CN102600079B - 制霉菌素柔性脂质体及其凝胶剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制霉菌素柔性脂质体及外用剂型凝胶剂，同时公开其制备方法，通过纳米脂质体技术，将制霉菌素包封脂质体中，增加制霉菌素的溶解性，并改进脂质体配方，加入胆酸钠或脱氧胆酸钠，制备成柔性脂质体，增强了脂质体经皮渗透性，而且能够改善制霉菌素稳定性，开发了制霉菌素的透皮给药途径，在皮肤浅表层或深层感染及全身性真菌感染方面发挥治疗作用；将制霉菌素柔性脂质体制备成凝胶剂，增强制霉菌素柔性脂质体在皮肤上的滞留时间，使用简单方便，成本低，并且提高使用者的顺应性，降低毒性，能够在皮肤上形成药物储库，使药物持续释放，延长药物作用时间。

Description

制霉菌素柔性脂质体及其凝胶剂和制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗菌药物的新型制剂领域，特别是提供了一种制霉菌素柔性脂质体及外用剂型凝胶剂，同时公开其制备方法。

背景技术

1950年发现土壤微生物Streptomyces noursei能分泌一种抗霉菌的物质，从而发现了第一种抗霉菌的抗生素。制霉菌素具有共轭多烯大环内酯结构，能抑制真菌和皮藓菌的活性，对细菌无抑制作用。制霉菌素属于膜渗透性增强剂。它对多种真菌如酵母菌、白色念珠菌、皮炎芽生菌等，有强大的抑制作用。制霉菌素口服后胃肠道不吸收，给常用口服量后血药浓度极低，对全身真菌感染无治疗作用。几乎全部服药量自粪便内排出。局部外用亦不被皮肤和粘膜吸收，另外，制霉菌素易降解，不易保存。因此严重影响了其在抗真菌方面的应用。 

脂质体作为一种新型的药物载体具有增加药物溶解度、降低药物毒性、良好的生物相容性的特性日益受到人们的重视。但是，由于传统脂质体的粒径一般在100-1000nm之间，且具有一定的刚性，不能够穿透角质层，进入真皮层或入血。因此脂质体在经皮渗透给药中的应用受到限制。

发明内容

本发明公开一种制霉菌素柔性脂质体，解决了由于制霉菌素经皮肤不吸收、不易储存的问题，具有治疗皮肤表层及深层感染的作用，并能用于治疗全身性真菌感染，且对多种耐药性真菌敏感。

本发明公开一种制霉菌素柔性脂质体凝胶剂，使用方便，稳定性好。

本发明还提供了制霉菌素柔性脂质体及其凝胶剂制备方法，适用于工业化生产。

本发明采用以下技术解决方案：

首先利用薄膜分散法制备制霉菌素柔性脂质体，加入相应的辅料后，以此溶液溶胀水性凝胶基质，并调节pH值，制得能够用于治疗皮肤表层及深层感染，同时也能够用于多种耐药性真菌的全身感染的治疗的外用制剂。

本发明的制霉菌素柔性脂质体，由以下原料按重量分数比制成的：

磷脂4-20份、胆固醇1-5份，制霉菌素1-10份，柔性剂10-50份，乙醇150-500份、纯化水500-1500份。

本发明的制霉菌素柔性脂质体，其优选配比组成如下：

磷脂12份、胆固醇3份，制霉菌素4份，柔性剂32份，乙醇300份、纯化水1000份。

所述的磷脂为氢化大豆磷脂或注射用大豆磷脂。

所述的柔性剂包括胆酸钠或脱氧胆酸钠。

本发明提供的制霉菌素柔性脂质体的制备方法，包括如下步骤

取磷脂及胆固醇溶解在20-30倍（w:v）氯仿中，制霉菌素溶解在200-500倍（w:v）甲醇中，将两种溶液混合，超声5-10min，48℃旋转蒸发除去有机溶剂，吹氮气4-8h，去除残留有机溶剂，加入水合溶液，60-65℃水合1-2.5h，使用薄膜挤出仪，100nm碳酸脂膜，过膜2-5次，即得制霉菌素柔性脂质体；

所述的水合溶液含有9%蔗糖、15-30%乙醇及1-5%柔化剂。

本发明提供的制霉菌素柔性脂质体凝胶剂，由以下原料按重量份数比制成的：

制霉菌素柔性脂质体50-200份、凝胶基质1-5份、保湿剂3-5份。

本发明提供的制霉菌素柔性脂质体凝胶剂的制备方法，步骤如下：

取制霉菌素脂质体，加入凝胶基质，溶胀6-12h，用三乙醇胺溶液调节pH6-8，加入保湿剂，搅拌均匀，2000-2500rpm离心10-30min、4℃冰箱放置2-4h脱气，以Co60，40℃辐射灭菌，即得制霉菌素柔性脂质体凝胶剂。

所述的凝胶基质为卡波姆P980、P940或P934，以三乙醇胺调节pH至7。

所述的保湿剂为甘油、丙二醇或山梨醇。

本发明通过在脂质体中加入胆酸钠或脱氧胆酸钠等表面活性剂和促渗剂乙醇，制备柔性脂质体，增加脂质体的柔性，即在穿透皮肤时能够发生形变，通过比自身孔径小的孔道，提高脂质体的皮肤透过率。同时，胆酸钠（或脱氧胆酸钠）能够与制霉菌素结合，增加制霉菌素的溶解性及稳定性。另外柔性脂质体能够在皮肤层中有一定得滞留，形成药物储库，持续释放药物，提高疗效。

本发明的积极效果在于：通过纳米脂质体技术，将制霉菌素包封脂质体中，增加制霉菌素的溶解性，并改进脂质体配方，加入胆酸钠或脱氧胆酸钠，制备成柔性脂质体，增强了脂质体经皮渗透性，而且能够改善制霉菌素稳定性，开发了制霉菌素的透皮给药途径，在皮肤浅表层或深层感染及全身性真菌感染方面发挥治疗作用；将制霉菌素柔性脂质体制备成凝胶剂，增强制霉菌素柔性脂质体在皮肤上的滞留时间，使用简单方便，成本低，并且提高使用者的顺应性，降低毒性，能够在皮肤上形成药物储库，使药物持续释放，延长药物作用时间。

附图说明

图1为制霉菌素标准曲线。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：

称取氢化大豆卵磷脂4g，加入胆固醇2g，溶解与150ml氯仿中；另称取制霉菌素1g，溶解与500mL甲醇中。将两种溶液混合，超声5min。48℃减压蒸干，吹氮气6h，去除残留有机溶剂。加入含有蔗糖67.5g、乙醇150g、水600g，胆酸钠10g的水合溶液，在65℃下水化2h，100nm碳酸脂膜，过膜2次，即得制霉菌素柔性脂质体。

实施例2：

称取大豆卵磷脂20g，加入胆固醇1g，溶解与630ml氯仿中；另称取制霉菌素10g，溶解与2000mL甲醇中。将两种溶液混合，超声10min。48℃减压蒸干，吹氮气8h，去除残留有机溶剂，加入含有蔗糖90g、乙醇300g、水700g，脱氧胆酸钠50g的水合溶液，在60℃下水化1h，100nm碳酸脂膜，过膜3次，即得制霉菌素柔性脂质体。

实施例3：

称取氢化大豆卵磷脂15g，加入胆固醇3g，溶解与360ml氯仿中；另称取制霉菌素8g，溶解与4000mL甲醇中。将两种溶液混合，超声10min。48℃减压蒸干，吹氮气6h，去除残留有机溶剂，加入含有蔗糖135g、乙醇500g、水1000g，脱氧胆酸钠30g的水合溶液，在65℃下水化2.5h，100nm碳酸脂膜，过膜5次，即得制霉菌素柔性脂质体。

实施例4：

称取大豆卵磷脂12g，加入胆固醇3g，溶解与450ml氯仿中；另称取制霉菌素4g，溶解与500mL甲醇中。将两种溶液混合，超声8min。48℃减压蒸干，吹氮气4h，去除残留有机溶剂。加入含有蔗糖108g、乙醇300g、水9000g，脱氧胆酸钠32g的水合溶液，在60℃下水化2h，100nm碳酸脂膜，过膜2次，即得制霉菌素柔性脂质体。

实施例5 （2000-2500rpm离心10-30min、4℃冰箱放置2-4h脱气，）删除

取上述实施例1中制备的制霉菌素柔性脂质体50mL，加入1g卡波姆p940，溶胀6h，以三乙醇胺调节pH值至7，加入甘油3ml，搅拌均匀，2500rpm离心30min、4℃冰箱放置4h脱气，分装以Co60，40℃辐射灭菌，即得制霉菌素柔性脂质体凝胶剂。

实施例6

取上述实施例2中制备的制霉菌素柔性脂质体200mL，加入5g卡波姆p934，溶胀,8h后，以三乙醇胺调节pH值至6，加入丙二醇5ml，搅拌均匀，2000rpm离心10min、4℃冰箱放置3h脱气，分装以Co60，40℃辐射灭菌，即得制霉菌素柔性脂质体凝胶剂。

实施例7

取上述实施例3中制备的制霉菌素柔性脂质体150mL，加入3g卡波姆p980，溶胀12h后，以三乙醇胺调节pH值至8，加入山梨醇4g，搅拌均匀，2300rpm离心20min、4℃冰箱放置2h脱气，分装以Co60，40℃辐射灭菌，即得制霉菌素柔性脂质体凝胶剂。

实施例8

取上述实施例4中制备的制霉菌素柔性脂质体100mL，加入4g卡波姆p940，溶胀4h后，以三乙醇胺调节pH值至7，加入甘油4g，搅拌均匀，2500rpm离心10min、4℃冰箱放置3h脱气，分装以Co60，40℃辐射灭菌，即得制霉菌素柔性脂质体凝胶剂。

以下试验例表明：

本发明制霉菌素脂质体的稳定性可以通过测定脂质体粒径、Zata电位、药物包封率及储存后药物含量变化反应；制霉菌素柔性脂质体的变形性可以通过流动性实验反应；制霉菌素柔性脂质体凝胶剂的皮肤透过性可以通过体外经皮渗透模型反应。

一、稳定性试验

以制霉菌素溶液剂制霉菌素普通脂质体作为对照，通过以下实验评价脂质体及制霉菌素的稳定性。

制霉菌素溶液：制霉菌素溶解于甲醇中，制成100μg/mL的溶液。

制霉菌素普通脂质体：不加胆酸钠及乙醇，其他与柔性脂质体组相同。

1、药物含量测定

（1）标准曲线的制备

以甲醇溶解制霉菌素制成1000μg/mL的储备液，准确的称取储备溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2ml，以甲醇定容至10ml。进样体积：20μl。

色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm)；紫外检测波长:304nm；流速1.0ml·min^-1；流动相:：甲醇：4水=70：30，过滤并脱气；柱温：25℃；进样量：20μl。

以制霉菌素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合，拟合方程为：Y=17440.1886X，R²为0.9996，标准曲线见图1。

（2）样品含量的测定

取脂质体样品50μL，加入950μL甲醇，破坏脂质体，破坏脂质体，释放制霉菌素，观察，溶液由乳状变至澄清，说明脂质体被完全破坏，过0.22μm有机滤膜，如上HPLC法测定脂质体中药物和游离药物的总含量。

2、脂质体粒径与Zata电位的测定

本发明的制霉菌素柔性脂质体的粒径及Zata电位的测定，是采用马尔文激光粒度分析仪进行，结果见表1所示。

3、药物包封率的测定

本发明的制霉菌素柔性脂质体的包封率测定，是采用透析法进行，取2mL的脂质体，测定其中的药物含量，以500mL的0.01mol/L的柠檬酸为透析溶液，恒温磁力搅拌器，100rpm，25℃，透析2h，测定透析袋内的药物含量及溶液体积。药物的包封率计算公式如下：

药物包封率=包封率=                                                

从表1中可以看出，而制霉菌素溶液在储存30、60天后的降解率分别为31.5%及45.2%，说明制霉菌素溶液储存后有明显的降解。实施例1-4制备的制霉菌素柔性脂质体的平均粒径在100-130nm之间，且在4℃储存30、60天后，粒径、包封率没有明显的差异，且降解率小于5%，说明实施例1-4制备的制霉菌素柔性脂质体比较稳定。刚制霉菌素普通脂质体的粒径为132.0nm，包封率为93.4%，储存30、60天后粒径分别为369.4nm及500.3nm，包封率分别为60.5%及40.3%，降解率也较实施例的柔性脂质体稍高，说明柔性脂质体中的柔性剂及乙醇的加入明显的增加了脂质体及制霉菌素的稳定性。

二、脂质体流动性实验

考察在外压作用 (0.1~0.3MPa)下，制霉菌素柔性脂质体混悬溶液变形通过孔径为50nm的微孔滤膜的性能。首先记录5mL水通过微孔滤膜的时间(t₀)，然后记录5mL脂质体溶液的透过时间(t_l)，以此计算相对透过速率P= t₀ /t₁*100%。结果见表2。

从表1中可以看出，制霉菌素普通脂质体与实施例制备的制霉菌素柔性脂质体的粒径均大于100nm。如果脂质体不发生变形则不能通过微孔滤膜。而从表2中可以看出，4个实施例所制备的制霉菌素柔性脂质体在压力为0.1-0.4Mpa时，其透过率均大于70%，且随着压力的增加而增加。与普通脂质体相比，有非常显著地差异（P<0.01）。

三、体外经皮渗透实验：

分组设置：游离制霉菌素凝胶剂组、制霉菌素普通脂质体组（不加胆酸钠及乙醇，其他与柔性脂质体组相同）、制霉菌素柔性脂质体凝胶剂组。将完整去毛小鼠皮肤至于Franz扩散池上，在给药池中分别加入上述三种药物，测定不同时间点接收池中得药物浓度计算药物的稳态流量，并测定给药部位小鼠皮肤中药物的滞留量。实验结果见表2。

从表2中可以看出，制霉菌素普通脂质体组与柔性脂质体组均能够显著提高药物的稳态流量及皮肤内滞留量，而柔性脂质体组明显高于普通脂质体组。由此可以看出，柔性脂质体能够明显增加制霉菌素的经皮渗透能力，并能在皮肤上形成药物储库，持续释放药物。

注：以制霉菌素普通脂质体组作对照，*表示p<0.05，**表示p<0.01；与制霉菌素普通脂质体组对照，#表示p<0.05，##表示p<0.01

表3不同的制霉菌素凝胶剂的体外经皮渗透活性

分组设置	稳态流量（μg/h）	滞留量（μg）	滞留时间（h）
				游离制霉菌素组	10.14	0.72	0.37
制霉菌素普通脂质体组	17.4**	2.54**	0.35
				实施例5	28.8**##	10.64**##	0.30
实施例6	29.2**##	11.36**##	0.26
				实施例7	26.4**##	11.02**##	0.27
实施例8	32.7**##	13.57**##	0.29

注：以游离制霉菌素组作对照，*表示p<0.05，**表示p<0.01；与制霉菌素普通脂质体组对照，#表示p<0.05，##表示p<0.01。

Claims (2)

1.一种制霉菌素柔性脂质体，是由以下原料按重量份比制成的：

磷脂4-20份、胆固醇1-5份，制霉菌素1-10份，柔性剂10-50份，蔗糖60-90份、乙醇150-500份、纯化水500-1500份；

所述的磷脂为氢化大豆磷脂或注射用大豆磷脂；

所述的柔性剂是胆酸钠或脱氧胆酸钠。

2. 如权利要求1所述的制霉菌素柔性脂质体的制备方法：取磷脂及胆固醇溶解在20-30倍（w:v）氯仿中，制霉菌素溶解在200-500倍（w:v）甲醇中，将两种溶液混合，超声5-10min，48℃旋转蒸发除去有机溶剂，吹氮气4-8h，去除残留有机溶剂，加入水合溶液，60-65℃水合1-2.5h，使用薄膜挤出仪，100nm碳酸脂膜，过膜2-5次，即得制霉菌素柔性脂质体；

所述的水合溶液含有9%蔗糖、15-30%乙醇及1-5%柔性剂。

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