CN106924715A - 特利加压素脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，特别涉及特利加压素脂质体及其制备方法。本发明提供了一种特利加压素脂质体，其内水相的pH值为7.9～8.9。使用该脂质体制剂解决了药物作用时间短的缺点。特利加压素等电点偏碱性，通过调节脂质体内部pH值，使内部pH呈弱碱性，药物在弱碱性条件下沉积，药物能够缓慢释放，从而达到更好的缓释效果。本发明提供的脂质体后可以维持较长作用时间，血药浓度平稳，不良反应发生率低。

Description

特利加压素脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及特利加压素脂质体及其制备方法。

背景技术

特利加压素为三甘氨酰基赖氨酸加压素醋酸盐，是一种新型人工合成的血管加压素类似物。二十世界八十年代初由瑞典辉凌公司生产上市，为加压素的前体药物，在注射入血液后分子中的甘氨酰基被酶催化水解而产生持续低水平的加压素。其化学名称为N-α-三甘氨酰-8-赖氨酸-加压素，其结构如式Ⅰ所示：

主要用于肝硬化静脉曲张出血的止血，现临床广泛应用于肝肾综合征、肝硬化腹水、感染性休克、烧伤、急性肝功能衰竭、心脏骤停等的治疗。目前市场上的翰唯，起始注射用量为2mg。每1mg注射粉针剂用5ml氯化钠注射液溶解，缓慢进行静脉注射(超过1分钟)，同时对血压及心率观测。维持剂量为每4小时静脉给药1-2mg，延续24-36小时，直至出血得到控制。

蛋白多肽类药物分子质量大，稳定性差，生物利用度低，体内生物半衰期短，极易被生物体内的酶分解等缺点，使他们在治疗学领域的应用受到局限。由于特利加压素半衰期短，现有技术通过把药物制备成长循环脂质体，克服普通注射剂，但是普通脂质体在体内作用时间较短。因此提供一种特利加压素脂质体及其制备方法，以延长其半衰期，提高缓释效果具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种特利加压素脂质体及其制备方法。本发明提供的脂质体通过调节处方可以获得释放更为缓慢的处方，延长在体内外作用时间。实验发现由于特利加压素等电点偏碱性，通过调节脂质体内部PH，使内部PH呈弱碱性，药物在弱碱性条件下沉积，药物能够缓慢释放，从而达到更好的缓释效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种特利加压素脂质体，其内水相的pH值为7.9～8.9。

在脂质体中，必要成分磷脂和特利加压素是在水相中形成磷脂双层从而构成脂质体的，本发明中，对构成水相的溶液不加特别限制，例如可以采用等渗或者非等渗的药物成分的水溶液、缓冲液、生理盐水、葡萄糖水溶液等。水溶液中也可以加入其它生理活性物质如氨基酸、维生素等。均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素脂质体的内水相和/或外水相包括单糖、低聚糖、水溶性多糖、二元醇、小分子多元醇、高分子多元醇、有机酸、氨基酸、PBS磷酸缓冲盐溶液、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、硫酸铵中的一种或两者以上的混合物。

磷脂是构成脂质体脂质双层的必须物质，是完成本发明目的的必须成分。作为用来形成脂质体的磷脂类物质，只要可以形成脂质双层，可以使用任何天然或者合成的磷脂类物质，也可以使用一种磷脂类物质或者多种磷脂类物质的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素脂质体的脂质包括磷脂，所述磷脂为PEG化磷脂(DSPE-PEG，PEG-PE)中的一种或两者以上的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素脂质体的所述单糖选自赤藓糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或果糖；

所述低聚糖选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、麦芽三塘和环糊精；

所述水溶性多糖选自水溶性糊精、纤维素或淀粉的衍生物；

所述二元醇、所述小分子多元醇选自乙二醇、丙二醇、甘油、木糖醇、山梨醇或甘露醇中的一种或两者以上的混合物；

所述高分子多元醇为聚乙二醇或其可药用的衍生物、聚乙烯醇。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素脂质体中所述所述PEG化磷脂(DSPE-PEG)为磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物中的一种或两者以上的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素脂质体中所述PEG化磷脂(DSPE-PEG)选自DSPE-PEG-2000，DSPE-PEG-5000，DSPE-PEG1000-NHS，PEG-PE。均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素与所述脂质的质量比为1:(10～100)。优选1:(10～30)。

在本发明的一些具体实施方案中中脂质还包括胆固醇；所述胆固醇与所述磷脂的质量比为1:(1～10)。优选1:(1～3)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特利加压素脂质体的有机相中所述磷脂在有机溶剂中的浓度为10～100mg/mL；所述有机溶剂选自氯仿、丙酮、氯仿或乙醚。优选氯仿或乙醚。

在本发明中，PBS磷酸盐缓冲液，其成分包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，磷酸氢二钾合磷酸二氢钾。

本发明还提供了所述特利加压素脂质体，包括如下步骤：

制备获得含有特利加压素的水相，调整pH值为7.9～8.9；

制备获得含有脂质的有机相；

取所述水相与所述有机相混合，制备获得W/O初乳，干燥，纯化。

在本发明的一些具体实施方案中，制备获得W/O初乳的方法包括超声、高速分散、乳匀机、喷嘴雾化等方法。实验室制备常采用高速分散器或涡旋混合器乳化；W/O初乳在旋转蒸发器上干燥，除去有机溶剂，加入适于储存和生理上可以接受的盐溶液，除去脂质体中游离药物，有凝胶过滤法，透析法，超速离心法，超滤法，微柱离心法等。最后通过超滤或透析膜除去脂质体中的游离药物。

脂质体是由磷脂和其它两亲性物质分散于水中，由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体。最早由Rahman等人将脂质体作为药物载体应用。脂质体常用制备方法主要有薄膜分散法，反相蒸发法，注入法，超声波分散等，但是对于蛋白多肽，要获得较高的包封率，逆向蒸发法可以获得较高的包封率，薄膜分散法等。

反相蒸发法最初由Szoka提出，制备方法主要将磷脂等膜材溶于有机溶剂中，短时超声振荡，直至形成稳定的W/O乳液，然后减压蒸发除掉有机溶剂，达到胶态后，滴加缓冲盐，旋转蒸发使器壁上的凝胶脱落，然后在减压下继续蒸发，制得水性混悬液，除去未包入的药物，即得大单层脂质体。此法可包裹较大的水容积，一般适用于包封水溶性药物，大分子生物活性物质等。

本发明提供的脂质体，磷脂可以选择，，PEG化磷脂(DSPE-PEG)如磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物等或其组合，内水相/外水相可以选择蔗糖，甘露醇，乳糖，山梨醇，葡萄糖，柠檬酸，氯化钠，精氨酸，赖氨酸，PBS缓冲盐等；还可以选择性加入或不加调节脂质体磷脂双分子层膜流动性的胆固醇。

普通脂质体进入循环系统后，未经修饰的脂质体大部分运转至肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统(MPS)丰富的部位，少量被肺，骨髓及肾摄取；而肝细胞膜受体对直接暴露于表面的磷脂负电基进行识别，因而首先被肝细胞吞噬，因此大部分脂质体在到达靶部位之前已被吞噬，无法在靶部位达到有效的治疗浓度。聚乙二醇的加入可有效改善这一问题。长循环脂质体由于表面PEG层的存在，可增强脂质体膜的亲水性，减少血浆蛋白与脂质体膜的相互作用，阻止脂质体的凝聚说融合，可在一定程度上避免网状内皮系统对脂质体的摄取，使得脂质体在体内具有较长的半衰期。阿霉素长循环脂质体得以发展的基础正是PEG化长循环脂质体的应用。由于脂质体的组成中含有PEG-DSPE，作用是阻止血浆蛋白吸附于脂质体的表面，从而减少MPS的摄取。

本发明提供了一种特利加压素脂质体，其内水相的pH值为7.9～8.9。使用该脂质体制剂解决了药物作用时间短的缺点。特利加压素等电点偏碱性，通过调节脂质体内部pH值，使内部pH呈弱碱性，药物在弱碱性条件下沉积，药物能够缓慢释放，从而达到更好的缓释效果。

本发明提供的脂质体后可以维持较长作用时间，血药浓度平稳，不良反应发生率低。

具体实施方式

本发明公开了一种特利加压素脂质体及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明旨在提供一种能有效延长特利加压素在体内释放时间的脂质体，该组合物含有活性成分特利加压素，通过选择合适的处方和工艺获得适合病人需求的组合物。

本发明提供的脂质体，磷脂可以选择等或其组合；PEG化磷脂(DSPE-PEG)如磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物等或其组合，如DSPE-PEG-2000，DSPE-PEG-5000，DSPE-PEG1000-NHS等；内水相/外水相可以选择蔗糖，甘露醇，乳糖，山梨醇，葡萄糖，柠檬酸，氯化钠，精氨酸，赖氨酸，PBS缓冲盐，氢氧化钠，碳酸氢钠，碳酸钠，硫酸胺等；还可以选择性加入或不加调节脂质体磷脂双分子层膜流动性的胆固醇。

在一些实施例中，本发明提供的脂质体处方，药脂比从1：10到1：100，特别优选的是1：10到1：30；胆固醇与磷脂的质量比为1：10到1：1，特别优选的是1：3到1：1；磷脂在有机溶剂中的用量为10mg/ml到100mg/ml；有机溶剂可以使用氯仿，丙酮，氯仿，乙醚等，优选的是氯仿，乙醚或其组合。

主要通过以下技术放案实现：

制备工艺过程一般包括：含有药物的水相与脂质的有机相混合制备W/O初乳，有机相中的有机溶剂一般采用易挥发的溶剂，通常为氯仿或氯仿与乙醚的混合液。脂质为磷脂、胆固醇等。制备初乳的方法可以从制备乳剂的方法中选择，包括超声、高速分散、乳匀机、喷嘴雾化等方法。实验室制备常采用高速分散器或涡旋混合器乳化；W/O初乳在旋转蒸发器上干燥，除去有机溶剂，加入适于储存和生理上可以接受的盐溶液，除去脂质体中游离药物，注意有凝胶过滤法，透析法，超速离心法，超滤法，微柱离心法等。

最后通过超滤或透析膜除去脂质体中的游离药物。

本发明提供了一种特利加压素脂质体，其内水相的pH值为7.9～8.9。使用该脂质体制剂解决了药物作用时间短的缺点。特利加压素等电点偏碱性，通过调节脂质体内部pH值，使内部pH呈弱碱性，药物在弱碱性条件下沉积，药物能够缓慢释放，从而达到更好的缓释效果。本发明提供的脂质体后可以维持较长作用时间，血药浓度平稳，不良反应发生率低。

缩写及英文对应的含义请见表1：

表1缩写及英文含义

缩写及英文	含义
		DSPE-PEG	二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇
PEG-PE	磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇
		HSPC	氢化磷脂
SPC	大豆磷脂

本发明提供的特利加压素脂质体及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

将药物特利加压素500mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相；

DSPE-PEG20002g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；

加入水相，由碳酸氢钠与氢氧化钠配制得pH在8.0之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

实施例2：

将药物特利加压素5mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相；

PEG-PE 2g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；

加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠，蔗糖配制的pH在8.4～8.5之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

实施例3：

将药物特利加压素5mg溶于20mL水相中得到水相；

DSPE-PEG20002g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；

加入水相，由碳酸钠与柠檬酸配制的pH在7.9～8.0之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

实施例4：

将药物特利加压素5mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相；

DSPE-PEG20002g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；

加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠配制的pH在8.8～8.9之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

实施例5：

将药物特利加压素5mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相；DSPE-PEG20002g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；

加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠配制得pH在8.0～8.5之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

对比例1：

将药物特利加压素5mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相，DSPE-PEG20002g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相，加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠配制得pH在7.0～7.1之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

对比例2：

将药物特利加压素5mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相，DSPE-PEG20002g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相，加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠配制的pH在10.2～10.3之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

对比例3：

将药物特利加压素50mg溶于30mL水相中得到含有活性成分的水相；

大豆磷脂3g、胆固醇3g溶于氯仿-乙醚(1：1)30mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；

加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠配制得pH在7.5之间，涡旋得到粗略的脂质体，先通过均质机缩小粒径，使用超滤法除去游离的水相，再通过0.22μm的滤膜，即得到药物的脂质体溶液。

对比例4：

将药物特利加压素300mg溶于20mL水相中得到含有活性成分的水相；

氢化磷脂3g、胆固醇1g溶于氯仿20mL(油相)中，置圆底烧瓶中，旋转蒸发除去有机相；加入水相，由硫酸铵与氢氧化钠配制得pH在9.2之间，涡旋得到粗略的脂质体，先均质再通过0.22μm的滤膜，使用透析膜法除去游离的水相，即得到药物的脂质体溶液。

实施例10：药物释放度的检测

取得到的脂质体置于具塞试管中，加入4ml含0.01％NaN3的人血浆，固定于溶出仪的搅拌浆上并浸入溶出杯的水液中，水液温度保持37℃，搅拌浆100rpm转动。于设定的时间取样0.5ml，所得样品加入4.5ml生理盐水，10000*g离心10min，弃去上清液，沉淀溶于适量酸化甲醇中，过滤后，HPLC测定，即得各时间点脂质体中未释放的药物量，以下式计算各个时间点的药物释放百分数：

药物释放(％)＝(包封于脂质体中的总药物量-未释放的药物量)/包封于脂质体中的药物量×100％。检测结果见表2：

表2：不同实施例制备的样品的释放度

结论：从表1可以看出使用DSPE-PEG，氢化磷脂，大豆磷脂制备的脂质体释放时间依次缩短，氢化磷脂刚性交普通磷脂强，药物不容易从囊中泄露有关，而DSPE-PEG相对较长，可能与DSPE-PEG是两亲型聚合物，在脂质体表面交错覆盖成致密的构象云，形成较厚的立体位阻层从而比较稳定有关，而在脂质体内水相呈弱碱性条件下，脂质体释放时间更加延长，从实施例1-5说明只有内水相的pH值在一定范围内才有较好的缓释效果，对比实施例1与2可以发现内水相的pH值为7.9～8.9之间具有较好的缓释效果。证明了发明者的思路，即由于特利加压素本身呈碱性，内水相呈碱性，药物呈沉淀沉降，从而缓慢释放。

实施例11：体内血药浓度的测定

体内血药浓度：取大鼠108只，随机分成9组，每组各12只，分别静脉注射给予按实施例1～5、对比例1～4样品，然后在给药后分别于0.5d，1d，2d，4d，8d采血，体外肝素抗凝，以8000r.min_- ¹离心血浆，低温保存。

取血浆至离心管中，加入甲醇沉淀蛋白，涡旋混合后离心，将上清液用乙腈溶剂后，进样，用HPLC测定血药浓度。结果见表3:

表3：不同样品的大鼠体内动物数据

从表3结果可以看出，实施例1样品在大鼠体内的达峰时间(2d)相对实施例4(4d)较短，实施例2的血药浓度较为平缓，即实施例2释放时间较长，提示在实施例2中加入通过调节PH具有一定的阻碍活性成分迁移的作用，从而达峰浓度较低，释放时间更长，即有缓释释放效果。对比例3和对比例4也证明了氢化磷脂较普通磷脂有相对较长的释放时间，但均较DSPE-PEG较快，实施例1-5说明只有内水相的pH值在为7.9～8.9之间具有较好的缓释效果，对比实施例1与2也佐证了这个发明。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种特利加压素脂质体，其特征在于，其内水相的pH值为7.9～8.9。

2.根据权利要求1所述的特利加压素脂质体，其特征在于，其内水相和/或外水相包括单糖、低聚糖、水溶性多糖、二元醇、小分子多元醇、高分子多元醇、有机酸、氨基酸、PBS磷酸缓冲盐溶液、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、硫酸铵中的一种或两者以上的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的特利加压素脂质体，其特征在于，其脂质包括磷脂，所述磷脂为或PEG化磷脂中的一种或两者以上的混合物。

4.根据权利要求2或3所述的特利加压素脂质体，其特征在于，所述单糖选自赤藓糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或果糖；

所述低聚糖选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、麦芽三塘和环糊精；

所述水溶性多糖选自水溶性糊精、纤维素或淀粉的衍生物；

所述二元醇、所述小分子多元醇选自乙二醇、丙二醇、甘油、木糖醇、山梨醇或甘露醇中的一种或两者以上的混合物；

所述高分子多元醇为聚乙二醇或其可药用的衍生物、聚乙烯醇。

5.根据权利要求3或4所述的特利加压素脂质体，其特征在于，所述磷脂选自；

PEG化磷脂为磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物中的一种或两者以上的混合物。

6.根据权利要求3至5任一项所述的特利加压素脂质体，其特征在于，所述PEG化磷脂选自DSPE-PEG-2000，DSPE-PEG-5000，DSPE-PEG1000-NHS。

7.根据权利要求3至6任一项所述的特利加压素脂质体，其特征在于，所述特利加压素与所述脂质的质量比为1:(10～100)。

8.根据权利要求3至7任一项所述特利加压素脂质体，其特征在于，所述脂质还包括胆固醇；所述胆固醇与所述磷脂的质量比为1:(1～10)。

9.根据权利要求3至8任一项所述的特利加压素脂质体，其特征在于，其有机相中所述磷脂在有机溶剂中的浓度为10～100mg/mL；所述有机溶剂选自氯仿、丙酮、氯仿或乙醚。

10.根据权利要求1至9任一项所述的特利加压素脂质体，其特征在于，包括如下步骤：

制备获得含有特利加压素的水相，调整pH值为7.9～8.9；

制备获得含有脂质的有机相；

取所述水相与所述有机相混合，制备获得W/O初乳，干燥，纯化。