的理化性质并不利于囊泡包载，一方面其亲水性强、亲脂性差，无法包载进入囊泡的亲脂性双分子层，另一方面其分子量大，能够进入囊泡内部水腔的药量也很有限，导致包封率普遍较低。
与上述文件的胰岛素传统囊泡或柔性囊泡不同，本单位的公开文件201410174195.1中，报道了一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂，先将胰岛素制成脂质复合物，再以胰岛素制成的脂质复合物为中间载体，加入了非离子型的表面性剂Tween20或Span60，制备得到“新型纳米囊泡”。与以胰岛素原料药同法制备的传统囊泡相比，该文件的“新型纳米囊泡”具有较高的包封率，胃肠液稳定性、caco-2细胞透过性以及糖尿病大鼠口服降糖效果均得到良好改善。
但后期本发明人员进行的进一步研究发现，公开文件201410174195.1中的“新型纳米囊泡”，由于未加入离子型表面活性剂，其柔性和降血糖效果仍不够理想，限制了胰岛素非注射给制剂的发展与应用。
发明内容
本发明提供了一种胰岛素柔性微粒及其制剂。胰岛素柔性微粒含有胰岛素/磷脂复合物和离子型表面活性剂，为圆形或椭圆形结构的囊泡，具有更好的柔性和更高的跨粘膜转运能力。本发明的胰岛素柔性微粒，可加入赋形剂制成临床上可接受的胰岛素非注射给药剂型，用于黏膜给药、口服给药、经皮给药、肺部吸入等。
本发明的胰岛素柔性微粒，药物包封率在60％以上，粒径在5000nm以下，优选2000nm以下，再优选1000nm以下，更优选800nm以下，最优选粒径在600nm以下。
本发明的胰岛素柔性微粒，含有胰岛素/磷脂复合物和离子型表面活性剂中，胰岛素：磷脂：离子型表面活性剂三者的质量比为1:3～50:0.1～20，优选1:5～15:0.5～15，更优选1:7～12:1～5。
本发明的胰岛素柔性微粒，还可含有非离子型表面活性剂、游离磷脂和胆固醇中的一种或几种。
本发明的胰岛素柔性微粒，在组成上既不同于现有文献报道的胰岛素传统囊泡或胰岛素柔性囊泡，也不同于现有文献报道的含有胰岛素磷脂复合物的新型纳米囊泡。
本发明的胰岛素柔性微粒，胰岛素选自动物胰岛素、人胰岛素及胰岛素类似物中的至少一种；磷脂选自天然磷脂、合成磷脂中的至少一种。
本发明的胰岛素柔性微粒，其中所含的胰岛素磷脂复合物，系选自本单位的公开文件201410174195.1“一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂”公开的任一种胰岛素/磷脂复合物，胰岛素的复合率在90％以上。
本发明的胰岛素柔性微粒，其中所含的离子型表面活性剂，选自胆酸盐类、高级脂肪酸盐类、硫酸化物、磺酸化物、十六烷基三甲基胺溴化物、甘草酸盐类中的至少一种。胆酸盐类选自胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠中的至少一种。
本发明的胰岛素柔性微粒，所含的非离子表面活性剂选自吐温类、司盘类、泊洛沙姆、脂肪酸甘油酯、卖泽、苄泽中的至少一种。吐温类选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温65、吐温80、吐温85中的至少一种。
本发明的胰岛素柔性微粒，非离子型表面活性剂与胰岛素的质量比为0.1:1～20:1，优选2:1～15:1；游离磷脂与胰岛素的质量比为0:1～50:1，优选0:1～20:1；胆固醇与胰岛素的质量比为0:1～10:1，优选0:1～1:1。
本发明的胰岛素柔性微粒，可采用如下任一方法制备：
(1)先制备胰岛素/磷脂复合物
将胰岛素溶于含适量酸的有机溶剂中；
将磷脂溶于适量有机溶剂中；
将以上两种溶液混合，在一定温度下水浴减压旋蒸，旋蒸过程中分次加入适量有机溶剂，继续旋转蒸发挥除溶剂，干燥得胰岛素/磷脂复合物；
(2)再制备胰岛素柔性微粒的“囊泡溶液”，可为以下方法中的任意一种：
方法(A):
薄膜：将(1)所制备的胰岛素/磷脂复合物和离子型表面活性剂，一同溶解于有机溶剂中，挥除溶剂，干燥得薄膜；
薄膜水化：取水性介质适量，加入到干燥后的薄膜中，在一定温度下，水化一定时间，经匀化制备得到“囊泡溶液”，即得胰岛素柔性微粒；
方法(B):
薄膜：将(1)所制备的胰岛素/磷脂复合物，溶解于有机溶剂中，挥除溶剂，干燥得薄膜；
薄膜水化：将离子型表面活性剂溶解于适量的水性介质中，加入到干燥后的薄膜中，在一定温度下，水化一定时间，经匀化得到“囊泡溶液”，即得胰岛素柔性微粒；
方法(C):
取(1)所制备的胰岛/素磷脂复合物及离子型表面活性剂，一同溶解于有机溶剂中，然后加入水性介质，匀化处理使之成乳，减压旋蒸除去有机溶剂，得“囊泡溶液”，即得胰岛素柔性微粒；
或方法(D):
取(1)所制备的胰岛素/磷脂复合物溶解于有机溶剂中，然后将离子型表面活性剂溶解于水性介质中，两者混合匀化处理使之成乳，减压旋蒸除去有机溶剂，得“囊泡溶液”，即得胰岛素柔性微粒。
本发明的胰岛素柔性微粒，在(2)胰岛素柔性微粒的制备方法所述的有机溶剂中或水性介质中，所述的有机溶剂中或水性介质中，还可加入非离子表面活性剂,游离磷脂或胆固醇中的一种或多种。
本发明的胰岛素柔性微粒，在“胰岛素/磷脂复合物”的制备步骤中涉及的含酸有机溶剂，所述的酸选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸、三氟乙酸中的至少一种，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的至少一种。优选三氟乙酸或氯化氢气体的甲醇溶液，三氟乙酸或氯化氢气体在有机溶剂中的浓度约为0.01％～0.5％，优选0.05％～0.1％。
本发明的胰岛素柔性微粒的制备，溶解磷脂及薄膜的有机溶剂中，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇乙酯、丙酮、乙醚中的至少一种，优选二氯甲烷。
本发明的胰岛素柔性微粒的制备，“薄膜”步骤中的的“挥除溶剂”方法，可以是旋转蒸发法，也可以是喷雾干燥法，还可以是冷冻干燥法、逆向蒸发法；“在一定温度下，水化一定时间，水化完成后”中的“一定温度”系指控制在30℃～50℃，“一定时间”系指控制在20～120分钟；“经匀化制备囊泡溶液”中的“匀化”方法可以是超声法、均质法、振荡法、也可以是挤压法，还可以是French压力法。
本发明的胰岛素柔性微粒，可加入保护剂经冷冻干燥或经喷雾干燥或经旋转蒸发工艺，制成胰岛素柔性微粒固体。
本发明的胰岛素柔性微粒，可加入矫味剂、防腐剂、抑菌剂、稀释剂、助悬剂、促透剂、成膜剂等药学上可接受的赋形剂，制成临床上可接受的混悬剂、灭菌与无菌制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、膜剂、软膏剂、眼膏剂、凝胶剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂或粉雾剂，用于胰岛素的口服给药、经皮给药、口腔黏膜给药、鼻黏膜给药、肺部吸入或肠道给药等非注射递送。
发明人首先对本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒的粘膜透过性进行了比较与评价。试验人员分别制备了如下4组样品溶液作为参比，采用新鲜猪舌下黏膜和Franz扩散池方法，同法测定胰岛素在各时间点的表观渗透系数。
受试样品：本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒；
参比样品1:参照本发明的胰岛素柔性微粒，将其中的胰岛素复合物由胰岛素原料药替代，制备的以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒；
参比样品2：按照文献Formulation,optimization and evaluation oftransferosomal gel for transdermal insulin delivery.SAUDI PHARM J.2012；20(4):355-63方法，制备的包裹胰岛素原料药的传递体(胰岛素柔性囊泡)；
参比样品3：按照文献(胰岛素传递体的制备及体外透皮性能的研究.中国新药杂志.；2013；22(8):961-6)方法，制备的包裹胰岛素原料药的传递体(胰岛素柔性囊泡)，同法测定胰岛素在各时间点的表观渗透系数。结果表明，本发明的胰岛素柔性微粒4h的表观渗透系数为(4.31±0.33)×10-6cm·s-1，而以胰岛素原料药代替胰岛素复合物的参比样品1，4h的表观渗透系数为(2.09±0.48)×10-6cm·s-1，按照文献方法制备的参比样品2和参比样品3，4h的表观渗透系数分别为(1.76±0.53)×10-6cm·s-1和(1.45±0.26)×10-6cm·s-1。由此提示，以胰岛素磷脂复合物为中间载体制备的新型柔性微粒，显著优于以胰岛素原料药制备的各种柔性囊泡。
此外，发明人还以变形指数为指标，将本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒和公开文件201410174195.1的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体“新型纳米囊泡”进行了比较。发明人按公开文件201410174195.1方法，制备了包裹胰岛素脂质复合物、但处方不含离子型表面活性剂“新型纳米囊泡”，以此作为参比样品；另按本发明方法制备粒径水平相当的胰岛素柔性微粒，作为受试样品。两种样品均装入相同的注射器中，施以0.4MPa的压力，根据溶液通过50nm滤膜的液体重量和粒子的粒径，计算变形指数(变形指数越大，表明粒子的可变形柔性越好，越有利于透过生物粘膜屏障)。结果表明，受试样品为6.43，而参比样品为1.83，提示本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒，其柔性显著优于公开文件201410174195.1的“新型纳米囊泡”。
本发明的胰岛素柔性微粒具有以下优点：
1)包封率高，在60％以上；
2)人工唾液中稳定性良好，在含氨肽酶人工唾液中3小时，胰岛素含量无明显下降；
3)体外透膜性良好，稳态通量状态下，离体猪舌下黏膜的透过性显著优于以胰岛素原料药制备的各类柔性囊泡，表观渗透系数提高2-3倍；
4)柔性好，在相同的测定条件下，其变形指数是公开文件201410174195.1胰岛素“新型纳米囊泡”的3.5倍；
5)降血糖效果明显，以口腔滴剂形式，日本大耳白兔经口腔黏膜给药，10IU/kg，血糖下降幅度可达70％。
附图说明
图1本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a的透射电镜(TEM)照片。
图2以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒的透射电镜(TEM)照片。
图3本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a(图中标记为A)，与以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒(图中标记为B)的体外透膜结果比较。
图4本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a的体内降糖曲线图。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为血糖百分比。
胰岛素溶液皮下注射组：图中标记为S.C.，
胰岛素溶液口腔给药组：图中标记为INS-Sol，
以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒口腔给药组：图中标记为INS-DNVs，
公开文件201410174195.1的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的“新型纳米囊泡”口腔给药组：图中标记为ISC-NNVs，
本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a口腔给药组：图中标记为ISC-DNVs
图5本发明实施例所制得的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a的血药浓度曲线图。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为血药浓度(mU/L)。
胰岛素溶液皮下注射组：图中标记为S.C.，
本发明的胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒a口腔给药组：图中标记为ISC-DNVs。
具体实施方式
实施例
以下对本发明特征进行描述，但权利要求并不仅局限于实施例内容。
实施例1：胰岛素/磷脂复合物
取胰岛素60mg，将胰岛素：磷脂的质量比例按1:3、1:5、1:10、1:20、1:50投料，按如下方法制备：
取胰岛素60mg溶于6mL含0.1％三氟醋酸的甲醇溶液中；分别取大豆卵磷脂180mg、300mg、600mg、1200mg和3000mg溶于54mL二氯甲烷中，将上述2种溶液进行混合，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，将其置于真空干燥箱中，干燥后刮取至密闭容器中，得到系列的胰岛素磷脂复合物，标记为复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。
实施例2：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与Tween20 400mg和脱氧胆酸钠100mg一同溶于20ml混合溶剂(氯仿：甲醇＝3:1)中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。用磷酸缓冲液(0.02mol/L)20mL对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm))，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为80.57±0.68nm，PDI为0.268±0.011，zeta电位为-25.27±0.85mV，包封率为72.06±1.84％，变形指数为4.57。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例3：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，Tween20 400mg一同溶于20mL二氯甲烷中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。取脱氧胆酸钠100mg溶于20mL磷酸缓冲液(0.02mol/L)中，得到脱氧胆酸钠的磷酸缓冲液。用该脱氧胆酸钠的磷酸缓冲液对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm)，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为84.57±0.65nm，PDI为0.224±0.006，zeta电位为-29.78±0.74mV，包封率为75.23±1.48％，变形指数为5.96。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例4：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，溶于20mL二氯甲烷中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。取Tween20400mg和脱氧胆酸钠100mg溶于20mL磷酸缓冲液(0.02mol/L)中，得到表面活性剂的磷酸缓冲液。用该表面活性剂的磷酸缓冲液对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm)，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为89.48±1.43nm，PDI为0.262±0.010，zeta电位为-30.40±0.78mV，包封率为5.40±1.11％，变形指数为4.92。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例5：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与Tween20 400mg和脱氧胆酸钠100mg一同溶于20mL混合溶剂(氯仿：甲醇＝3:1)中，形成澄清的溶液。加入磷酸缓冲液(0.02mol/L)20mL，超声处理使之成乳，减压旋蒸除去有机溶剂得柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为580±0.18nm，PDI为0.376±0.009，zeta电位为-23.46±0.89mV，包封率为62.07±2.62％。变形指数为3.95。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例6：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与胰岛素/磷脂复合物中等量的游离磷脂、Tween20 400mg和脱氧胆酸钠100mg一同溶于20mL混合溶剂(氯仿：甲醇＝3:1)中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。用磷酸缓冲液(0.02mol/L)20m对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm))，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为90.97±0.88nm，PDI为0.271±0.011，zeta电位为-27.27±0.85mV，包封率为68.26±1.57％。变形指数为5.68。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例7：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与胰岛素/磷脂复合物中等量的游离磷脂和Tween20 400mg一同溶于20mL二氯甲烷中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。取脱氧胆酸钠100mg溶于20mL磷酸缓冲液(0.02mol/L)中，得到脱氧胆酸钠的磷酸缓冲液。用该脱氧胆酸钠的磷酸缓冲液对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W，1min/次，共4次)、过膜(0.22μm)，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a。激光粒度仪测得的粒径为82.55±0.94nm，PDI为0.263±0.006，zeta电位为-30.77±0.64mV，包封率为79.29±1.49％，变形指数为6.43。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量均调整为6mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒b，激光粒度仪测得的粒径为105.25±0.94nm，PDI分别为0.317±0.011，zeta电位为-29.78±0.41mV，包封率为60.29±2.08％，变形指数为2.43。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量分别调整为60mg和30mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒c，激光粒度仪测得的粒径为96.34±0.734nm，PDI分别为0.287±0.010，zeta电位为-29.45±0.37mV，包封率为66.44±1.76％，变形指数为3.17。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量分别调整为120mg和60mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒载体d，激光粒度仪测得的粒径为85.62±1.62nm，PDI分别为0.225±0.025，zeta电位为-30.71±0.45mV，包封率为63.63±2.89％，变形指数为3.99。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量分别调整为240mg和60mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒e，激光粒度仪测得的粒径为88.41±0.89nm，PDI分别为0.266±0.008，zeta电位分别为-32.83±0.31mV，包封率为61.62±3.05％，变形指数为5.98。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量分别调整为560mg和140mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒f，激光粒度仪测得的粒径为77.69±0.64nm，PDI为0.223±0.008，zeta电位为-31.17±0.99mV，测得的包封率为76.21±1.07％，变形指数为6.27。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量均调整为900mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒g，激光粒度仪测得的粒径为75.38±0.89nm，PDI分别为0.216±0.045，zeta电位为-30.89±0.27mV，包封率为69.78±1.97％，变形指数为4.87。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量分别调整为600mg和300mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒h，激光粒度仪测得的粒径为78.77±0.98nm，PDI分别为0.224±0.098，zeta电位为-29.97±0.34mV，包封率为73.65±2.09％，变形指数为5.13。
上述方法中，将Tween20和脱氧胆酸钠的用量均调整为1200mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒i，激光粒度仪测得的粒径为73.46±0.08nm，PDI分别为0.214±0.009，zeta电位分别为-32.27±0.53mV，包封率为60.39±1.98％，变形指数为2.95。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例8：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与胰岛素/磷脂复合物中等量的游离磷脂一同溶于20mL二氯甲烷中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。取Tween20400mg和脱氧胆酸钠100mg溶于20mL磷酸缓冲液(0.02mol/L)中，得到表面活性剂的磷酸缓冲液。用该表面活性剂的磷酸缓冲液对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm)，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为91.27±1.65nm，PDI为0.253±0.013，zeta电位为-28.98±0.54mV，包封率为64.39±1.13％，变形指数为4.74。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例9：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与胰岛素/磷脂复合物中等量的游离磷脂、Tween20400mg和脱氧胆酸钠100mg一同溶于20mL混合溶剂(氯仿：甲醇＝3:1)中，形成澄清的溶液。加入磷酸缓冲液(0.02mol/L)20mL，超声处理使之成乳，减压旋蒸除去有机溶剂得柔性体溶液。激光粒度仪测得的粒径为620±0.48nm，PDI为0.415±0.007，zeta电位为-25.78±0.64mV，包封率为60.23±1.87％。变形指数为3.64。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例10：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取实施例1中制得的胰岛素/磷脂复合物Ⅲ660mg，与胰岛素/磷脂复合物中等量的游离磷脂、胆固醇600mg和Tween20400mg一同溶于20mL二氯甲烷中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。取脱氧胆酸钠100mg溶于20mL磷酸缓冲液(0.02mol/L)中，得到脱氧胆酸钠的磷酸缓冲液。用该脱氧胆酸钠的磷酸缓冲液对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm)，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒X。激光粒度仪测得的粒径为95.33±0.85nm，PDI为0.224±0.007，zeta电位为-22.64±0.74mV，包封率为77.23±1.49％，变形指数为2.13。
上述方法中，将胆固醇用量调整为300mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒Y。激光粒度仪测得的粒径为94.89±0.64nm，PDI为0.232±0.006，zeta电位为-25.73±0.89mV，包封率为75.38±2.87％，变形指数为3.15。
上述方法中，将胆固醇用量调整为60mg，得到以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒Z。激光粒度仪测得的粒径为76.78±0.53nm，PDI为0.218±0.005，zeta电位为-28.54±0.68mV，包封率为73.96±1.85％，变形指数为3.68。
用实施例1的任一胰岛素/磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。
实施例11：以胰岛素原料药为中间载体，制备胰岛素柔性微粒
取游离磷脂1.2g和Tween20 400mg一同溶于20mL二氯甲烷中，形成澄清的溶液。将此溶液于37℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，得干燥薄膜。取胰岛素60mg和脱氧胆酸钠100mg溶于20mL磷酸缓冲液(0.02mol/L)中，形成澄清的溶液，用该溶液对所形成的薄膜进行水化30min，水化完成后经探头超声分散(150W,1min/次，共4次)、过膜(0.22μm)，得到以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒。激光粒度仪测得的粒径为84.4±4.89nm，PDI为0.254±0.006，zeta电位为-29.33±0.81mV，包封率为77.32±0.48％，变形指数为5.97。
实施例12：胰岛素柔性微粒的冻干粉
取实施例7中所制备的胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a，加入甘露醇(总质量分数8％)，摇匀后，用磷酸缓冲液(0.02mol/L)稀释2倍，按每支1ml灌装于10ml西林瓶中。
采用以下真空冷方式，预冻：调节冷冻干燥室内温度至-45℃，维持3h；干燥：调节冷冻干燥室温度至-25℃，维持8h。升温至0℃，维持3h；升温至15℃，维持3h。调节冷冻干燥室温度逐渐至室温，关闭冷冻干燥机；调节冷冻干燥室内环境至常压、常温后，取出胰岛素柔性微粒固体。冲氮、压盖、密封后，4℃保存待用。用纯净水复溶后粒径为432.1nm，包封率为61.20％，柔性指数为22.94g/cm2/s。
试验例
试验例1：以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a的透射电镜观察
取实施例7中所制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a和实施例11中所制备的以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒各100μL,以0.5％甘油分散至5mL。量取10μL至200目的铜网上，停留3min后用滤纸在铜网边缘小心吸取多余的液体，然后用1％的磷钨酸溶液染色，停留1.5min后同样用滤纸在铜网边缘小心吸取多余的液体，自然晾干，通过透射电镜观察柔性微粒的微观形态。如说明书附图1和2所示(附图1为实施例7中所制备的胰岛素柔性微粒a的透射电镜照片，附图2为实施例11中所制备的胰岛素原料药柔性微粒)，透射电镜下，以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a和胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒均为球形或近球形，粒径多为80nm左右，胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a可见较明显的指纹状结构。
试验例2：胰岛素柔性微粒的包封率测定试验
1)药物总量测定：
精密量取以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a 0.5ml，置于10ml容量瓶中，以磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取胰岛素对照品适量，以0.1％三氟乙酸-水溶液溶解并稀释至浓度为100μg/mL的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各注入液相色谱仪进行分离分析，色谱柱为300SB-C18(4.6×250mm,5μm,Agilent)，流动相为0.2mol/L硫酸盐缓冲液-乙腈(74-26)，流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，柱温为40℃，进样量为20μL。记录色谱图，根据峰面积按照外标法计算载药柔性微粒中胰岛素的浓度以及总量，记为Wtotal insulin。
2)游离药物测定：
精密量取以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a 1ml，置于4mL超滤离心管中，以4,000rpm的转速离心40分钟。收集超滤液，稀释适当倍数后测定其含量，并推算1ml中含有的游离药物总量，记为Wfree-insulin；吸弃内管部分并用磷酸缓冲液将其内壁冲洗干净，分别加磷酸缓冲液1ml以2500rpm离心5min,重复操作3次将超滤液全部收集至5ml容量瓶，定容后测定吸附药物总量，记为Wabsorbed-insulin。包封率计算公式为：
Figure BDA0002057140280000121
试验例3：胰岛素柔性微粒的柔性指数测定试验
取实施例7中所制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a和按照公开文件201410174195.1中所述方法制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的新型纳米囊泡溶液各约6ml于10ml注射器中，将注射器固定于自制固定架上，施以0.4MPa的压力，使溶液通过50nm的滤膜，用减重法计算5min内从注射器中流出的液体重量。变形指数计算公式：
Figure BDA0002057140280000122
注：j为流出的液体重量，rv为挤出的溶液中粒子粒径，rp为滤膜的孔径。测定结果如下：
实施例7中制备的胰岛素柔性微粒a胰岛素柔性微粒
Figure BDA0002057140280000131
以上结果表明，本专利提供的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a，其柔性明显优于公开文件201410174195.1的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒新型纳米囊泡。
试验例4：胰岛素柔性微粒的口腔稳定性试验
取实施例7中所制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a 100ul，以含有氨肽酶的人工唾液稀释至10ml，37℃摇床温孵3小时，取样过滤，取续滤液适量注入液相色谱仪，照前述HPLC依法测定；另取柔性微粒100ul，以磷酸缓冲液稀释至10ml，作为对照溶液，依法测定，计算胰岛素药物含量的剩余百分率。结果表明，以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a，3个小时内药物含量无明显变化，口腔稳定性良好。
试验例5：胰岛素柔性微粒的体外透膜性试验
取新鲜猪舌下黏膜，将其固定于Franz扩散池两室之间(扩散单元：15mm扩散孔径，3.4ml接收池体积，37℃水浴循环)，分别加入PBS，平衡30min，吸弃用于平衡的PBS。在供给池一侧加入按本发明实施例7中制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a3.4ml，在接收池一侧加入PBS 3.4ml，于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h于接收池取样100ul，注入液相色谱仪，照前述HPLC依法测定，同时向接收池补充等量新鲜介质；另取以原料药为中间载体的胰岛素柔性微粒以及分别按照文献(Formulation,optimization andevaluation of transferosomal gel for transdermal insulin delivery.SAUDI PHARMJ.2012；20(4):355-63.；胰岛素传递体的制备及体外透皮性能的研究.中国新药杂志.2013；22(8):961-6)制备的2种基于原料药的传递体，同法测定，计算胰岛素于各时间点的表观渗透系数。结果表明，本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a 4h的表观渗透系数为(4.31±0.33)×10-6cm·s-1，而以胰岛素原料药代替胰岛素复合物制备的“原料药为中间载体的柔性微粒”4h的表观渗透系数为(2.09±0.48)×10-6cm·s-1，按照文献制备的2种基于胰岛素原料药的传递体溶液4h的表观渗透系数分别为(1.76±0.53)×10-6cm·s-1和(1.45±0.26)×10-6cm·s-1。
以上透膜实验完成后，取下黏膜，剪取有效渗透位置，用剪刀剪碎，浸泡在1mL PBS溶液中12小时，对浸泡液超声5min，4000rmp离心20min，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，HPLC测定皮肤中药物滞留量。结果表明，本发明的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a，其黏膜滞留量为67.82±4.17μg/cm2，而以胰岛素原料药代替胰岛素/磷脂复合物的以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒，其黏膜滞留量仅为22.64±2.76μg/cm2，而按照文献方法以胰岛素原料药制备的两种传递体的黏膜滞留量分别为18.06±2.17μg/cm2和15.82±1.32μg/cm2。
采用罗丹明标记的磷脂(激发波长和发射波长分别为557nm和581nm)和FITC标记的胰岛素(激发波长和发射波长分别为490nm和525nm)按实施例7以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a，及按照实施例11制备的以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒分别进行以上透膜实验，实验完成后，取下黏膜，用生理盐水冲洗掉表面附着的药物，置于液氮急冻；然后制备组织切片，用激光共聚焦显微镜观察。如说明书附图3所示，结果表明，胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a的黏膜显示出更高的荧光强度。
以上体外透膜性实验结果显示，本发明以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a显示出更高的黏膜透过性。
试验例6：降血糖实验
(1)试验药物
ISC-DNVs组：按实施例1的复合物Ⅲ为中间载体，实施例7中制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a(3mg/ml即87IU/ml)；
ISC-NNVs组：按公开文件201410174195.1中所述方法制备的载胰岛素/磷脂复合物的新型纳米囊泡(3mg/ml即87IU/ml)；
INS-DNVs组：参照本发明的新型柔性微粒，以胰岛素原料药代替胰岛素磷脂复合物，按照实施例11制备的以胰岛素原料药为中间载体的柔性微粒(3mg/ml即87IU/ml)；
INS-Sol组：胰岛素溶液(5.3mg/ml即87IU/ml)；
阳性对照溶液S.C.组：20IU/ml胰岛素溶液；
(2)试验动物及家兔食管结扎模型
取健康日本大耳白兔，体重2.0±0.5kg，雄性。禁食2小时(不禁水)后使用强生稳豪型血糖仪测定初始血糖值，选取初始血糖值在6.0～10.0之间的动物耳缘静脉注射2％戊巴比妥钠麻醉后对其进行食管结扎，待血糖值稳定10min后给药。给药后半小时，解除食管结扎，缝合伤口。
(3)给药方式及剂量
取已进行食管结扎的日本大耳白兔15只，随机分成5组，每组3只，按照下述给药方式和剂量进行给药。
ISC-DNVs组、ISC-NNVs组、INS-DNVs组及INS-Sol组：滴于舌下及颊黏膜给药，10IU/kg，将全部剂量的药液平均分成4份，各取一份量均匀滴加至两侧颊黏膜，取两份量均匀滴于舌下；
阳性对照溶液S.C组：皮下注射给药，1IU/kg。
(4)血糖测定结果
分别于给药后第0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5时于耳缘静脉取血，使用强生稳豪型血糖仪测定血糖值并记录，计算每组血糖降低百分比的平均值，绘制单次给药之后的血糖降低曲线，如说明书附图图4所示。
试验结果表明，对进行食管结扎的日本大耳白兔进行口腔黏膜给以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a，与初始血糖值相比，其血糖下降幅度可达70％，显著优于以相同剂量相同方式给药的胰岛素溶液组、载胰岛素原料药的柔性微粒组以及载胰岛素/磷脂复合物的新型纳米囊泡，具有良好的口腔黏膜吸收效果，与以1IU/kg剂量皮下注射胰岛素溶液相比，其降糖幅度更大且药效维持时间更长。
试验例7：血药浓度测定试验
(1)试验药物
ISC-DNVs组：按实施例1的复合物Ⅲ为中间载体，实施例7中制备的以胰岛素/磷脂复合物为中间载体的柔性微粒a(3mg/ml即87IU/ml)；
阳性对照溶液S.C.组：20IU/ml胰岛素溶液。
(2)试验动物及家兔食管结扎模型
取健康日本大耳白兔，体重2.0±0.5kg，雄性。禁食2小时(不禁水)后使用强生稳豪型血糖仪测定初始血糖值，选取初始血糖值在6.0～10.0之间的动物耳缘静脉注射2％戊巴比妥钠麻醉后对其进行食管结扎，待血糖值稳定10min后给药。给药后半小时，解除食管结扎，缝合伤口。
(3)给药方式及剂量
取已进行食管结扎的日本大耳白兔6只，随机分成2组，每组3只，按照下述给药方式和剂量进行给药。
ISC-DNVs组：滴于舌下及颊黏膜给药，10IU/kg，将全部剂量的药液平均分成4份，各取一份量均匀滴加至两侧颊黏膜，取两份量均匀滴于舌下；
阳性对照溶液S.C组：皮下注射给药，1IU/kg。
(4)血药浓度测定结果
分别于给药后0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6时于耳缘静脉取血，分离血清或血浆，使用重组人胰岛素定量检测试剂盒测定血药浓度并记录，计算每组于各时间点处的血药浓度的平均值，绘制单次给药之后的血药浓度-时间曲线，如说明书附图图5所示。
试验结果表明，对进行食管结扎的日本大耳白兔以10IU/kg剂量口腔给以胰岛素/磷脂复合物柔性微粒和以1IU/kg皮下注射胰岛素溶液后由血药浓度-时间曲线计算的AUC分别为437.44和239.45，由此计算胰岛素/磷脂复合物柔性微粒口腔给药的相对生物利用度为18.27％，与皮下注射胰岛素溶液相比，胰岛素/磷脂复合物柔性微粒口腔给药后血药浓度最高值的出现稍有延迟。以上结果提示，胰岛素/磷脂复合物柔性微粒存在吸收过程且具有良好的口腔黏膜吸收效果。

Claims (15)

1.一种胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述柔性微粒，含有胰岛素/磷脂复合物、非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂，呈圆形或椭圆形结构的囊泡，粒径在600nm以下，药物包封率在60％以上；
胰岛素：磷脂：离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂的质量比为1:(3～50):(0.1～20):(0.1～20)；
所述胰岛素柔性微粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)胰岛素/磷脂复合物的制备
将胰岛素溶于含适量酸的有机溶剂中；将磷脂溶于适量有机溶剂中；将以上两种溶液混合，在一定温度下水浴减压旋蒸，旋蒸过程中分次加入适量有机溶剂，继续旋转蒸发挥除溶剂，干燥得胰岛素/磷脂复合物；
(2)胰岛素柔性微粒的制备方法，选自以下方法中的任一种：
方法(A):薄膜：将(1)所制备的胰岛素/磷脂复合物和离子型表面活性剂，一同溶解于有机溶剂中，挥除溶剂，干燥得薄膜；薄膜水化：取水性介质适量，加入到干燥后的薄膜中，在一定温度下，水化一定时间，经匀化制备得到“囊泡溶液”，即得胰岛素柔性微粒；
方法(B):薄膜：将(1)所制备的胰岛素/磷脂复合物，溶解于有机溶剂中，挥除溶剂，干燥得薄膜；薄膜水化：将离子型表面活性剂溶解于适量的水性介质中，加入到干燥后的薄膜中，在一定温度下，水化一定时间，经匀化得到“囊泡溶液”，即得胰岛素柔性微粒；
在(2)胰岛素柔性微粒的制备方法所述有机溶剂中或水性介质中，加入非离子表面活性剂；
所述离子型表面活性剂为胆酸盐类，所述非离子表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温65、吐温80、吐温85中的至少一种。
2.根据权利要求1所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述柔性微粒中，胰岛素：磷脂：离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂的质量比为1:(5～15):(0.5～15)：(2～15)。
3.根据权利要求1或2所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述柔性微粒中，胰岛素：磷脂：离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂的质量比为1:(7～12):(1～5)：(2～15)。
4.根据权利要求1所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述柔性微粒，还含有游离磷脂和胆固醇中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述游离磷脂与胰岛素的质量比为(0～50):1；所述胆固醇与胰岛素的质量比为(0～10):1。
6.根据权利要求5所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述游离磷脂与胰岛素的质量比为(0～20):1；所述胆固醇与胰岛素的质量比为(0～1):1。
7.根据权利要求1或2所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述胰岛素/磷脂复合物，由胰岛素与脂质材料在含低沸点酸的有机溶剂系统中复合并干燥制备而来，胰岛素的复合率在90％以上。
8.根据权利要求1或2所述的胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述胰岛素选自动物胰岛素、人胰岛素及胰岛素类似物中的至少一种。
9.根据权利要求1或2所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述胰岛素/磷脂复合物中磷脂选自天然磷脂、合成磷脂中的至少一种。
10.根据权利要求1或2所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述胆酸盐类的离子型表面活性剂选自胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠中的至少一种。
11.根据权利要求1或2所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，在(2)胰岛素柔性微粒的制备方法所述有机溶剂中或水性介质中，还包括加入游离磷脂或胆固醇中的一种或两种。
12.根据权利要求1或2所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，胰岛素/磷脂复合物的制备中所述含适量酸的有机溶剂，所述酸选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸、三氟乙酸中的至少一种，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的至少一种；薄膜中所述溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃、DMSO、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的至少一种。
13.根据权利要求12所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，胰岛素/磷脂复合物的制备中所述含适量酸的有机溶剂，所述有机溶剂为三氟乙酸的甲醇溶液；薄膜中所述溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂为二氯甲烷。
14.根据权利要求1所述胰岛素柔性微粒，其特征在于，所述胰岛素柔性微粒包括加入药学上可接受的赋形剂制成临床上可接受的剂型，用于黏膜给药、口服给药、经皮给药、肺部吸入胰岛素非注射给药递送。
15.根据权利要求14所述胰岛素柔性微粒，所述剂型是混悬剂、灭菌与无菌制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、膜剂、软膏剂、眼膏剂、凝胶剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂或粉雾剂。
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