CN113528424A - 一种光敏生物材料多孔支架及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光敏生物材料多孔支架及其应用，将葡聚糖和光敏生物材料分别配置成水溶液，并按照一定的体积比例进行混合，使葡聚糖以液滴状分布在光敏生物材料溶液中；其中，光敏生物材料溶液的体积大于葡聚糖水溶液的体积；在光照条件下光敏生物材料聚合形成水凝胶，将水凝胶浸泡在水中去除葡聚糖得到光敏生物材料多孔支架。本发明所述光敏生物材料多孔支架不仅可以为细胞生长提供氧气以及营养物质，实现氧气及营养物质的快速交换，还可为细胞提供无应力束缚的生长空间，促进载入细胞的存活，保障细胞功能的实现。
Description
技术领域
本发明涉及生物和光动力学技术领域，具体涉及一种光敏生物材料多孔支架及其应用。
背景技术
现有技术中，将细胞与光敏生物材料结合主要包括两种方法：一种是将光敏材料固化成型后，再在材料表面接种细胞，这种方法虽然易于操作，但细胞大部分附着在材料表面，很难均匀地分布在材料中；而另一种方法，是先将细胞与光敏生物材料水溶液混合，再通过光照使光敏生物材料交联，从而使细胞包裹在光敏生物材料中。这种方法虽然可以使细胞均匀地包裹在光敏生物材料中，但这种方式形成的水凝胶结构具有非常致密的网络结构，这种结构会严重限制水凝胶内外氧气以及各种营养物质的交换，导致处于网络结构中的细胞难以获得足够的氧气以及营养物质，从而影响细胞正常生长和发育；并且，这种水凝胶网络结构在形成过程中会对其包裹的细胞产生强大的应力，导致细胞的生长受到应力束缚，进而影响细胞的存活以及功能。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种光敏生物材料多孔支架，以解决现有技术中光敏基团在成型过程中会对细胞生长造成不良影响的问题。
进一步，本发明还提供所述光敏生物材料多孔支架通过生物3D打印搭载细胞的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种光敏生物材料多孔支架，采用如下方法制备而成：
1）配置浓度为5%~30%光敏生物材料溶液；
2）配置浓度为0.1%~20%的葡聚糖溶液；
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按照一定的体积比例进行混合，使葡聚糖以液滴状分布在光敏生物材料溶液中；
4）将步骤3）得到的溶液进行365~405nm波长的光照射成型，照射时间大于0.1s；
5）将步骤4）成型后的支架材料浸泡在溶液中，以去除葡聚糖得到光敏生物材料多孔支架。
本发明还提供一种光敏生物材料多孔支架的应用，通过生物3D打印制备搭载有细胞所述光敏生物材料多孔支架。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明利用葡聚糖溶液与光敏生物材料混合，使葡聚糖溶液以球状液滴的形式分布在光敏生物材料中，在光照下，可使光敏生物材料聚合形成水凝胶，将葡聚糖包裹在其中，通过浸泡将葡聚糖去除，进而形成具有多孔结构的水凝胶。本发明光敏生物材料多孔支架具有大孔结构，能够有效促进氧气和营养物质在支架材料中的交换；同时，还可促进载入细胞的增殖、存活及细胞骨架的伸展，提升细胞的存活率。
2、本发明光敏生物材料多孔支架不仅可以为细胞生长提供氧气以及营养物质，实现氧气及营养物质的快速交换，还可为细胞提供无应力束缚的生长空间，促进载入细胞的存活，保障细胞功能的实现。
3、本发明通过温和的反应条件获得多孔结构的水凝胶，成孔过程不需要外界条件的刺激，避免传统成孔工艺中对细胞的损伤，例如冻干发和有机溶剂成孔法等，提高了细胞存活率，确保细胞生长后能够实现其应有的功能。
4、本发明光敏生物材料多孔支架可通过生物3D打印实现细胞搭载，从而可实现高精度复杂组织结构的制备，以应对不同组织结构的需求。
5、本发明操作过程简单，只需要将葡聚糖溶液和光敏生物材料进行混合，既可得到形成液滴状的葡聚糖分布在光敏生物材料溶液中，整个致孔过程条件温和，不对封装的细胞产生毒副作用。
附图说明
图1为制备载有细胞的光敏生物材料多孔支架的流程图。
图2中2a）为不同体积比例（GelMA: Dextran）混合后的溶液图像；2b）溶液中葡聚糖相液滴的直径统计图；2c）不同体积比例溶液的粘度；2d）光固化后光敏生物材料支架的微观形貌图。
图3中：3a）第5天后实验组和对照组中3T3和C2C12细胞活性图像，porous为实验组，control为对照组；3b)、3c）为3T3和C2C12细胞分别在实验组和对照组中增值情况；3d）为3T3和C2C12细胞分别在实验组和对照组中细胞骨架伸展图像；3e）为5天后，3T3细胞在600 um厚的实验组和对照组中纵截面分布图像。
图4中：4a）为数字光处理3D打印过程示意图。4b）为利用GelMA和葡聚糖混合溶液打印复杂结构的样品图，4c）为多细胞支架打印，从这两者可以看出，通过生物3D打印可以制备复杂结构的多孔支架，使多孔支架具有广阔的应用前景。4d）为不同体积比例的GelMA和葡聚糖混合溶液的打印精度及4e）其统计图；4f）为3D打印实验组和对照组中细胞的活性，其中i）为实验组，ii）为对照组；4g）为3D打印实验组和对照组中的细胞骨架伸展。
图5中：5a）为3D软件设计的气管；5b）3D打印含软骨细胞的气管支架；5c）为软骨细胞在实验组和对照组中的增殖情况；5d）为软骨细胞在实验组和对照组中的活性情况；5e）为软骨细胞在实验组和对照组中细胞骨架伸展情况，其中i）为实验组，ii）为对照组；5f）为植入裸鼠体内1个月后实验组和对照组的H&E染色、蕃红O染色及二型胶原免疫组化染色。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
一、一种光敏生物材料多孔支架
现有技术在将细胞与光敏生物材料进行结合时，主要采用的是两种方法：1）待光敏材料固化成型后，在材料表面接种细胞。这种方法易于操作，但细胞只能附着在材料表面，无法均匀地分布在材料中，这就极大的限制了细胞与光敏生物材料的应用，无法满足更多的临床应用需要。2）将细胞与光敏生物材料水溶液直接混合，通过光照使光敏材料交联固化，进而将细胞包裹其中。这种方法虽然可以将细胞均匀地包裹在光敏生物材料中，但是在光敏生物材料由液态转化为固态这一过程中，材料内部会产生强大的应力，这些应力会挤压或拉扯细胞，使细胞的形态发生变化，并且，这些应力并不会消失，应力作用会贯穿细胞的整个生长过程，导致细胞不得不在这些应力的作用下生长。除此之外，固化后的生物材料也无法为细胞提供良好的生长环境，由于固化后的生物材料具有非常致密的网络结构，这种结构会严重限制生物材料内外氧气以及各种营养物质的交换，导致身处生物材料中的细胞在生长过程中难以获得足够的氧气和营养物质，这些情况不仅严重影响细胞的存活率，还会影响存活细胞之后的功能，在研究中发现，即便这些细胞能够存活，细胞本身应具有的功能会受到严重影响，大部分细胞普遍会丧失其原有的功能，因此，如何实现细胞既能均匀分布在生物材料中，又能保证细胞有较高存活率以及具备其原有的功能，这是本发明有待解决的技术问题。在研究过程中，选择将光敏生物材料制成具有孔洞结构的材料，为提供生长空间，但在现有技术中，无法在温和的条件下进行成孔过程，无论是冻干法还是有机溶剂成孔法，这些成孔过程中使用的原材料会对细胞造成损伤，即便有成活的细胞，也会因成孔过程中原材料的刺激而导致其细胞功能发生变化，甚至完全丧失其原有的功能。针对这些缺陷，考虑到既要能够使生物材料形成多孔结构，又要使细胞能够安全度过生物材料的成孔过程，本发明经过研究后意外发现，葡聚糖溶液与光敏生物材料溶液混合后，两者能够形成一种乳浊液，使葡聚糖以球状液体的形式分布在光敏生物材料中，待光敏生物材料成型后，通过浸泡将其中的葡聚糖除去便可得到光敏生物材料多孔支架。而且，通过深入研究还发现，控制葡聚糖溶液与光敏生物材料溶液之间的体积比，能够对光敏生物材料溶液中葡聚糖液滴的直径进行控制，进而对多孔支架的孔隙大小进行调整，使多孔支架的孔隙大小能够满足不同应用需要，也能满足不同种类细胞的生长要求。
在将细胞载入光敏生物材料中时，将细胞与光敏生物材料溶液混合，通过葡聚糖在光敏生物材料中形成的多孔为细胞提供足够的生存空间，使细胞能够获得足够的氧气以及各种营养物质，大幅提升了细胞的存活率，并且，整个成孔过程非常温和，选用的原材料不会对细胞产生刺激和损伤，使细胞能够在光敏生物材料中正常生长，而且具有其原有的细胞功能，这对之后细胞以及多孔支架的广泛应用打下良好的基础。
本发明的工艺原理参见图1，采用如下方法制备而成：
1）配置浓度为5%~30%光敏生物材料溶液。
2）配置浓度为0.1%~20%的葡聚糖溶液。
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按照一定的体积比例进行混合，使葡聚糖以液滴状分布在光敏生物材料溶液中。
4）将步骤3）得到的溶液进行365~405nm波长的光照射成型，照射时间大于0.1s；
5）将步骤4）成型后的支架材料浸泡在溶液中，以去除葡聚糖得到光敏生物材料多孔支架。
在具体实施时，所述光敏生物材料包括甲基丙烯化明胶、甲基丙烯化丝素蛋白、甲基丙烯化羊毛角蛋白、7-羧基甲氧基-4-甲基香豆素化明胶中的一种或其复合物。所述光敏生物材料溶液与葡聚糖水溶液的体积比为（1:1）~（10:1）。其中，步骤1）中，在光敏生物材料溶液中加入光引发剂，能够加快光敏生物材料固化过程，而光引发剂的加入需要根据光敏生物材料中光敏基团的种类进行调整，当光敏基团为7-羧基甲氧基-4-甲基香豆素、7-羟基香豆素-3-羧酸时，可不使用光引发剂；当光敏基团为甲基丙烯酸酯时，则需要光引发剂，光引发剂可选用LAP（苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂）、I2959（2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，化学式为C12H16O4）、I819（酰基膦氧化物类光引发剂，化学名为苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦）中的一种，每1mL的溶剂中加入1mg~20mg光引发剂。
以下实施例中，GelMA（甲基丙烯酸酐化明胶）由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料。PBS为磷酸缓冲盐溶液，1*PBS表示1倍浓度的PBS缓冲液，即0.01M浓度，磷酸缓冲盐溶液的配方为8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶解到1L的去离子水中。
二、性能试验
1、光敏生物材料多孔支架的制备
一种光敏生物材料多孔支架，采用如下方法的制备而成：
1）配制原料溶液：在每1mL的1*PBS溶液中加入150mg的GelMA生物材料，得到浓度为15%的GelMA溶液；同理，在每1mL的1*PBS溶液中加入100mg的葡聚糖（Dextran），得到浓度为10%的葡聚糖溶液。其中，浓度15%代表每1mL溶剂中有150 mg生物材料，1mL溶剂的质量为1000mg，150mg/1000mg×100%=15%。
2）GelMA溶液和葡聚糖溶液按照体积比1:1、2:1、3:1、4:1、10:1分别进行混合，得到含有葡聚糖液滴的乳浊液，并对其中体积比为2:1、3:1、4:1的乳浊液中液滴的直径和乳浊液的粘度进行分析后，得到附图2，其中，2a）为不同体积比例（GelMA: Dextran）混合后的溶液图像；2b）溶液中葡聚糖相液滴的直径统计图；2c）溶液的粘度；2d）光固化后光敏生物材料支架的微观形貌图。结合2a)和2b)可以看出，葡聚糖溶液与光敏生物材料溶液混合后形成了一种乳浊液，葡聚糖以球状液滴的形态分布在光敏生物材料的溶液中，并且，GelMA溶液体积越大，葡聚糖在GelMA溶液中的液滴越小，固化后在光敏生物材料多孔支架中的孔隙越小，这也表明，可通过调节葡聚糖与光敏生物材料的体积比，来控制光敏生物材料溶液中葡聚糖液滴的直径，进而实现对光敏生物材料多孔支架孔隙大小的调节。
3）向步骤2）得到的乳浊液中加入光引发剂LAP，每1mL的1*PBS溶液中加入5mg光引发剂，然后用405nm波长的蓝光光源进行照射，使光敏生物材料固化。
4）将步骤3）得到的光敏生物材料浸泡在1*PBS溶液中，以去除光引发剂和葡聚糖，得到光敏生物材料多孔支架实施例1~5。
为了能够对光敏生物材料多孔支架的形貌进行深入研究，将光敏生物材料多孔支架经过冷冻干燥处理，通过扫描扫描电子显微镜对其外观形貌进行观察，得到附图2中的2d），可以看出，光固化后得到的光敏生物材料多孔支架具有多孔结构，并且， GelMA溶液和葡聚糖溶液通过不同体积比混合后，得到多孔支架的孔隙有明显差距，这也表明，能够通过调节光敏生物材料溶液与葡聚糖溶液的体积比，来对多孔支架的孔径进行调整。
采用实施例的方法，根据表1所述原料及其配比，获得实施例1~5光敏生物材料多孔支架。
表1
实施例1~5通过本发明所述方法进行培养后，均能够得到光敏生物材料多孔支架。
、细胞的搭载应用
将细胞搭载在本发明所述光敏生物材料多孔支架上，可以通过多种方法实现。
实验组：将含15%（w/v）GelMA和0.5%（w/v）LAP（光引发剂）的1*PBS溶液对收集的细胞进行重悬，得到含细胞的GelMA溶液，将10%浓度的葡聚糖溶液与含有细胞的GelMA溶液以体积比1:2进行混合，然后用405nm波长的蓝光光源进行照射，采用1*PBS溶液对照射后的样品进行浸泡清洗，得到载有细胞的光敏生物材料多孔支架。
对照组：将细胞重悬于上述同样浓度的GelMA溶液中，然后采用405nm波长的蓝光光源进行照射，得到含细胞的光敏生物材料为对照组。
在第1、3、5天对载入细胞的增殖速率进行分析；在第5天对细胞的活性、骨架及分布进行分析，得到附图3，附图3中，3a）第5天后实验组和对照组中3T3和C2C12细胞活性图像，porous为实验组，control为对照组；3b)、3c）为3T3和C2C12细胞分别在实验组和对照组中增值情况；3d）为3T3和C2C12细胞分别在实验组和对照组中细胞骨架伸展图像；3e）为5天后，3T3细胞在600 um厚的实验组和对照组中纵截面分布图像。从上述图像中可以看出，相较于对照组，实验组光敏生物材料多孔支架中搭载的细胞活性远远优于对照组，并且细胞增殖也明显优于对照组，同时，细胞骨架在本发明所述多孔支架伸展更优于对照组，这也表明，本发明所述光敏生物材料多孔支架有利于细胞的生长、增殖和骨架伸展，有利于组织工程支架的制备及应用。
、通过生物3D打印制备搭载有细胞的光敏生物材料多孔支架
1）构建3D数字模型，并转为STL格式的文件。然后将该文件导入切片软件进行切片处理。
2）配置打印材料：将含15%（w/v）GelMA和0.5%（w/v）LAP（光引发剂）的1*PBS溶液对收集的细胞进行重悬，得到含细胞的GelMA溶液。将10%（w/v）浓度的葡聚糖溶液与含细胞的GelMA溶液以体积比1:2进行混合，得到打印材料。在实际使用时，可通过调整葡聚糖溶液与含细胞的GelMA溶液以体积比，实现对多孔支架的孔径进行调整，使其满足不同应用需求。
3）将配置好的打印材料加入样品池，启动程序等待打印完成后，取出打印样品。
4）将打印完成样品进行浸泡，以去除光引发剂和葡聚糖，最后得到含细胞的3D打印光敏生物材料多孔支架。
对通过生物3D打印得到含细胞光敏生物材料多孔支架进行分析，参见图4，其中，4a）为数字光处理3D打印过程示意图。4b）为利用GelMA和葡聚糖混合溶液打印复杂结构的样品图，4c）为多细胞支架打印，从这两者可以看出，通过生物3D打印可以制备复杂结构的多孔支架，使多孔支架具有广阔的应用前景。4d）为不同体积比例的GelMA和葡聚糖混合溶液的打印精度及4e）其统计图；4f）为3D打印实验组和对照组中细胞的活性，其中i）为实验组，ii）为对照组；4g）为3D打印实验组和对照组中的细胞骨架伸展。
体内试验实验组：采用软骨细胞作为载入细胞，并将本发明所述多孔支架设计为气管外形，通过生物3D打印获得含有软骨细胞的气管样支架材料。
体内实验对照组：采用软骨细胞作为载入细胞，将软骨细胞重悬于与实验组同样浓度的GelMA溶液中，然后采用405nm波长的蓝光光源进行照射，得到含有软骨细胞的气管样支架材料。
分别将实验组和对照组的气管样支架材料植入到同一只3周龄的雄性裸鼠背部皮下。1个月后取材，并进行组织学分析。如图5所示，3D打印的含软骨细胞支架可有效促进植入后软骨细胞的存活和软骨组织的重建。图中：5a）为3D软件设计的气管；5b）3D打印含软骨细胞的气管支架；5c）为软骨细胞在实验组和对照组中的增殖情况；5d）为软骨细胞在实验组和对照组中的活性情况；5e）为软骨细胞在实验组和对照组中细胞骨架伸展情况，其中i）为实验组，ii）为对照组；5f）为植入裸鼠体内1个月后实验组和对照组的H&E染色、蕃红O染色及二型胶原免疫组化染色。
从图5可以看出，利用基于数字光处理的生物3D打印机与本发明所述光敏生物材料多孔支架相结合，可根据实际需要制备个性化的气管支架，载入的软骨细胞能够在本发明所述多孔支架中加快增殖速度，并提高其细胞骨架的伸展状态。体内试验证明，相较于对照组，利用本发明的光敏生物材料能够成功实现软骨组织的重建，而对照组中的软骨细胞基本没有存活。
综上，本发明利用光敏蛋白/多肽类衍生生物材料（如光敏明胶衍生物、光敏丝素蛋白衍生物、光敏羊毛角蛋白衍生物等）及其复合物良好的生物相容性和可降解性，通过光刺激和远程高精度地控制其在三维空间交联成型，在细胞递送、组织工程及生物3D打印等多种领域中具有重要的应用前景，有望推动组织修复及体外组织/器官模型等发展及应用。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种光敏生物材料多孔支架，其特征在于，采用如下方法制备而成：
1）配置浓度为5%~30%光敏生物材料溶液；
2）配置浓度为0.1%~20%的葡聚糖溶液；
3）将步骤1）和步骤2）配制溶液按照一定的体积比例进行混合，使葡聚糖以液滴状分布在光敏生物材料溶液中；
4）将步骤3）得到的溶液进行365~405nm波长的光照射成型，照射时间大于0.1s；
5）将步骤4）成型后的支架材料浸泡在与葡聚糖溶液相同的溶剂中，以去除葡聚糖得到光敏生物材料多孔支架。
2.根据权利要求1所述光敏生物材料多孔支架，其特征在于，所述光敏生物材料包括甲基丙烯化明胶、甲基丙烯化丝素蛋白、甲基丙烯化羊毛角蛋白、7-羧基甲氧基-4-甲基香豆素化明胶中的一种或其复合物。
3.根据权利要求1所述光敏生物材料多孔支架，其特征在于，所述光敏生物材料溶液与葡聚糖水溶液的体积比为（1:1）~（10:1）。
4.根据权利要求1所述光敏生物材料多孔支架，其特征在于，步骤1）中，在光敏生物材料溶液中加入光引发剂，光引发剂包括LAP、I2959、I819中的一种，每1mL的溶剂中加入1mg~20mg光引发剂。
5.根据权利要求1所述光敏生物材料多孔支架，其特征在于，所述光敏生物材料溶液和葡聚糖溶液的溶剂包括生理盐水、1*PBS缓冲液或细胞培养基的一种。
6.一种光敏生物材料多孔支架的应用，其特征在于，通过生物3D打印制备搭载有细胞的权利要求1~5任一所述光敏生物材料多孔支架。
7.根据权利要求6所述光敏生物材料多孔支架的应用，其特征在于，其应用方法包括：
1）构建3D数字模型，并转为STL格式的文件，将该文件导入切片软件进行切片处理；
2）配置含细胞、光引发剂的光敏生物材料与葡聚糖的混合溶液，得到打印材料；
3）将打印材料加入样品池，启动打印程序进行打印，得到样品；
4）将打印完成样品进行浸泡，以去除光引发剂和葡聚糖，最后得到含细胞的3D打印光敏生物材料多孔支架。
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