CN102274182B - 一种含有艾塞那肽的多囊脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有艾塞那肽的多囊脂质体及其制备方法和应用。其多囊脂质体包括下列重量份的各组分：艾塞那肽1份、脂质成分0.1～200份、pH调节剂0.2～10份、渗透压调节剂13～590份和辅助乳化剂5～150份，其中所述的脂质成分包括重量比为0.4∶1～19∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％的三酸甘油酯。本发明将治疗II型糖尿病的药物艾塞那肽制备成多囊脂质体制剂。利用药物活性成分艾塞那肽易溶于水的性质，直接将其溶解于内水相中，采用复乳溶剂蒸发法进行制备，原料利用率高，载药浓度高，药物包封率高，稳定性好，缓释良好，降血糖效果更佳，从而减少用药次数和频率，减少不良反应，提高病人的顺应性。

Description

一种含有艾塞那肽的多囊脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于缓释制剂领域，特别涉及一种含有艾塞那肽的多囊脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

据国际糖尿病联盟(IDF)最新统计，2009年全球糖尿病患病人数超过2.85亿人，每年新增糖尿病患者700万人，预计在未来的20年内，全球糖尿病患者人数将达到4.4亿。我国糖尿病患者人数排世界第二位，仅次于印度，目前我国共有2型糖尿病患者约7000万，城市人口2型糖尿病患病率平均为4.8％，但并发症控制率不足20％。因此，研究开发理想的糖尿病临床用药非常重要。

艾塞那肽(代号AC-2993，化学名exenatide)最先从美国大毒蜥进食时分泌的唾液中分离出来的，为Exendin-4类激动剂，具有肠促胰岛素模拟作用的人工合成肽类物质。

艾塞那肽是一种含有39个氨基酸的多肽，与人的胰高血糖素(glucagon)有48％的同源性，与人的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)有53％的同源性，于GLP-1受体有高度亲和性并具有相似的生理功能。

艾塞那肽的氨基酸序列为：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂，分子量为4186.6道尔顿，在水、甲醇或乙醇中易溶，比旋度为-61°～-68°。

艾塞那肽的药理作用包括：(1)显著增加葡萄糖依赖性促胰岛素分泌，在血糖水平正常或低血糖时并不刺激胰岛素的分泌，仅在血糖水平较高时刺激胰岛素分泌；(2)抑制II型糖尿病患者胰高血糖素的分泌，在高血糖时降低血清中胰高血糖素浓度，但不减弱正常胰高血糖素对低血糖的反应；(3)抑制餐后胃肠动力及分泌功能，延迟胃排空从而有利于餐后血糖的控制；(4)降低食欲，减少食物的摄入；(5)刺激β细胞增生或胚胎胰岛素成熟分化，抑制β细胞凋亡从而增加β细胞的数量；(6)恢复II型糖尿病患者丧失的胰岛素第一时相反应，显著增加第一时相剂第二时相胰岛素的分泌，改善II型糖尿病患者的空腹及餐后血糖水平。

由于艾塞那肽注射液临床给药方案是每次给药5～10μg，每天给药两次，使用周期长达半年以上，患者的顺应性差，因此开发其缓释制剂是临床急需的。

脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

多囊脂质体是基于脂质体的缓释药物传递系统，被用于局部、区域和系统药物传递。多囊脂质体还被称为多泡脂质体或多室脂质体，是含有多个非同心腔室的脂质体颗粒，形状类似于脂质体颗粒，这种颗粒的结构区别于含有多个同心腔室的多室脂质体，又区别于只含有单个内水相腔室的单室脂质体。许多水溶性药物可包封于多囊脂质体中，通过动物鞘内、皮下、腹腔和硬膜外给药，人体脑室内、鞘内、皮下、硬膜外给药都显示出了缓释作用。

Kim.S等人于1983年最先发现并研究了多囊脂质体。他们通过复乳溶剂蒸发法，以磷脂、胆固醇和中性脂质为成膜材料，以氯仿和乙醚为有机溶剂，成功制备了多囊脂质体，并凭借光学显微镜和电镜观察了多囊脂质体的微观结构。在制备过程中，首先将药物溶液和脂质相在机械作用力下形成油包水型乳液，再将此乳液与外水相混合制得复乳，然后氮气吹干除去有机溶剂而制得多囊脂质体混悬液。

多囊脂质体为非同心圆的拓朴结构，使其在注射部位形成药物“储库”，随着磷脂双分子层的不断代谢，包封在囊泡中的药物逐步释放至血液或病变部位，发挥很好的延迟释放作用。通过调节制备过程中的参数和处方比例，可以轻松控制药物释放时间在几天到数周之间。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的艾塞那肽制剂存在释放速度快，给药频繁，患者的顺应性差的缺陷，提供一种艾塞那肽的新制剂，其释放艾塞那肽缓慢，具有更佳的降血糖效果，可大大减少减少用药次数和频率。本发明还提供其制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种含有艾塞那肽的多囊脂质体，其中包括下列重量份的各组分：艾塞那肽1份、脂质成分0.1～200份、pH调节剂0.2～10份、渗透压调节剂13～590份和辅助乳化剂5～150份，其中所述的脂质成分包括重量比为0.4∶1～19∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％的三酸甘油酯。

根据本发明，所述的含有艾塞那肽的多囊脂质体中，药脂比较佳的是1∶0.1～1∶200，更佳的为1∶5～1∶40。本发明中，所述的“药脂比”是指药物活性成分艾塞那肽与多囊脂质体中的脂质成分的质量比。

本发明中，所述的脂质成份中包括中性磷脂。中性磷脂是指处于中性pH时整个分子的净电荷为零的磷脂。所述的中性磷脂可以是天然或者合成的中性磷脂，较佳的选自卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂、磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种或几种。

本发明中，所述的脂质成份中包括胆固醇。中性磷脂及胆固醇为成膜材料。胆固醇为膜调节剂，可通过改变磷脂相转变温度调节脂质体膜层的流动性，从而改善脂质体的稳定性，减小贮存过程中因脂质体膜层相变引起的药物渗漏。胆固醇用量过小，其调节作用甚微，当用量过大时难以形成脂质体的磷脂双分子层，研究表明当中性磷脂与胆固醇重量比在0.4∶1～19∶1之间，更佳的在2∶1～8∶1之间时形成的脂质体较稳定。

本发明中，所述的脂质成份中包括三酸甘油酯。三酸甘油酯是形成多囊脂质体拓扑结构的决定性因素之一。其在脂质体中主要起支架作用，分布于非同心水性腔室磷脂双分子层节点处，支撑起多囊脂质体的拓扑结构。所述的三酸甘油酯可以是天然或者合成的三酸甘油酯。天然三酸甘油酯较佳的如各种植物油、动物油。本发明中所述的三酸甘油酯更佳的选自三辛脂、三丁脂、大豆油、猪油脂和牛油脂中的一种或几种。三酸甘油酯在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％，更佳的是4～8％。

本发明中，所述的脂质成分中较佳的还可以含有负电荷磷脂或者脂肪胺。负电荷磷脂是指处于中性pH时整个分子带负电荷的磷脂。脂肪胺则带正电荷。这些带电荷的成分可有效调节脂质体表面电荷，使脂质体带负电或正电，以克服中性磷脂由于范德华力所导致的凝聚问题，从而增强制剂的稳定性。本发明所述的负电荷磷脂较佳的选自磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPZ)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPZ)、磷脂酸二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)中的一种或几种。而所述的脂肪胺较佳的为硬脂胺(SA)。所述的负电荷磷脂或者脂肪胺与中性脂质的重量比为1∶1～1∶28，较佳的为1∶2～1∶10。

本发明中，所述的艾塞那肽多囊脂质体包含渗透压调节剂。本发明中，所述的“渗透压调节剂”是指用于调节溶液渗透压的物质，可为本领域现有技术中常用的物质，如海藻糖、琥珀酸盐、环糊精、半乳糖、甘露醇、麦芽糖、甘露糖醇、柠檬酸盐、山梨醇、葡萄糖和蔗糖等，较佳的选自葡萄糖、蔗糖、甘露醇和氯化钠中的一种或几种。

本发明中，所述的艾塞那肽多囊脂质体包含pH调节剂。本发明中，所述的“pH调节剂”是指用于调剂溶液pH的物质，可为本领域现有技术中常用的物质，如柠檬酸、醋酸、磷酸和枸橼酸中的一种或几种。

本发明中，所述的艾塞那肽多囊脂质体包含辅助乳化剂。所述的“辅助乳化剂”是指用于调节乳化剂HLB值的物质，可以是本领域现有技术中常用的辅助乳化剂，较佳的可以选自赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、聚乙烯醇(PVA)、右旋糖酐、羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、明胶、海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。辅助乳化剂可增加产品的稳定性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种艾塞纳肽多囊脂质体的制备方法，其包括下列步骤：

①将脂质成分溶于有机溶剂中，以作为脂质相，其中该脂质成分包括重量比为0.4∶1～19∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％的三酸甘油酯，该中性磷脂在脂质相中的浓度为5～150mg/ml；

②将艾塞纳肽溶于含pH调节剂和渗透压调节剂的水溶液中，以作为内水相；

③将所述内水相加入脂质相上层，混合乳化制得油包水型(W/O)初乳；

④将外水相加入所述油包水型初乳的上层，搅拌形成水包油包水(W/O/W)型复乳，其中外水相中含有辅助乳化剂和渗透压调节剂；

⑤除去步骤④得到的复乳中的有机溶剂而制得艾塞纳肽多囊脂质体初品。

⑥用等渗溶液洗涤所述艾塞那肽多囊脂质体初品，再分散于等渗溶液中，制得艾塞那肽多囊脂质体成品。

本发明中，步骤①为将脂质成分溶于有机溶剂中，以作为脂质相，其中该脂质成分包括重量比为0.4∶1～19∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％的三酸甘油酯，该中性磷脂在脂质相中的浓度为5～150mg/ml。其中，所述的有机溶剂可为本领域常规的用于溶解脂质成分的有机溶剂，通常选自醚、烃、卤代烃、卤代醚和酯，较佳的选自乙醚、氯仿、二氯甲烷、环己烷、氯代甲醚和乙酸乙酯中的一种或几种。所述的中性磷脂或三酸甘油酯的具体种类均如前所述。

本发明中，步骤②为将艾塞纳肽溶于含pH调节剂和渗透压调节剂的水溶液中，以作为内水相。艾塞那肽的用量较佳的为0.05～20mg/ml，更佳的为0.5～15mg/ml。所述的渗透压调节剂浓度为＞0g/100mL，且≤6g/100mL。pH调节剂的浓度为10～120mM，较佳的为10～50mM。维持内水相的pH为2～5，更佳为3～4.5。所述的渗透压调节剂具体种类均如前所述。

本发明中，步骤③为将等体积的所述内水相加入脂质相上层，混合乳化制得油包水型(W/O)初乳。该制备油包水(W/O)型初乳的方法为本领域的常规技术，采用选自机械搅拌、超声和喷雾干燥的方法进行乳化。其中所述的内水相和脂质相的体积比较佳的为1∶1～1∶4，更佳的为1∶1～1∶2。

本发明中，步骤④为将外水相加入所述油包水型初乳的上层，搅拌形成水包油包水(W/O/W)型复乳，其中外水相中含有辅助乳化剂和渗透压调节剂。该所述的制备水包油包水(W/O/W)型复乳的方法为本领域的常规技术，采用选自机械搅拌、超声和喷雾干燥的方法进行乳化。所述的油包水型初乳和外水相的体积比较佳的为1∶1～1∶10，更佳的为1∶3～1∶5。所述的辅助乳化剂的浓度为0.5％～5％(wt)，较佳的为1％～3％(wt)。渗透压调节剂的浓度为＞0g/100mL，且≤6g/100mL，较佳的为3.2～6g/100mL。所述的辅助乳化剂或渗透压调节剂具体种类均如前所述。

本发明中，步骤⑤为除去步骤④得到的复乳中的有机溶剂而制得艾塞纳肽多囊脂质体初品。其中，除去有机溶剂的方法为本领域的常规的溶剂去除法，较佳的为气流吹干、旋转减压蒸发或喷雾干燥，其中气流吹干法所用气体可选自氮气、氦气、氩气、氧气、氢气和二氧化碳。

本发明中，步骤⑥为用等渗溶液洗涤所述艾塞那肽多囊脂质体初品，再分散于等渗溶液中，制得艾塞那肽多囊脂质体成品。其中，用等渗溶液洗涤的方法可以是本领域常规的方法，可用等渗溶液作为洗涤溶液，采用离心、透析或膜滤的方法去除其中的游离药物和辅助乳化剂，然后用等渗溶液悬浮。本发明中，所述的“等渗溶液”是指其渗透压等于血浆渗透压的溶液，较佳的为生理盐水。

本发明的艾塞那肽多囊脂质体的给药途径与常规的脂质体一样，如肌肉注射、皮下注射、硬膜外注射或鞘内注射等。

根据本发明，所说的药物活性成分艾塞那肽为化合物艾塞那肽。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

一切以本发明为基础的艾塞那肽多囊脂质体以及它们的制备方法都在本发明的范围之内。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明将治疗II型糖尿病的药物艾塞那肽制备成艾塞那肽多囊脂质体。利用药物活性成分艾塞那肽易溶于水的性质，直接将其溶解于内水相中，采用复乳溶剂蒸发法进行制备，原料利用率高，载药浓度高。本发明的艾塞那肽多囊脂质体药物包封率高，稳定性好，在大鼠体内药效学试验中显示具有与普通注射剂相当的治疗效果，并且在体内、体外试验中均显示有良好的缓释作用，具有更佳的降血糖效果。从而减少用药次数和频率，减少不良反应，提高病人的顺应性。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是本发明艾塞那肽多囊脂质体药效学实验数据。

图2是本发明艾塞那肽多囊脂质体体外释放实验数据。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中由摩尔比换算得到的物料的重量投料，由于磷脂多为混合物，故在计算时取其大约分子量。涉及到的物质的分子量如下：卵磷脂750、氢化大豆磷脂790、磷脂酸424.5、硬脂胺269.5、胆固醇387、三油酸甘油酯885、三辛酸甘油脂470、三丁酸甘油脂302、磷脂酰甘油740、二棕榈酰磷脂酰甘油745、二油酰磷脂酰胆碱786、二油酰磷脂酰乙醇胺744、磷脂酰肌醇859、二棕榈酸酰磷脂酰丝氨酸733、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱678、磷脂酰乙醇胺744，鞘磷脂731。

实施例中所用主要试剂的生产厂商如下：各种磷脂，Degussa；柠檬酸，中国医药集团上海化学试剂公司；胆固醇，国药集团化学试剂有限公司；三酸甘油脂，广州化学试剂厂。实施例中所用的艾塞那肽样品购买于上海肽士生物科技有限公司。

药物包封率测定方法为：

精密量取脂质体混悬液1mL至5mL量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀，得稀释液。精密量取稀释液1mL至5mL量瓶中，加Triton X-100(10wt％)至刻度，超声15分钟，测定混悬液中的艾塞那肽的浓度；另取稀释液适量，400×g离心5分钟分离上清液，精密量取上清液1mL至5mL量瓶中，加TritonX-100(10wt％)至刻度，超声15分钟，测定游离的艾塞那肽的浓度。按下列公式计算包封率：

包封率(％)＝(混悬液中艾塞那肽总量-游离艾塞那肽量)/混悬液中艾塞那肽总量＊100。

Zeta电位测定方法为：

取多囊脂质体混悬液适量，加生理盐水稀释，用ZW380型粒度仪(PCS，光子相关光谱技术)测定。

实施例1

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有19.8mM(14.85mg)卵磷脂，4.2mM(3.13mg)二棕榈酰磷脂酰甘油，30mM(11.61mg)胆固醇和3.75mM(3.32mg)三油酸甘油酯的氯仿溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽1mg，20mM(4.20mg)柠檬酸和2.5％(25mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和1％(50mg)PVA的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和1％(50mg)PVA的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干氯仿，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：向锥形瓶内加入5倍量的生理盐水混合均匀，然后600×g离心10分钟。弃上清液，并将沉淀物再分散于5mL生理盐水中，再离心沉淀，如此循环操作3次，富集沉淀，得艾塞那肽多囊脂质体成品。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为89.56％；zeta电位为负38.6mV。

实施例2

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有5mM(3.96mg)氢化大豆磷脂，0.5mM(0.38mg)二棕榈酸磷脂酰丝氨酸，10mM(3.87mg)胆固醇和0.155mM(0.073mg)三辛酸甘油酯的氯仿-乙醚(体积比1∶1)溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽5mg，20mM(2.10mg)柠檬酸和6％(30mg)蔗糖的水溶液的内水相0.5mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将7.5mL含有5.4％(w/v)(405mg)葡萄糖和1％(75mg)明胶的外水相溶液置于初乳层上，然后以4500rpm的速度混合40秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有9mL含有5.4％(w/v)(486mg)葡萄糖和1％(90mg)明胶的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干有机溶剂，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为75.32％；zeta电位为负44mV。

实施例3

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有100mM(75mg)卵磷脂，20mM(8.49mg)磷脂酸，10mM(3.87mg)胆固醇和13mM(11.51mg)三油酸甘油酯的二氯甲烷溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽2.5mg，100mM(21.01mg)柠檬酸的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将20mL含有6％(w/v)(1200mg)葡萄糖和1％(200mg)羟甲基淀粉的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有6％(w/v)(300mg)葡萄糖和1％(50mg)羟甲基淀粉的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干二氯甲烷，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为85.3％；zeta电位为负52mV。

实施例4

步骤1：在干净的玻璃容器中加入0.5mL含有25mM(9.83mg)二棕榈酰磷脂酰胆碱，10mM(8.59mg)磷脂酰肌醇，5mM(0.97mg)胆固醇、1.2mM(0.53mg)三油酸甘油酯和1.2mM(0.28mg)三辛酸甘油酯的氯仿-乙醚(体积比1∶1)溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽10mg，20mM(2.10mg)柠檬酸和3.2％(16mg)蔗糖的水溶液的内水相0.5mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将2.5mL含有5.4％(w/v)(135mg)葡萄糖和5％(125mg)羟乙基淀粉的外水相溶液置于初乳层上，然后以7500rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有2.5mL含有8％(w/v)(200mg)葡萄糖和5％(125mg)羟乙基淀粉的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干有机溶剂，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为91.95％；zeta电位为负51.79mV。

实施例5

步骤1：在干净的玻璃容器中加入2mL含有50mM(75mg)大豆磷脂，5mM(2.7mg)硬脂胺，50mM(38.7mg)胆固醇和8.4mM(7.9mg)三辛酸甘油酯的氯仿溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽5mg，50mM(5.20mg)柠檬酸和1％(5mg)蔗糖的水溶液的内水相0.5mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以13,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将2.5mL含有2.5％(w/v)(62.5mg)葡萄糖和3％(75mg)右旋糖酐的外水相溶液置于初乳层上，然后以7500rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有20mL含有2.5％(w/v)(500mg)葡萄糖和3％(600mg)右旋糖酐的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干氯仿，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为90.4％；zeta电位为负38.1mV。

实施例6

步骤1：在干净的玻璃容器中加入0.5mL含有5mM(1.97mg)二油酰磷脂酰胆碱，1mM(0.73mg)二棕榈酰磷脂酰丝氨酸，0.625mM(0.12mg)胆固醇和0.27mM(0.16mg)大豆油的氯仿-乙醚(体积比1∶1)溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽1mg，10mM(1.05mg)柠檬酸和3.2％(16mg)蔗糖的水溶液的内水相0.5mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以13,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有3.5％(w/v)(175mg)葡萄糖和3％(150mg)聚乙烯吡咯烷酮的外水相溶液置于初乳层上，然后以7500rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有3.5％(w/v)(175mg)葡萄糖和3％(150mg)聚乙烯吡咯烷酮的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干有机溶剂，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为91.63％；zeta电位为负29.4mV。

实施例7

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有20mM(15mg)卵磷脂，20mM(7.74mg)胆固醇和2.4mM(1.45mg)三丁酸甘油酯的氯仿溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽5mg，50mM(10.51mg)柠檬酸和2.5％(25mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和0.5％(25mg)海藻酸钠的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和0.5％(25mg)海藻酸钠的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干氯仿，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为77.24％；zeta电位为负19mV。

实施例8

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有3mM(2mg)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，2mM(1.49mg)磷脂酰乙醇胺，9mM(7.9mg)胆固醇和1mM(0.89mg)三油酸甘油酯的环己烷溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽0.5mg，120mM盐酸和2.5％(25mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和40mM甘氨酸的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和40mM甘氨酸的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干环己烷，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为54.31％；zeta电位为负39.7mV。

实施例9

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有45mM(33.5mg)二油酰磷脂酰乙醇胺，40mM(30mg)脑磷脂，9mM(3.5mg)胆固醇和5mM(4.4mg)三油酸甘油酯的氯代甲醚溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽1mg，50mM(10.4mg)柠檬酸和3.2％(32mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和40mM组氨酸的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和40mM组氨酸的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干氯代甲醚，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为38.99％；zeta电位为负45mV。

实施例10

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有20mM(14.6mg)鞘磷脂，10mM(7.4mg)磷脂酰甘油，50mM(19.3mg)胆固醇和2mM(1.77mg)三油酸甘油酯的乙酸乙酯溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽2.5mg，20mM(4.2mg)柠檬酸和2.5％(25mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和40mM赖氨酸的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和40mM赖氨酸的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干乙酸乙酯，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为12.57％；zeta电位为负53.2mV。

实施例11

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有10mM(7.3mg)氢化大豆磷脂，2mM(1.49mg)二棕榈酰磷脂酰甘油，1mM(0.386mg)胆固醇和1mM(0.885mg)三油酸甘油酯的氯仿溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽0.05mg，20mM(4.2mg)柠檬酸和2.5％(25mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和1％(50mg)羟乙基淀粉的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和1％(50mg)羟乙基淀粉的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干氯仿，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：同实施例1。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为98.36％；zeta电位为负55mV。

实施例12

步骤1：在干净的玻璃容器中加入1mL含有10mM(7.3mg)氢化大豆磷脂，2mM(1.49mg)二棕榈酰磷脂酰甘油，1mM(0.386mg)胆固醇和1mM(0.885mg)三油酸甘油酯的氯仿溶液。该溶液称为脂质相。

步骤2：将溶解有艾塞那肽10mg，20mM(4.20mg)柠檬酸和2.5％(25mg)蔗糖的水溶液的内水相1mL加入上述盛有脂质相的玻璃容器中，用高速剪切机以10,000rpm的速度搅拌10分钟，得W/O型初乳。

步骤3：将5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和2％(50mg)羟乙基淀粉的外水相溶液置于初乳层上，然后以10,000rpm的速度混合10秒钟，得W/O/W型复乳。

步骤4：将复乳转移至盛有5mL含有5.4％(w/v)(270mg)葡萄糖和2％(50mg)羟乙基淀粉的250mL锥形瓶中，37℃恒温水浴，使8L/min的氮气流通过锥形瓶中的悬液，15分钟后缓慢挥干氯仿，得艾塞那肽多囊脂质体初品。

步骤5：向锥形瓶内加入5倍量的生理盐水混合均匀，然后600×g离心10分钟。弃上清液，并将沉淀物再分散于5mL生理盐水中，再离心沉淀，如此循环操作3次，富集沉淀，得艾塞那肽多囊脂质体成品。

测得艾塞那肽多囊脂质体的粒径为5～50μm；包封率为81.64％；zeta电位为负52.5mV。

下面通过试验例来进一步说明本发明的有益效果。

试验实施例1

艾塞那肽多囊脂质体的药效学实验

将体重180-200g的SD大鼠(雄)若干，随机分成5组，每组8只。A组为空白对照组，B组为模型对照组，C组为艾塞那肽水溶液实验组一，D组为艾塞那肽水溶液实验组二，E组为艾塞那肽多囊脂质体实验组。A组、B组每天颈背部皮下注射生理盐水2次，早晚各一次；C组每天颈背部皮下注射艾塞那肽水溶液2次，每次给药剂量为3μg·Kg^-1，早晚各一次；D组颈背部一次性皮下注射艾塞那肽水溶液，每次给药剂量为3μg·Kg^-1，七天一次；E组颈背部一次性皮下注射艾塞那肽多囊脂质体混悬液(实施例1制备)，每次给药剂量为42μg·Kg^-1。B、C、D、E组从实验开始的第1天每天腹腔注射STZ 30mg/kg(0.1mol·L^-1柠檬酸缓冲液配置，pH4.5)，连续7天，注射STZ前小鼠禁食12h。

实验开始的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16天早上在注射艾塞那肽水溶液或艾塞纳肽多囊脂质体混悬液之前测定大鼠血糖，测量之前大鼠禁食12h，眼内龇取血，用葡萄糖试剂盒进行血糖测定，观察小鼠16d之内的血糖变化情况。

结果见图1。试验结果表明，每七天注射一次艾塞那肽多囊脂质体的大鼠血糖浓度水平与每天注射两次艾塞那肽溶液相当，证明艾塞那肽多囊脂质体具有显著的缓释效果，可大大减少艾塞那肽的给药次数，提高患者顺应性。

试验实施例2

取艾塞那肽多囊脂质体混悬液(实施例1制备)，分别移取1mL(平行3份)于透析袋内(5.0cm×2.5cm)，置于含有0.01mol/L等渗PBS 10、25、50mL的广口瓶内，于37℃、100r/min的恒温振荡仪中进行释放实验，分别于0、1、6、18、24、48、72、96、120、168h取样1mL，补加等量等渗PBS。样品用microBCA法测定。

结果见图2。试验结果表明艾塞那肽多囊脂质体在体外能持续释放160个小时以上，缓释效果明显。

Claims (7)

1.一种含有艾塞那肽的多囊脂质体，其特征在于，包括下列重量份的各组分：艾塞那肽1份、脂质成分0.1～200份、pH调节剂0.2～10份、渗透压调节剂13～590份和辅助乳化剂5～150份，其中所述的脂质成分包括重量比为0.4∶1～19∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％的三酸甘油酯；所述的中性磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂、磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种；所述的三酸甘油酯选自三辛脂、三丁脂、大豆油、猪油脂和牛油脂中的一种或几种；所述的辅助乳化剂选自赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、聚乙烯醇、右旋糖酐、羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、明胶、海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的多囊脂质体，其特征在于，所述的含有艾塞那肽的多囊脂质体中药脂比是1∶5～1∶40，所述的“药脂比”是指药物活性成分艾塞那肽与多囊脂质体中的脂质成分的质量比。

3.如权利要求1所述的多囊脂质体，其特征在于，所述的脂质成分中还含有负电荷磷脂或者脂肪胺。

4.如权利要求3所述的多囊脂质体，其特征在于，所述的负电荷磷脂选自磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、磷脂酸二棕榈酰磷脂酸和二硬脂酰磷脂酸中的一种或几种，所述的脂肪胺为硬脂胺。

5.一种权利要求1～4任一项所述的艾塞纳肽多囊脂质体的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

①将脂质成分溶于有机溶剂中，以作为脂质相，其中该脂质成分包括重量比为0.4∶1～19∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为1～9％的三酸甘油酯，该中性磷脂在脂质相中的浓度为5～150mg/ml；所述的中性磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂、磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种；所述的三酸甘油酯选自三辛脂、三丁脂、大豆油、猪油脂和牛油脂中的一种或几种；

②将艾塞纳肽溶于含pH调节剂和渗透压调节剂的水溶液中，以作为内水相；

③将所述内水相加入脂质相上层，混合乳化制得油包水型(W/O)初乳；

④将外水相加入所述油包水型初乳的上层，搅拌形成水包油包水(W/O/W)型复乳，其中外水相中含有辅助乳化剂和渗透压调节剂；所述的辅助乳化剂选自赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、聚乙烯醇、右旋糖酐、羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、明胶、海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种；

⑤除去步骤④得到的复乳中的有机溶剂而制得艾塞纳肽多囊脂质体初品；

⑥用等渗溶液洗涤所述艾塞那肽多囊脂质体初品，再分散于等渗溶液中，制得艾塞那肽多囊脂质体成品。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤①中，所述的有机溶剂选自乙醚、氯仿、二氯甲烷、环己烷、氯代甲醚和乙酸乙酯中的一种或几种；

步骤②中，艾塞那肽的用量为0.05～20mg/ml；所述的渗透压调节剂浓度为＞0g/100mL，且≤6g/100mL；pH调节剂的浓度为10～120mM；

步骤③中，所述的内水相和脂质相的体积比为1∶1～1∶4；

步骤④中，所述的油包水型初乳和外水相的体积比为1∶1～1∶10；所述的辅助乳化剂的浓度为0.5％～5％(wt)；渗透压调节剂的浓度为＞0g/100mL，且≤6g/100mL。

7.如权利要求1～4任一项所述的含有艾塞那肽的多囊脂质体在制备治疗或预防2型糖尿病的药物中的应用。

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