CN103467529A - 乙二胺四乙酸双核铂配合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了如式I所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物。其制备方法为:将乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠溶解在水性溶液中，调节水性溶液的pH至6.0～9.0；在所述水溶液中加入顺铂，搅拌反应，纯化后得到如式（I）所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物。所述双核铂配合物以乙二胺四乙酸（EDTA）为配体，通过EDTA的两对对称的羧基与顺铂配位形成，具有稳定的双中心八元环结构，极易溶解。在肿瘤组织低pH的环境下，可以缓慢释放出具有抗癌活性的化合物，从而达到降低顺铂原药的机体毒性和保持其抗癌活性的目的。本发明以临床可注射的EDTA为配体，安全性较高。制备方法简单，易于产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及金属铂类抗癌药领域，特别涉及乙二胺四乙酸双核铂配合物及其制备方法。
背景技术
顺铂具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤有协同作用且无交叉耐药等特点，是联合化疗中最常用的药物之一。据统计，在我国抗癌化疗治疗中，以顺铂为主或有顺铂参加配伍的方案占所有化疗方案的70%～80%。目前，顺铂对治疗肺癌、生殖系统肿瘤、头颈部癌、膀胱癌、淋巴肿瘤等具有良好效果。顺铂口服无效，临床多以静脉滴注方式给药。静脉滴注后，顺铂迅速分别全身，尤其是在肝、肾、大小肠及皮肤中分布最多。其毒副作用大，容易引起肾毒性、肠道毒性、骨髓抑制及周围神经毒性等，从而限制了其临床应用。同时，顺铂在血液中的半衰期短，到达病灶部位的比例很低，药效较差。
有关铂类药物的研究已经不再局限于原有的顺铂经典构效模式，目前报道的最具有代表性的非典型构型的铂类药物包括：四价铂配合物、具有空间位阻的铂配合物、反式铂配合物，和多核铂配合物。多核铂配合物是一类具有新颖结构的化合物。已经报道的二价双核铂为：以吡唑和1,2,3-三唑为连接的双核铂（II）配合物（Journal of theAmerican Chemical Society124(17):4738-4746）；以吖嗪为连接的双核铂（II）配合物（European Journal of Inorganic Chemistry2003(24):4347-4355；Journal of Medicinal Chemistry46(7):1210-1219）；以N,N’-二-（2-二甲基胺乙基）乙二酰二胺作为螯合的桥配体的双核铂（II）配合物（Inorganic Chemistry42(20):6166-6168）等。
尽管体外实验证实，上述二价双核铂具有一定的抗癌活性，但是其使用的配体在安全性评价上还有待进一步考察。针对目前铂类药物在抗癌领域的重要性，以及现有二价铂类抗癌药物多数水溶性差，毒副作用大的缺点，对于二价铂的增溶、降毒改性具有重大的意义和价值。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种抗癌用乙二胺四乙酸双核铂配合物及其制备方法，所述乙二胺四乙酸双核铂配合物水溶性好，毒性明显低于小分子顺铂。
本发明公开了乙二胺四乙酸双核铂配合物，如式（I）所示：
本发明公开了一种乙二胺四乙酸双核铂配合物的制备方法，包括以下步骤：
（A）将乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠溶解在水性溶液中，调节水性溶液的pH至6.0～9.0；
（B）在所述水溶液中加入顺铂，搅拌反应，纯化后得到如式（I）所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物；
优选的，所述乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠与顺铂的摩尔比为1:（2～4）。
优选的，所述步骤（B）中，所述搅拌时间为20～120小时。
优选的，所述步骤（B）中，所述纯化为透析或超滤。
优选的，所述步骤（A）中，所述水性溶液为水、生理盐水、注射用液、缓冲溶液或组织培养液。
优选的，其特征在于，所述步骤（B）中，所述纯化后还包括冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明提供了如式I所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物。其以乙二胺四乙酸（EDTA）为配体，通过EDTA的两对对称的羧基与顺铂配位形成，具有稳定的双中心八元环结构。该结构的乙二胺四乙酸双核铂配合物在生理条件下易溶解。在肿瘤组织低pH的环境下，乙二胺四乙酸双核铂配合物可以缓慢释放出具有抗癌活性的化合物，从而达到降低顺铂原药的机体毒性和保持其抗癌活性的目的。另外，本发明以可注射使用的EDTA为配体，安全性较高。
附图说明
图1为顺铂和本发明实施例14制备的乙二胺四乙酸双核铂配合物对PC-3细胞的毒性考察结果图；
图2为顺铂和本发明实施例14制备的乙二胺四乙酸双核铂配合物对MCF-7细胞的毒性考察结果图；
图3为顺铂和本发明实施例14制备的乙二胺四乙酸双核铂配合物对HeLa细胞的毒性考察结果图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了乙二胺四乙酸双核铂配合物，如式（I）所示：
按照本发明，如式（I）所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物以EDTA为配体，通过EDTA的两对对称的羧基与顺铂配位形成，具有稳定的双中心八元环结构。
所述式（I）所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物可以形成冻干粉或在水性溶液中保存。所述水性溶液优选为水、生理盐水、注射用液、缓冲溶液或组织培养液。
本发明还公开了乙二胺四乙酸双核铂配合物的制备方法，包括以下步骤：
（A）将乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠溶解在水性溶液中，调节水性溶液的pH至6.0～9.0；
（B）在所述水溶液中加入顺铂，搅拌反应，纯化后得到如式（I）所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物；
按照本发明，首先将乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠溶解在水性溶液中，得到水溶液，然后对调节水性溶液的pH至6.0～9.0，优选的调节pH至6.6～7.5。所述乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠在水性溶液中的质量百分浓度没有特殊限制，优选为10～70%,更优选为35%～45%，最优选为40%。所述水性溶液为水、生理盐水、注射用液、缓冲溶液或组织培养液。
得到EDTA或EDTA钠盐的水溶液后，加入顺铂，搅拌反应，纯化后得到如式I所示的二价双核配合物。所述EDTA的两对对称的羧基与顺铂发生配位作用，形成双中心八元环的稳定结构。所述乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠与顺铂的摩尔比优选为1:（2～4），更优选为1:2。所述搅拌时间优选为20～120小时，更优选为30～100小时，最优选为48～70小时。本发明对于纯化没有特殊限制，优选为超滤或透析。纯化后，即可得到乙二胺四乙酸双核铂配合物。所述乙二胺四乙酸双核铂配合物溶解于水性溶液中，为水溶液形式。为了使其长时间保存，优选的在纯化后进行冷冻干燥，以冻干粉的形式保存。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的乙二胺四乙酸双核铂配合物及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
向反应瓶中加入30.15mg的乙二胺四乙酸和65mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至8.1，加入61.91mg的CDDP。搅拌反应72h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。核磁共振氢谱（1H NMR,400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物的多重峰。通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认：本实施例所制备得到的产物为目标产物。
实施例2
向反应瓶中加入33.69mg的乙二胺四乙酸和70mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至6.8，加入69.18mg的CDDP。室温搅拌反应60h后，用截留分子量为500的透析袋透析30h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.53ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物的多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例3
向反应瓶中加入32.15mg的乙二胺四乙酸和65mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.3，加入66.02mg的CDDP。室温搅拌反应120h后，用截留分子量为500的透析袋透析24h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例4
向反应瓶中加入35.80mg的乙二胺四乙酸和75mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.9，加入73.51mg的CDDP。室温搅拌反应100h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例5
向反应瓶中加入34.55mg的乙二胺四乙酸和70mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至8.3，加入70.95mg的CDDP。室温搅拌反应96h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例6
向反应瓶中加入31.77mg的乙二胺四乙酸和70mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.4，加入65.24mg的CDDP。室温搅拌反应48h后，用用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例7
向反应瓶中加入33.19mg的乙二胺四乙酸和70mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.1，加入68.15mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例8
向反应瓶中加入32.58mg的乙二胺四乙酸和65mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.6，加入66.91mg的CDDP。室温搅拌反应68h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例9
向反应瓶中加入33.25mg的乙二胺四乙酸和70mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至6.9，加入68.28mg的CDDP。室温搅拌反应50h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例10
向反应瓶中加入36.21mg的乙二胺四乙酸和80mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.3，加入74.36mg的CDDP。室温搅拌反应60h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例11
向反应瓶中加入34.46mg的乙二胺四乙酸和73mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.6，加入70.76mg的CDDP。室温搅拌反应48h后，用截留分子量为500的透析袋透析50h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例12
向反应瓶中加入31.37mg的乙二胺四乙酸和65mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.1，加入64.42mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例13
向反应瓶中加入32.67mg的乙二胺四乙酸和70mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.2，加入67.09mg的CDDP。室温搅拌反应96h后，用截留分子量为500的透析袋透析48h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例14
向反应瓶中加入32.73mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和55mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至8.2，加入52.77mg的CDDP。室温搅拌反应70h后，用截留分子量为500的透析袋透析30h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例15
向反应瓶中加入34.17mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和70mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至8.1，加入55.09mg的CDDP。室温搅拌反应60h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例16
向反应瓶中加入32.57mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和55mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.6，加入52.51mg的CDDP。室温搅拌反应100h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例17
向反应瓶中加入38.19mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和60mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.2，加入61.57mg的CDDP。室温搅拌反应80h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例18
向反应瓶中加入36.43mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和60mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.4，加入58.73mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即二价乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例19
向反应瓶中加入34.5mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和60mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.8，加入55.62mg的CDDP。室温搅拌反应68h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即二价乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例20
向反应瓶中加入32.28mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和55mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至6.8，加入52.04mg的CDDP。室温搅拌反应60h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即二价乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例21
向反应瓶中加入35.73mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和60mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至8.1，加入57.60mg的CDDP。室温搅拌反应70h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即二价乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例22
向反应瓶中加入36.79mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和65mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至8.3，加入59.31mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例23
向反应瓶中加入35.90mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和60mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.4，加入57.90mg的CDDP。室温搅拌反应60h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即二价乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例24
向反应瓶中加入36.25mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和60mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.5，加入58.44mg的CDDP。室温搅拌反应50h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例25
向反应瓶中加入39.57mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和65mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至7.3，加入63.79mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为500的透析袋透析48h，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即二价乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例26
向反应瓶中加入346.51mg的乙二胺四乙酸和700mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.4，加入711.55mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例27
向反应瓶中加入372.65mg的乙二胺四乙酸和750mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.6，加入765.22mg的CDDP。室温搅拌反应96h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例28
向反应瓶中加入400.19mg的乙二胺四乙酸和800mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至8.0，加入821.77mg的CDDP。室温搅拌反应120h后，用截留分子量为500的透析袋透析48h，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例29
向反应瓶中加入380.19mg的二水合合乙二胺四乙酸二钠和6mL纯水，用0.1M的NaOH调节pH至7.4，加入612.92mg的CDDP。室温搅拌反应72h后，用截留分子量为500的透析袋透析36h，收集得透明无色液体，4℃冰箱保存。
取少量液体产物冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例30
向反应瓶中加入415.7mg的二水合乙二胺四乙酸二钠和700mL纯水，用0.1M的KOH调节pH至8.0，加入670.16mg的CDDP。室温搅拌反应96h后，用截留分子量为200的纳滤膜反复纯化，收集液体，冷冻干燥得淡黄色晶状固体，即乙二胺四乙酸双核铂配合物。
1H NMR,（400MHz,D2O）的结果显示：2.97～3.08ppm（s,-NCH2CO-），2.40～2.52ppm（s,-NCH2CH2N-）的EDTA峰完全消失，3.35～4.65ppm出现产物多重峰。通过MALDI-TOF-MS对所得固体进行表征，得到如下数据：735.4，730.2，718.3，713.2，696.2。均为所述配合物的碎片离子峰。由此可以确认目标产物成功合成。
实施例31
收集对数期PC-3细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（～8×103个）细胞；
在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h，弃培养液；
用培养基将顺铂裸药稀释为160μmol pt/L、80μmol pt/L、40μmol pt/L、20μmol pt/L、10μmol pt/L、5μmol pt/L、2.5μmol pt/L7个浓度的样品，用培养基将实施例14制备的乙二胺四乙酸铂配合物分别按照铂浓度稀释为320μmol pt/L、160μmol pt/L、80μmol pt/L、40μmol pt/L、20μmol pt/L、10μmol pt/L、5μmol pt/L7个浓度的样品；
将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；
在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48h；
48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；
终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在490nm处的吸收值，换算得到各个浓度的顺铂及乙二胺四乙酸铂配合物的细胞存活率。
实施例32
收集对数期MCF-7细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（～8×103个）细胞；
在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h，弃培养液；
用培养基将顺铂裸药稀释为160μmol pt/L、80μmol pt/L、40μmol pt/L、20μmol pt/L、10μmol pt/L、5μmol pt/L、2.5μmol pt/L7个浓度的样品，用培养基将实施例14制备的二价乙二胺四乙酸双核铂配合物分别按照铂浓度稀释为320μmol pt/L、160μmol pt/L、80μmol pt/L、40μmol pt/L、20μmol pt/L、10μmol pt/L、5μmol pt/L7个浓度的样品；
将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；
在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48h；
48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；
终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在490nm处的吸收值，换算得到各个浓度的顺铂及二价双核铂的细胞存活率。
实施例33
收集对数期HeLa细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（～8×103个）细胞；
在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h，弃培养液；
用培养基将顺铂裸药稀释为160μmol pt/L、80μmol pt/L、40μmol pt/L、20μmol pt/L、10μmol pt/L、5μmol pt/L、2.5μmol pt/L7个浓度的样品，用培养基将实施例14制备的二价乙二胺四乙酸双核铂配合物分别按照铂浓度稀释为320μmol pt/L、160μmol pt/L、80μmol pt/L、40μmol pt/L、20μmol pt/L、10μmol pt/L、5μmol pt/L7个浓度的样品；
将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；
在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48h；
48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；
终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在490nm处的吸收值，换算得到各个浓度的顺铂及二价双核铂的细胞存活率。
比较顺铂裸药以及乙二胺四乙酸双核铂配合物作用的效果参见图1、图2和图3。图1为本发明实施例14制备的乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物以及顺铂对PC-3细胞的毒性考察结果图，其中，曲线A为顺铂对细胞的毒性效果，曲线B为实施例14制备的乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物对细胞的毒性效果。由图1可知，与顺铂裸药相比，二价乙二胺四乙酸双核铂配合物在相同铂浓度条件下，明显降低了原药毒性（IC50为顺铂的2.2倍），并且随着铂浓度的增大，细胞的存活率降低，由此可见，二价乙二胺四乙酸双核铂配合物可以显著降低原药毒性，并呈现明显的剂量与药效关系。
图2为本发明实施例14制备的乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物以及顺铂对MCF-7细胞的毒性考察结果图，其中，曲线A为顺铂对细胞的毒性效果，曲线B为实施例14制备的乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物对细胞的毒性效果。由图2可知，与顺铂裸药相比，二价乙二胺四乙酸双核铂配合物在相同铂浓度条件下，明显降低了原药毒性（IC50为顺铂的3.7倍），并且随着铂浓度的增大，细胞的存活率降低，由此可见，二价乙二胺四乙酸双核铂配合物可以显著降低原药毒性，并呈现明显的剂量与药效关系。
图3为本发明实施例14制备的乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物以及顺铂对HeLa细胞的毒性考察结果图，其中，曲线A为顺铂对细胞的毒性效果，曲线B为实施例14制备的乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物对细胞的毒性效果。由图3可知，与顺铂裸药相比，二价乙二胺四乙酸双核铂配合物在相同铂浓度条件下，明显降低了原药毒性（IC50为顺铂的3.4倍），并且随着铂浓度的增大，细胞的存活率降低，由此可见，二价乙二胺四乙酸双核铂配合物可以显著降低原药毒性，并呈现明显的剂量与药效关系。
综上，经过48小时培养，乙二胺四乙酸二价乙二胺四乙酸双核铂配合物在PC-3、MCF-7和HeLa三种细胞系上均显示了低于顺铂原药的细胞毒性。可见，经过EDTA的配位螯合作用，可有效降低顺铂原药的毒性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.乙二胺四乙酸双核铂配合物，如式（I）所示：
2.乙二胺四乙酸双核铂配合物的制备方法，包括以下步骤：
（A）将乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠溶解在水性溶液中，调节水性溶液的pH至6.0～9.0；
（B）在所述水溶液中加入顺铂，搅拌反应，纯化后得到如式（I）所示的乙二胺四乙酸双核铂配合物；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸或者乙二胺四乙酸二钠与顺铂的摩尔比为1:（2～4）。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B）中，所述搅拌时间为20～120小时。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B）中，所述纯化为透析或超滤。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（A）中，所述水性溶液为水、生理盐水、注射用液、缓冲溶液或组织培养液。
7.根据权利要求2～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B）中，所述纯化后还包括冷冻干燥。
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