CN114457001B - 一种支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种支架材料及其制备方法和应用，属于组织工程技术领域。支架材料的制备方法包括如下步骤：将光敏水凝胶单体溶液和光引发剂混合，形成预聚液，将预聚液加热至温敏水凝胶的凝胶化温度，将温敏水凝胶成型产物浸没于预聚液中，进行光固化反应，得到包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物，将温敏水凝胶成型产物排出，得到具有三维孔道结构的支架材料。本发明的支架材料制备方法可制备出根据细胞空间分布需求定制的复杂三维孔道结构的支架材料，且解决了利用光敏水凝胶构建三维立体细胞培养体系时，细胞在紫外光固化过程中容易受到紫外光照的影响而失活甚至死亡的问题。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，更具体地，涉及一种支架材料及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶为一类由高度溶胀的多孔聚合物网络组成的柔软三维含水结构，可以使负载的细胞和周围组织的营养物质进行高效交换，同时，模拟体内细胞外基质微环境，促进细胞识别和组织整合，因此，水凝胶常被用来作为支架材料应用于细胞三维立体培养中。
目前，常见的是甲基丙烯酸基水凝胶，甲基丙烯酸基水凝胶为一类甲基丙烯酸酐修饰的光敏水凝胶单体溶液经光固化而形成的光敏水凝胶。在实际应用中，常将光敏水凝胶单体溶液与细胞悬浮液和光引发剂混合，然后进行紫外光照射发生光固化反应，使得光敏水凝胶原液固化形成包裹细胞的光敏水凝胶，之后将该光敏水凝胶浸入到培养基中进行培养。然而，该方法存在一个致命的缺点：在紫外光固化过程中，细胞容易受到光照的影响而失活甚至死亡。
现有技术公开了一种可用于构建多种细胞有限接触三维共培养体系的非匀质水凝胶，其非匀质水凝胶包括凝胶化的连续相和分布在所述连续相中的凝胶微球，制备方法为先将凝胶材料的水溶液分散于油性溶液中，经乳化和凝胶化处理，得到凝胶微球；再将所述凝胶微球与凝胶材料构建成非匀质水凝胶。其负载细胞培养的操作也是进行凝胶化处理前向混合溶液中加入细胞，混匀后再进行凝胶化处理，可以制得包载了细胞的非匀质水凝胶。因此，同样无法解决凝胶和化过程中细胞的失活甚至死亡问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有应用于细胞三维立体培养的支架材料的制备方法容易导致细胞的失活甚至死亡的缺陷和不足，提供一种支架材料的制备方法，其制备过程避免了细胞受到紫外光照辐射，避免了细胞三维立体培养过程中的细胞的失活甚至死亡。
本发明的另一目的在于提供一种上述支架材料的制备方法制备得到的支架材料。
本发明的再一目的在于提供一种支架材料在制备组织工程材料中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种支架材料的制备方法，包括如下步骤：
S1.将温敏水凝胶溶液固化、脱模，得到具有固定形状的温敏水凝胶成型产物；
S2.将光敏水凝胶单体和光引发剂在溶液中进行混合，形成预聚液；
S3.将预聚液加热至温敏水凝胶的凝胶化温度，将温敏水凝胶成型产物浸没于预聚液中，进行光固化反应，得到包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物；
S4.将包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物中的温敏水凝胶成型产物排出，得到具有三维孔道结构的支架材料。
在具体实施方式中，温敏水凝胶成型产物的制备方法可以具体操作如下：
提供温敏水凝胶溶液和模具，模具包括用于浇筑成型的腔体；
将温敏水凝胶溶液注入模具的腔体中，加热至温敏水凝胶的凝胶化温度进行固化，脱模，得到具有固定形状的温敏水凝胶成型产物。
S3步骤中为了方便温敏水凝胶成型产物液化后从光敏水凝胶成型产物中直接排出，温敏水凝胶成型产物浸没于预聚液中的具体操作可以为：
将温敏水凝胶成型产物置于反应容器中，并使得部分温敏水凝胶成型产物接触容器内壁，加入预聚液直至混合溶液完全浸没温敏水凝胶成型产物。
S4中从光敏水凝胶成型产物中将温敏水凝胶成型产物排出，形成具有三维孔道结构的支架材料，支架材料的三维孔道结构的形状与温敏水凝胶成型模具的腔体形状相同。
在本方案实际应用过程中，本发明的光引发剂可以为本领域的常规光引发剂，使得光敏水凝胶单体溶液在紫外光照或其他光照下能够发生光固化反应即可。例如光引发剂可以为光引发剂Irgacure 2959溶液，其在特定波长(365nm)的紫外光作用下引发单体在水溶液中聚合。
其中，需要说明的是：
本发明的支架材料的制备方法中，可以利用温敏凝胶的溶胶-凝胶可逆相变，制备根据细胞空间分布需求定制的具有复杂三维孔道结构的支架材料。在S1步骤中选择合适的模具即可得到结构适配的温敏水凝胶成型产物，通过S3步骤的光敏水凝胶成型产物包裹和S4步骤的再溶胶流出，即可制备得到定制的具有复杂三维孔道结构的支架材料。
本发明的支架材料应用于细胞培养的具体操作为：
将细胞悬浮液注入支架材料的三维孔道结构中，然后将整个支架材料浸没在生长培养基中，置于培养箱中培养，使得细胞在光敏水凝胶的三维孔道结构中生长，形成三维立体细胞培养体系。
相对于现有的支架材料在细胞三维立体培养中的应用，本发明的支架材料的制备过程中并未介入细胞成分，因此避免了紫外光固化过程中细胞容易受到光照的影响而失活甚至死亡，且可以很好地模拟体内细胞外基质微环境，促进细胞识别和组织整合。
优选地，S2中所述光敏水凝胶单体包括甲基丙烯酸酐修饰的细胞外基质组分和/或甲基丙烯酸酐修饰的生物多糖。
在具体实施方式中，所述光敏水凝胶单体可以为甲基丙烯酸酐化壳聚糖、甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化胶原蛋白、甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酸酐化硫酸软骨素和甲基丙烯酸酐化纤维素中的一种或几种。
在具体实施方式中，所述温敏水凝胶溶液为聚(N-异丙基丙烯酰胺)类温敏纳米凝胶分散在水中形成的溶液。
温敏水凝胶溶液为聚(N-异丙基丙烯酰胺)类温敏纳米凝胶分散在水中形成的溶液，温敏水凝胶溶液在温度低于温敏水凝胶的凝胶化温度时，为呈流体状的溶胶；温度高于等于温敏水凝胶的凝胶化温时，由溶胶转变为凝胶，呈固态。
温敏水凝胶与细胞/组织具有良好的生物相容性，可保证采用温敏水凝胶处理的支架材料具有良好的生物相容性，保证细胞活性以及粘附性。
在具体实施方式中，优选地，S2中所述预聚液中光敏水凝胶单体的浓度为50～200mg/mL，光引发剂的浓度为0.2～0.6w/v％。
其中，需要说明的是：
光引发剂的浓度单位为w/v％，其中w-表是光引发剂的质量为mg，v-表示预聚液的体积mL。
S2中单体浓度和光引发剂浓度的进一步优选可以促进在紫外光照下形成光敏凝胶高分子网络，促进光敏水凝胶单体完全反应，使反应更充分，尽量避免单体与引发剂的残留。
在具体实施方式中，优选地，S3中所述光固化的光源为6.9mW/cm2，360～480nm的紫外光源，聚合时间20～60s。
通过上述紫外光源可以促进单体与引发剂反应更加充分，固化时间太短紫外光能量无法激活光引发反应，通过紫外光源的波长和时间控制可以进一步提高反应效率。
优选地，S4所述温敏水凝胶成型产物的排出方法为将温敏水凝胶成型产物液化后从光敏水凝胶成型产物中排出。
其中，需要说明的是：
可以通过温度调整，使得包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物的温度低于温敏水凝胶的凝胶化温度，温敏水凝胶成型产物即可液化成温敏水凝胶溶液流出。
在具体实施方式中，S4中将该液化的温敏水凝胶成型产物从光敏水凝胶成型产物中排出的实现方式包括多种，例如可以：
利用磷酸盐缓冲液将温敏水凝胶溶液从光敏水凝胶成型产物中冲洗排出；
或利用虹吸效应将温敏水凝胶溶液从光敏水凝胶成型产物中排出，如将三维孔道一端放入水中，使得孔道内的温敏水凝胶溶液排出；
或在三维孔道孔径大到能克服溶液黏度，自然排出时，可通过调整光敏水凝胶成型产物的角度，即能使得温敏水凝胶溶液自然排出。
优选地，S1中所述温敏水凝胶溶液固化的模具为三维网络结构模具。
在具体实施方式中，本发明的带腔体的温敏水凝胶成型模具可为不锈钢模具、硅胶模具、玻璃模具等，其腔体形状可根据三维立体细胞培养体系中细胞空间分布需求进行灵活设计，腔体形状基本上呈现为三维网络结构。
本发明还具体保护一种上述支架材料的制备方法制备得到的支架材料。
上述支架材料在制备组织工程材料中的应用也在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的支架材料的制备方法利用温敏水凝胶的溶胶-凝胶可逆相变，可制备出根据细胞空间分布需求定制的具有复杂三维孔道结构的支架材料，满足了细胞三维培养支架材料的结构要求，且温敏水凝胶具有良好的生物相容性，对细胞无毒副作用。
本发明的支架材料的制备方法还巧妙的利用了温敏水凝胶和光敏水凝胶联合作用，得到了可用于细胞培养的具有特殊结构的光敏水凝胶支架材料，解决了利用光敏水凝胶构建三维立体细胞培养体系时，细胞在紫外光固化过程中容易受到紫外光照的影响而失活甚至死亡的问题。
本发明制备得到的支架材料中，细胞可粘附在光敏水凝胶表面，保证了良好的细胞黏附率。
附图说明
图1为实施例1的模具的结构示意图，虚线部分是腔体的轮廓。
图2为实施例1的温敏水凝胶成型产物。
图3为实施例1的具有三维孔道结构的支架材料，虚线部分是温敏水凝胶成型产物的轮廓。
图4为实施例3的模具的结构示意图，虚线部分是腔体的轮廓。
图5为实施例5的模具的结构示意图，虚线部分是腔体的轮廓。
图6为实施例2培养的神经元干细胞在电子显微镜下的生长形态。
图7为实施例4培养的成纤维细胞在电子显微镜下的生长形态。
图8为实施例6培养的人骨髓间充质干细胞在电子显微镜下的生长形态。
图9为神经元干细胞的细胞增殖效果。
图10为成纤维细胞的细胞增殖效果。
图11为人骨髓间充质干细胞的细胞增殖效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种支架材料的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、提供聚(NIP-co-NNP)作为温敏水凝胶，分散在水中，形成温敏水凝胶溶液；准备如图1所示的模具，模具包括：用于浇筑成型的腔体，图中虚线部分是腔体的轮廓；
将温敏水凝胶溶液注入模具的腔体中，加热至其凝胶化温度，温敏水凝胶溶液固化成型；
保持环境温度为其凝胶化温度并脱模，得到如图2所示的温敏水凝胶成型产物。
S2、提供甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)冻干粉，在室温下分散在水中，形成光敏水凝胶单体溶液；
称取Irgacure2959作为光引发剂，将光敏水凝胶单体溶液和光引发剂在室温下混合，形成预聚液，
预聚液中的GelMA浓度为60mg/mL，Irgacure2959的浓度为0.3w/v％，
光引发剂的浓度单位为w/v％，其中w-表是光引发剂的质量为mg，v-表示预聚液的体积mL；
S3、将预聚液温度调节至温敏凝胶凝胶化温度，然后向该预聚液中加入步骤S1制备的温敏水凝胶成型产物，并将该温敏水凝胶成型产物完全浸没在预聚液中，并使得部分温敏水凝胶成型产物接触容器内壁，在紫外光光源下(6.9mW/cm2，360～480nm)进行光固化反应20s，将反应产物从容器中剥离，得到包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物；
S4、降低光敏水凝胶成型产物的温度使其低于温敏水凝胶的凝胶化温度，温敏水凝胶发生液化，调整光敏水凝胶成型产物的角度，用磷酸盐缓冲液将温敏水凝胶溶液从光敏水凝胶成型产物中沿A→B的方向冲洗排出，形成具有三维孔道结构的支架材料，如图3所示，模具腔体的形状与支架材料的三维孔道结构的形状相同。
实施例2
本实施例利用实施例1制备的支架材料培养神经元干细胞，具体包括以下步骤：
(1)配制生长培养基：在Neurobasal培养基中加入2％B27细胞培养添加剂、2mMGlutamin谷氨酰胺、20ng/mL EGF表皮生长因子和20ng/mL bFGF碱性成纤维细胞生长因子；
(2)将NSCs神经球以4×106个细胞/mL悬浮于生长培养基中，形成细胞悬浮液；
(3)将实施例2步骤(b)制备的细胞悬浮液从实施例1制备的支架材料A端注入，然后将整个支架材料浸没在生长培养基中，置于37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，使得细胞在光敏水凝胶的三维孔道结构中生长，形成三维立体细胞培养体系。
实施例3
一种支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、提供聚(NIP-co-AA)作为温敏水凝胶，分散在水中，形成温敏水凝胶溶液；准备如图4所示的模具，模具包括：用于浇筑成型的腔体；
将温敏水凝胶溶液注入模具的腔体中，加热至其凝胶化温度，温敏水凝胶溶液固化成型，保持环境温度为其凝胶化温度脱模保存，得到温敏水凝胶成型产物；
S2、提供甲基丙烯酸酐化壳聚糖冻干粉，在常温下分散在水中，形成光敏水凝胶单体溶液，称取Irgacure2959作为光引发剂，将光敏水凝胶单体溶液和光引发剂在常温下混合，形成预聚液，
预聚液中甲基丙烯酸酐化壳聚糖的浓度为100mg/mL，Irgacure2959的浓度为0.4w/v％；
S3、将预聚液加热至温敏水凝胶的凝胶化温度，将步骤S1制备的温敏水凝胶成型产物置于容器中并使得部分温敏水凝胶成型产物接触容器内壁，然后向容器中倒入加热后的预聚液使其完全浸没温敏水凝胶成型产物，在紫外光光源下(6.9mW/cm2，360-480nm)进行光固化反应30s，将反应产物从容器中剥离，得到包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物；
S4、降低光敏水凝胶成型产物的温度使其低于温敏水凝胶的凝胶化温度，温敏水凝胶发生液化，调整光敏水凝胶成型产物的角度，用磷酸盐缓冲液将温敏水凝胶溶液从光敏水凝胶成型产物中冲洗排出，形成具有三维孔道结构的支架材料，模具腔体的形状与支架材料的三维孔道结构的形状相同。
实施例4
本实施例利用实施例3制备的支架材料培养成纤维细胞，具体包括以下步骤：
(1)配制生长培养基：
将DMEM培养基、胎牛血清FBS和Sodium Pyruvate丙酮酸钠按照84：15：1的体积比配成细胞生长培养基；
(2)将成纤维细胞以2×106个/mL的细胞密度悬浮于生长培养基中，形成细胞悬浮液；
(3)将步骤(2)制备的细胞悬浮液从实施例3制备的支架材料A端注入，然后整个支架材料浸没在生长培养基中，置于37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，使得细胞在光敏水凝胶成型产物的内三维孔道中贴壁生长，形成三维立体细胞培养体系。
实施例5
一种支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、提供聚(NIP-co-HEMA)作为温敏水凝胶，分散在水中，形成温敏水凝胶溶液；准备如图5所示的模具，模具包括：用于浇筑成型的腔体；
将温敏水凝胶溶液注入模具的腔体中，加热至其凝胶化温度，温敏水凝胶溶液固化成型，保持环境温度为其凝胶化温度脱模保存，得到温敏水凝胶成型产物；
S2、提供甲基丙烯酸酐修饰硫酸软骨素冻干粉，在常温下分散在水中，形成光敏水凝胶原液，称取Irgacure2959作为光引发剂，将光敏水凝胶原液和光引发剂在常温下混合，形成预聚液，预聚液中甲基丙烯酸酐修饰的硫酸软骨素的浓度为150mg/mL，Irgacure2959的浓度为0.5w/v％；
S3、将预聚液加热至温敏水凝胶的凝胶化温度，向该预聚液中加入步骤S1制备的温敏水凝胶成型产物，光敏凝胶预聚液需要完全浸没温敏水凝胶成型产物，并使得部分温敏水凝胶成型产物接触容器内壁，在紫外光光源下(6.9mW/cm2，360-480nm)进行光固化反应30s，将反应产物从容器中剥离，得到包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物；
S4、降低光敏水凝胶成型产物的温度使其低于凝胶化温度，温敏水凝胶发生液化，调整光敏水凝胶成型产物的角度，用磷酸盐缓冲液将温敏水凝胶溶液从光敏水凝胶成型产物中冲洗排出，形成具有三维孔道结构的支架材料，模具腔体的形状与支架材料的三维孔道结构的形状相同。
实施例6
本实施例利用实施例5制备的支架材料培养人骨髓间充质干细胞，具体包括以下步骤：
(1)配制生长培养基：
将α-MEM培养基和胎牛血清FBS按照9：1的体积比配成细胞生长培养基；
(2)将人骨髓间充质干细胞按照3×106个/mL的密度接种、悬浮于生长培养基中，形成细胞悬浮液；
(3)将本实施例步骤(2)制备的细胞悬浮液从实施例5制备的支架材料A端注入，然后整个支架材料浸没在生长培养基中，置于37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，使得细胞在光敏水凝胶内三维孔道中贴壁生长，形成三维立体细胞培养体系。
对比例1
本对比例采用GelMA(甲基丙烯酸化水凝胶)作为支架材料进行三维立体细胞培养，具体包括以下步骤：
(1)配制生长培养基：在Neurobasal培养基中加入2％B27细胞培养添加剂、2mMGlutamin谷氨酰胺、20ng/mL EGF表皮生长因子和20ng/mL bFGF碱性成纤维细胞生长因子；
(2)将NSCs神经球以4×106个细胞/mL悬浮于生长培养基中，形成细胞悬浮液；
(3)将GelMA、Irgacure2959在室温下分散在细胞悬浮液中，GelMA浓度为60mg/mL，Irgacure2959的浓度为0.3w/v％，在紫外光光源下(6.9mW/cm2，360-480nm)进行光固化反应20s，形成包裹细胞的光敏水凝胶；
(4)将光敏水凝胶浸入到培养基中，置于37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中悬浮培养。
对比例2
本对比例采用甲基丙烯酸酐化壳聚糖作为支架材料进行三维立体细胞培养，具体包括以下步骤：
1)配制生长培养基：将DMEM培养基、胎牛血清FBS和Sodium Pyruvate按照84：15：1的体积比配成细胞生长培养基；
2)将成纤维细胞以2×106个/mL的细胞密度悬浮于生长培养基中，形成细胞悬浮液；
3)将甲基丙烯酸酐化壳聚糖、Irgacure2959在室温下分散在细胞悬浮液中，甲基丙烯酸酐化壳聚糖浓度为100mg/mL，Irgacure2959的浓度为0.4w/v％，在紫外光光源下(6.9mW/cm2，360-480nm)进行光固化反应20s，形成包裹细胞的光敏水凝胶；
4)将光敏水凝胶浸入到培养基中，置于37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中悬浮培养。
对比例3
本对比例采用甲基丙烯酸酐化硫酸软骨素作为支架材料进行三维立体细胞培养，具体包括以下步骤：
1)配制生长培养基：将α-MEM培养基和胎牛血清FBS按照9：1的体积比配成细胞生长培养基；
2)将人骨髓间充质干细胞按照3×106个/mL的密度接种、悬浮于生长培养基中，形成细胞悬浮液；
3)将甲基丙烯酸酐化硫酸软骨素、Irgacure2959在室温下分散在细胞悬浮液中，甲基丙烯酸酐化硫酸软骨素浓度为150mg/mL，Irgacure2959的浓度为0.5w/v％，在紫外光光源下(6.9mW/cm2，360-480nm)进行光固化反应20s，形成包裹细胞的光敏水凝胶；
4)将光敏水凝胶浸入到培养基中，置于37℃饱和湿度、5％CO2培养箱中悬浮培养。
结果检测
(1)细胞生长状态
利用电子电子显微镜对培养5天后的细胞进行观察，具体从操作如下：
取实施例2、4、6培养5天的细胞置于电子显微镜下进行观察。
结果如图6～8所示，各细胞轮廓清楚、无空泡，生长形态良好，表明采用本申请提供的方法制备的支架材料对细胞生长不存在负面影响。
(2)细胞细胞增殖测定
采用CCK-8法进行细胞增殖测定，具体操作如下：
取实施例2、4、6和对比例1-3培养了5天的细胞作为样品，采用CCK-8法进行细胞增殖测定，图9～11是实施例2、4、6和对比例1-3的细胞计数结果，其中，阴性对照组为对应的细胞悬浮液。如结果所示，采用本申请实施例提供的方法构建三维立体细胞培养体系，避免了细胞受紫外光照影响，保证体系中的细胞具有良好的生长活力，有效促进细胞增殖。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将温敏水凝胶溶液固化、脱模，得到具有固定形状的温敏水凝胶成型产物；
S2.将光敏水凝胶单体和光引发剂在溶液中进行混合，形成预聚液；
S3.将预聚液加热至温敏水凝胶的凝胶化温度，将温敏水凝胶成型产物浸没于预聚液中，进行光固化反应，得到包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物；
S4.将包裹温敏水凝胶成型产物的光敏水凝胶成型产物中的温敏水凝胶成型产物排出，得到具有三维孔道结构的支架材料，
S1中所述温敏水凝胶溶液固化的模具为三维网络结构模具，
所述S2中所述光敏水凝胶单体包括甲基丙烯酸酐化壳聚糖、甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化胶原蛋白、甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酸酐化硫酸软骨素和甲基丙烯酸酐化纤维素中的一种或几种，
所述温敏水凝胶溶液为聚(N-异丙基丙烯酰胺)类温敏纳米凝胶分散在水中形成的溶液，
S2中所述预聚液中光敏水凝胶单体的浓度为50～200mg/mL，光引发剂的浓度为0.2～0.6w/v％，
S4所述温敏水凝胶成型产物的排出方法为将温敏水凝胶成型产物液化后从光敏水凝胶成型产物中排出。
2.如权利要求1所述支架材料的制备方法，其特征在于，S3中所述光固化的光源为6.9mW/cm2，360～480nm的紫外光源，聚合时间20～60s。
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