CN103417554B - 一种抗肿瘤的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其应用。具体地，将牛蒡子苷元（或其衍生物）和2‑脱氧葡萄糖（或其衍生物）联用治疗肿瘤可以产生明显的协同效应。本发明还提供了用于治疗肿瘤的药物组合物，所述组合物既可以增强抗肿瘤药效，也能降低对细胞的毒性。本发明为肿瘤的靶向治疗提供了新的策略。

Description

一种抗肿瘤的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗领域，具体地，本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其应用。

背景技术

肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病。癌症相关基因的异常可以引起肿瘤基因组稳定性丧失，进而导致肿瘤细胞出现异常的生物学行为，如逃避凋亡、无限复制的潜能、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等。目前，外科手术、放、化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法；外科手术和放射治疗是局部治疗的方法，药物治疗属于全身效应的方法，更多地考虑到了恶性肿瘤能够扩散和转移的特质。

传统化疗靶向增殖性细胞，不仅杀伤肿瘤细胞，对正常的机体细胞也有破坏作用，从而出现一系列的毒副作用及后遗症。很多患者因惧怕治疗的毒副作用而不敢接受治疗；即使那些已接受抗肿瘤治疗的患者也常因在治疗期间出现严重的不良反应而被迫推迟或终止治疗。因此，寻找能够选择性杀伤肿瘤的治疗手段显得尤为重要。

研究表明，实体瘤所处的生存状况跟正常组织存在很大的不同。如，在正常组织中，氧气和营养物质（包括葡萄糖和生长因子等）足以维持细胞的存活和增殖，而肿瘤细胞生长极其迅速，对氧气和营养物质的需求通常远远超过现有供应，因而肿瘤的生长和发展极大地依赖于血管生成以提供营养充足的血流。抗血管生成治疗被认为是一种有潜质的肿瘤治疗方法。然而研究发现，即使血管发育正常的情况下，一些肿瘤细胞仍然处于缺乏氧气和营养物质状态，这可能是因为肿瘤细胞生长太快，或是因为新形成的血管网络没有组织好，还没有功能。但是，肿瘤细胞似乎对这些极端条件例如低氧压和低营养具有很强的耐受。尤其那些高度恶性肿瘤例如胰腺癌，他们通常处于少血管的状态。

已经证实，牛蒡子苷元（arctigenin）能选择性杀伤营养缺乏的肿瘤细胞。在体外，牛蒡子苷元能够选择性杀伤葡萄糖缺乏的肿瘤细胞，明显抑制PANC-1肿瘤在裸鼠体内生长。Hirano T等证明牛蒡子苷元对白血病细胞株HL-60有较强的抑制活性，IC₅₀<100ng/mL，与目前使用的抗白血病药物活性相当。另外牛蒡子苷元对其他两种白血病细胞株K562和MH60也有很好的抑制增殖的作用。在大鼠体内，牛蒡子苷元能够有效抑制杂环胺(heterocyclic amines)诱导的结肠癌、胰腺癌和肝癌。牛蒡子苷元还能够减轻小鼠的皮肤癌。

2-脱氧葡萄糖（2-Deoxyglucose，2DG）是一种非代谢的葡萄糖类似物，通常被用作糖酵解抑制剂，能够抑制糖酵解过程中的第一个限速酶-己糖激酶。作为一种天然抗代谢物类抗生素，具有抑制病毒感染、酵母发酵、病菌及肿瘤细胞生长等多种生理药理效应，还能抗病毒、抗菌、抗癌、抗癫痫、抗衰老等作用。目前主要用于畜禽各种病毒病、免疫抑制病的预防和治疗，也可作为细菌及支原体感染的辅助治疗。

然而本领域尚不了解将这两类独特的药物，牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖结合起来治疗肿瘤会产生怎样的效果，因此迫切需要了解牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖联用的效果及其作用机理。

发明内容

本发明的目的就是提供一种牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖联用在治疗肿瘤中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物包括：有效量的牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物，和有效量的2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物，以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物与2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的摩尔比为1∶50000－1∶500，较佳地1∶10000－1∶1000，更佳地1∶8000－1∶4000。

在本发明的第二方面，提供了第一方面所述药物组合物的用途，它被用于抑制肿瘤生长，和/或抑制肿瘤转移。

在另一优选例中，所述的药物组合物还具有选自下组的一种或多种用途：抑制线粒体呼吸链和己糖激酶活性、诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤新生血管的生成。

在本发明的第三方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：

组分（1）：含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂；

组分（2）：含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂；和

组分（3）：说明书。

在另一优选例中，所述含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。

在另一优选例中，所述含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。

在另一优选例中，所述的含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂与所述的含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂的摩尔比为1∶50000－1∶500，较佳地1∶10000－1∶1000，更佳地1∶8000－1∶4000。

在另一优选例中，所述含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂是含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型；或所述含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂是含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型。

在另一优选例中，所述的药盒中含有至少两个含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型和至少两个含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型；较佳地各为4－10个。

在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：将肿瘤细胞和本发明第一方面所述的药物组合物混合培养。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：肝癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞。

在另一优选例中，所述方法包括：将肿瘤细胞（每孔2000－4000个细胞，优选每孔2500－3500个细胞，更优选每孔3000个细胞）和牛蒡子苷元及2-脱氧葡萄糖混合培养24－48小时。

在另一优选例中，混合培养液中牛蒡子苷元的终浓度为1-100μM。

在另一优选例中，混合培养液中2-脱氧葡萄糖的终浓度为5-500mM。

在本发明的第五方面，提供了一种试验性的肿瘤治疗方法，包括步骤：皮下接种肿瘤的裸鼠静脉注射本发明第一方面所述的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示A549细胞在正常﹑葡萄糖或血清饥饿条件下的存活率。

图2显示牛蒡子苷元对葡萄糖饥饿的A549细胞的选择性毒性。在正常（G+S+）﹑葡萄糖（G-S+）或血清缺乏（G+S-）条件下，用不同浓度的蒡子苷元对A549细胞处理24h（A）或用10μM的arctigenin处理不同的时间（B），然后进行MTT测试。将各处理条件下DMSO处理的细胞或起始时间点的细胞数目作为100%。

图3显示牛蒡子苷元诱导葡萄糖饥饿的A549细胞发生坏死；其中，图3A显示，在葡萄糖缺乏条件下用10μM牛蒡子苷元对A549细胞进行处理0h，2h或6h后，进行PI/Annexin V染色并进行流式细胞仪分析的结果；图3B显示，在葡萄糖缺乏条件下用10μM牛蒡子苷元对A549细胞进行处理0h或6h后，用扫描电镜对细胞的细胞超微结构进行观察结果；b和d图分别为a和c的放大图片，箭指示线粒体，而箭头指示细胞膜。

图4显示牛蒡子苷元诱导的ROS水平升高造成了葡萄糖饥饿细胞的死亡；其中，图4A显示在正常、葡萄糖饥饿和血清饥饿的条件下，牛蒡子苷元对细胞内ROS含量的影响；图4B显示抗氧化剂DTT能够抑制牛蒡子苷元造成的葡萄糖饥饿细胞死亡。

图5显示牛蒡子苷元诱导的ATP水平下降造成了葡萄糖饥饿细胞的死亡。

图5A显示在各处理条件下用10μM的牛蒡子苷元处理A549细胞30min后，细胞内AMPK磷酸化水平的变化情况；图5B显示在正常、葡萄糖饥饿和血清饥饿的条件下，牛蒡子苷元对细胞内ATP水平的影响；图5C显示向细胞补充1mM ATP或腺苷能够抑制牛蒡子苷元造成的葡萄糖饥饿细胞死亡。

图6显示Arctigenin和2DG联用抑制癌症细胞的存活率，分别用10μM的arctigenin(A)，60mM的2DG(B)或二者的组合(C)处理正常的和癌细胞24h，进行MTT检测，数据为与对照相比的存活细胞的比例，正常细胞系：Lo2(1#)，HBE(2#)和Wi-38(3#)；肿瘤细胞系：神经胶质瘤H4(4#)，肺癌A549(5#)，宫颈癌Hela(6#)，乳腺癌Hs578T(7#)和胃癌HGC(8#)。

图7显示Arctigenin对不同肿瘤细胞系的毒性结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖连用治疗肿瘤可以产生明显的协同效应，二者联用既可以增强抗肿瘤药效，也能降低对细胞的毒性。具体地，牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物与2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的摩尔比为1∶50000－1∶500，较佳地1∶10000－1∶1000，更佳地1∶8000－1∶4000。本发明为肿瘤靶向治疗提供新的策略。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“牛蒡子苷元”、“arctigenin”、或“牛蒡子苷元衍生物”是指具有式I结构的化合物：

式I

本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得牛蒡子苷元，如从植物原料中提取，或使用人工全合成的方法合成所述化合物。所述的植物原料为任何含有牛蒡子苷元或其衍生物的植物（如牛蒡）及其组织培养物。

本文所述的“牛蒡子苷元衍生物”包括本领域技术人员能够通过简单的化学方法，例如取代、还原等方法对于骨架上的侧链基团进行修饰，而仍然保留青牛蒡子苷元活性的那些衍生物。这些衍生物的合成方法可以参考现有技术中的教科书。同时，牛蒡子苷元衍生物还包括其各种酸碱形式的盐、水合物、光学异构体等。

2-脱氧葡萄糖

如本文所用，术语“2-脱氧葡萄糖”、“2DG”、或“2-脱氧葡萄糖衍生物”是指具有式II结构的化合物：

式II

本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得-脱氧葡萄糖，如使用人工全合成的方法。合成2-脱氧葡萄糖的原材料包括：D-glucose（D-葡萄糖）、D-mannose（D-甘露糖）、calcium D-gluconate（D-葡萄糖酸钙）、D-arabinose（D-阿拉伯糖）、D-glucosaminehydrochloride（盐酸D-葡萄糖胺）、N-acetyl glucosamine（N-乙酰基葡萄糖）、chitin（几丁质）、壳聚糖和羧甲基壳聚糖等。

本文所述的“2-脱氧葡萄糖衍生物”包括本领域技术人员能够通过简单的化学方法，例如取代、还原等方法对于骨架上的侧链基团进行修饰，而仍然保留2-脱氧葡萄糖活性的那些衍生物。这些衍生物的合成方法可以参考现有技术中的教科书。同时，2-脱氧葡萄糖衍生物还包括其各种酸碱形式的盐、水合物、光学异构体等。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，所述组合物包括：有效量的牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物，和有效量的2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物，以及药学上可接受的载体。

在本发明的一个优选例中，牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物与2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的摩尔比为1∶50000－1∶500，较佳地1∶10000－1∶1000，更佳地1∶8000－1∶4000。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，它被用于抑制肿瘤生长和/或转移。在本发明的一个优选例中，所述的药物组合物还具有选自下组的一种或多种用途：抑制线粒体呼吸链和己糖激酶活性、诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤新生血管的生成。

通常，可将本发明的牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物，或2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物和/或细胞产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述药物的有效量可随给药的模式和肿瘤的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；肿瘤的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

药盒

本发明提供一种药盒，所述药盒包括：

组分（1）：含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂；

组分（2）：含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂；和

组分（3）：说明书。

所述的含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂为将牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水，醇类（甲醇和乙醇），乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有机溶剂，优选乙酸乙酯和丙酮等中等极性溶剂。

所述的含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂为将2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水，醇类（甲醇和乙醇），乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有机溶剂，优选乙酸乙酯和丙酮等中等极性溶剂。

所述的含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。

所述的含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。

所述含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂可以是含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型，所述含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂可以是含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型。

药盒中装有至少两个含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型和至少两个含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型；较佳地各为4－10个。

本发明中牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物与2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的摩尔比为1∶50000－1∶500，较佳地1∶10000－1∶1000，更佳地1∶8000－1∶4000。

如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

本发明提供的说明书中可以有如下描述：所述药盒的使用方法是同时使用含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型和含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型。

本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂和含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。

所述的含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的制剂优选含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型，所述含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的制剂优选含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型。

所述步骤优选将至少两个含有牛蒡子苷元或牛蒡子苷元衍生物的单元剂型和至少两个含有2-脱氧葡萄糖或2-脱氧葡萄糖衍生物的单元剂型，以及说明书一起放置，形成药盒。

本发明提供的药盒用于治疗肿瘤，所述的肿瘤包括肺癌，神经胶质瘤、宫颈癌，乳腺癌，胃癌等；优选肺癌，宫颈癌，乳腺癌和胃癌。

应用

本发明提供一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞生长的方法，在本发明的一个优选例中，所述的方法包括步骤：将肿瘤细胞和本发明的药物组合物混合培养。

在本发明的一个优选例中，将肿瘤细胞和权利要求1所述的药物组合物混合培养24小时。所述的肿瘤选自下组：肺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、胰腺癌、胃癌。

在本发明的一个优选例中，将肿瘤细胞（每孔2000－4000个细胞，优选每孔2500－3500个细胞，更优选每孔3000个细胞）和牛蒡子苷元及2-脱氧葡萄糖混合培养24－48小时。较佳地，牛蒡子苷元的终浓度为1-100μM；2-脱氧葡萄糖的终浓度为5-500mM。

本发明还提供了一种试验性的肿瘤的治疗方法，所述的方法包括步骤：皮下接种肿瘤的裸鼠静脉注射本发明的药物组合物。

本发明的主要优点包括：

牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖连用治疗肿瘤，既增强了抗肿瘤药效，也降低了毒性，为肿瘤靶向治疗提供新的策略。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1牛蒡子苷元选择性诱导葡萄糖缺乏的A549细胞发生坏死

为了模拟体内实体瘤细胞处在的营养缺乏的微环境，在本实施例中，发明人首先将细胞种在含正常培养液的细胞培养板中，在细胞贴壁后加药处理之前，用PBS洗一遍，再给细胞换上不含葡萄糖或不含血清的培养液。

首先对几种肿瘤细胞株（包括HepG2、Hela、A549、H4和HGC）对葡萄糖缺乏的耐受性进行了检测，结果表明，人肺癌细胞系A549细胞株对葡萄糖缺乏的耐受性相对较强。结果如图1所示，葡萄糖剥夺24小时后，A549细胞的存活率在60%左右。

接下来，在A549细胞上，发明人对牛蒡子苷元选择性杀伤葡萄糖缺乏肿瘤细胞的作用进行了研究。结果表明，牛蒡子苷元能抑制处于葡萄糖缺乏状态的A549细胞的存活，且该抑制作用具有时间和剂量依赖性，而牛蒡子苷元对于处于正常情况或是血清缺乏状态的细胞存活没有影响（图2）。

细胞死亡类型主要有凋亡和坏死。为了检测牛蒡子苷元造成细胞的死亡方式，发明人将细胞进行了Annexin V和溴乙锭（PI）双染，然后再进行流式细胞仪检测。

结果显示，在葡萄糖缺乏条件下牛蒡子苷元显著地增加了annexin-V-/PI+细胞的百分比，并呈时间依赖性，但对于annexin-V+/PI-细胞的百分比影响不大（图3A）。此外利用扫描电镜观察了死亡细胞的超微结构，结果如图3B所示,对照组细胞（a,b）具有完整的膜结构﹑细胞器以及正常的核形态。但是牛蒡子苷元和葡萄糖剥夺处理后的细胞（c,d）表现出膜破裂，线粒体肿胀以及非正常的染色质凝聚，而这些均为坏死的经典特征（图3B）。

以上结果表明牛蒡子苷元促使葡萄糖缺乏细胞发生坏死。

实施例2细胞内ROS水平升高是牛蒡子苷元造成肿瘤细胞坏死的诱因

为了检测牛蒡子苷元是否通过增加细胞内的ROS杀伤葡萄糖缺乏肿瘤细胞，发明人采用了DCFH-DA荧光探针对胞内的ROS进行检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成不具膜通透性的DCFH。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有绿色荧光的DCF。因此可以通过绿色荧光的强度反映细胞内的ROS水平。发明人通过流式细胞仪技术对荧光强度进行了定量。

结果显示，在葡萄糖缺乏的情况下，牛蒡子苷元产生的ROS水平为对照组（即DMSOin‘G+S+’medium）的5倍。然而，在血清缺乏的条件下，DMSO或牛蒡子苷元处理过的细胞都产生很高的ROS水平，分别是对照组的18和25倍（图4A）。

为了进一步验证细胞内ROS水平升高是否介导了牛蒡子苷元造成的葡萄糖缺乏细胞的死亡，利用抗氧化剂DTT来降低细胞内的ROS水平。发明人还采用了Hoechst 33342/PI双染法对细胞的存活情况进行检测，每孔细胞选取5个不同区域进行拍照以做后续统计。PI阳性细胞的百分比（PI阳性细胞数/PI阳性细胞数+Hoechst阳性细胞数）被用来表征死亡细胞的比例。实验结果显示，0.5mM和1mM的DTT均能有效抑制死亡细胞的数目（图4B）。

以上结果表明，在葡萄糖缺乏条件下，牛蒡子苷元引起了细胞内ROS水平升高，进而造成细胞坏死。

实施例3细胞内ATP极度缺乏是牛蒡子苷元造成肿瘤细胞坏死的诱因

化学渗透学说认为：电子传递链推动H+跨过线粒体内膜到线粒体的间隙，造成了膜内外两侧间跨膜的化学电位差，后者被膜上ATP合成酶所利用，使ADP与Pi合成ATP。因此，抑制线粒体呼吸很可能会阻碍ATP合成。为了检测牛蒡子苷元杀伤葡萄糖缺乏肿瘤细胞是否与ATP减少有关，发明人首先对AMPK磷酸化水平进行了检测（由于AMPK是细胞重要的能量感受器）。结果表明，牛蒡子苷元能够选择性的促进葡萄糖缺乏细胞的AMPK磷酸化水平（图5A）。

接着，发明人利用荧光素-荧光素酶体系对细胞内的ATP水平进行了直接检测。荧光素在ATP和氧存在的情况下，被荧光素酶催化生成氧化荧光素，同时产生光子。当荧光素处于过量饱和的情况下，每一分子ATP释放出一个光子，因此光的强度与检测样本中ATP的水平成正比。

实验结果如图5B显示，在正常或是血清缺乏的条件下,牛蒡子苷元不影响细胞内的ATP水平。然而，在葡萄糖缺乏的条件下，牛蒡子苷元能够时间依赖的减少A549细胞内的ATP水平。尤其在处理6小时后,细胞内的ATP仅剩10%。

为了检测牛蒡子苷元是否通过减少胞内的ATP水平从而达到杀伤葡萄糖缺乏肿瘤细胞的效果，发明人向细胞培养液中补充了ATP或腺苷（adenosine）从而达到增加细胞内的ATP水平的目的。葡萄糖剥夺处理12小时后，葡萄糖缺乏本身并不造成细胞死亡。牛蒡子苷元在葡萄糖缺乏的条件下造成44%的细胞发生坏死，而向细胞培养液补充1mM ATP或腺苷后将死亡细胞分别抑制至3.5%和1.6%。葡萄糖剥夺处理24小时后，葡萄糖缺乏本身仍然没有造成明显的细胞死亡。牛蒡子苷元在葡萄糖缺乏的条件下造成了95%的细胞发生坏死，而向细胞培养液补充1mM ATP或腺苷后将PI阳性细胞的百分比分别降至33%和30%。

这些结果显示，向细胞补充ATP或腺苷能够有效抑制牛蒡子苷元对葡萄糖缺乏肿瘤细胞的毒性，说明细胞内ATP极度减少是牛蒡子苷元造成葡萄糖缺乏肿瘤细胞坏死的重要诱因。

实施例4牛蒡子苷元和2DG联合使用选择性的杀伤肿瘤细胞

向24孔细胞培养板（细胞浓度为10⁵/孔）加入以下物质：

A：10μM的arctigenin（终浓度）；

B：60mM的2DG（终浓度）；

C：10μM的arctigenin（终浓度）+60mM的2DG（终浓度）。

在三种来源于人的正常细胞株和五种癌细胞株上分别检测牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖联合使用对细胞存活的影响。正常细胞株包括：Lo2（人正常肝细胞，Wi-38（人胚肺成纤维细胞）和HBE（人支气管上皮细胞）。癌细胞株包括：A549（人肝癌细胞），H4（人脑神经胶质瘤细胞），Hela（人宫颈癌细胞），Hs578T（人乳腺癌细胞）和HGC（人胃癌细胞）。

分别用10μM的arctigenin(A)，60mM的2DG(B)或二者的组合(C)处理正常的和癌细胞24h，MTT结果显示（图6），不管在正常细胞还是癌细胞上牛蒡子苷元（10μM）均没有细胞毒性；2-脱氧葡萄糖（60mM）在正常细胞和癌细胞上表现出类似的细胞毒性，均造成47%存活率；然而，牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖联合使用后造成协同的细胞毒性，正常细胞的平均存活率为25%，而癌细胞平均存活率仅为10%。结果表明，牛蒡子苷元和2-脱氧葡萄糖联合使用能够产生协同作用，这种联合使用对肿瘤细胞的杀伤具有一定的选择性。

实施例5牛蒡子苷元抑瘤效果具有细胞选择性

本实施例对多种不同组织来源的肿瘤细胞的存活率进行考察，结果发现，HepG2、HL-60、Jurkat、U937及INS-1细胞对牛蒡子苷元的毒性比较敏感，IC₅₀均在2μM上下。H4、Hela、A549和PANC-1对牛蒡子苷元非常不敏感，IC₅₀均在500μM以上（图7，表1）。

表1

实施例6

药盒的制备

本实施例的药盒通过下述步骤制备得到：

将含有牛蒡子苷元的制剂A和含有2-脱氧葡萄糖的制剂B，以及说明书一起放置，形成药盒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括：

有效量的牛蒡子苷元，和有效量的2-脱氧葡萄糖，以及药学上可接受的载体，其中，所述牛蒡子苷元与2-脱氧葡萄糖的摩尔比为1：50000－1：500。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，牛蒡子苷元与2-脱氧葡萄糖的摩尔比为1：10000－1：1000。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，牛蒡子苷元与2-脱氧葡萄糖的摩尔比为1：8000－1：4000。

4.权利要求1所述的药物组合物的用途，其特征在于，它被用于制备抑制肿瘤生长，和/或抑制肿瘤转移的药盒，所述的抑制肿瘤包括抑制线粒体呼吸链和己糖激酶活性、诱导肿瘤细胞的凋亡、或抑制肿瘤新生血管的生成。

5.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：

组分(1)：含有牛蒡子苷元的制剂；

组分(2)：含有2-脱氧葡萄糖的制剂；和

组分(3)：说明书，

其中，所述的含有牛蒡子苷元的制剂与所述的含有2-脱氧葡萄糖的制剂的摩尔比为1：50000－1：500。

6.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的含有牛蒡子苷元的制剂与所述的含有2-脱氧葡萄糖的制剂的摩尔比为1：10000－1：1000。

7.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的含有牛蒡子苷元的制剂与所述的含有2-脱氧葡萄糖的制剂的摩尔比为1：8000－1：4000。

8.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述含有牛蒡子苷元的制剂是含有牛蒡子苷元的单元剂型；或所述含有2-脱氧葡萄糖的制剂是含有2-脱氧葡萄糖的单元剂型。

9.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述含有牛蒡子苷元的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。

10.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述含有2-脱氧葡萄糖的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。

11.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中含有至少两个含有牛蒡子苷元的单元剂型和至少两个含有2-脱氧葡萄糖的单元剂型。

12.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中分别含有4-10个含有牛蒡子苷元的单元剂型和含有2-脱氧葡萄糖的单元剂型。

13.一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：将肿瘤细胞和权利要求1所述的药物组合物混合培养。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞选自下组：肝癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将肿瘤细胞按每孔2000－4000个细胞和牛蒡子苷元及2-脱氧葡萄糖混合培养24－48小时。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述混合培养的培养液中牛蒡子苷元的终浓度为1-100μM。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述混合培养的培养液中2-脱氧葡萄糖的终浓度为5-500mM。

18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为每孔2500－3500个细胞。

19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为每孔3000个细胞。