CN114712566B - 基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架及其制备方法。该方法包括：以SiO2纳米粒子作为乳液稳定剂，PCL的二氯甲烷溶液为油相，以GelMA溶液为水相，制备得到油包水的Pickering乳液，在低温下通过3D打印形成生物多尺度孔支架，经冷冻干燥后即可形成具有多尺度连通孔结构的PCL/GelMA复合支架。该制备方法将Pickering乳液、3D打印技术相结合，由于GelMA的存在，可以做到挤出即成型的效果，同时GelMA在冻干之后可以在支架内孔表面形成GelMA膜，提高了其表面活性。其具有的多尺度孔结构、可降解特性、高孔隙率以及良好的生物相容性可以用于骨修复领域。

Description

基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架及其制备方法
技术领域
本发明属于可降解的3D打印多孔生物支架领域，具体涉及基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架及其制备方法。
背景技术
骨骼作为人体承载的核心结构支架，分布在人体内的各个部位，同时在新陈代谢、细胞造血等人体重要生理活动中起着关键作用。骨骼也是人体内坚硬的组织器官，同时还具有一定的自修复能力，但骨骼也是非常脆弱，随着现代生活方式、生活环境的改变，导致出现大量骨缺损病例，据统计仅在中国，每年的骨缺损病例就高达300万，并且我国是一个人口老龄化日趋严重的国家，由骨质疏松带来的各类骨骼疾病的数量也呈现高速增长的趋势，预计在2025年，50岁以上的骨质疏松患者数量就会突破7000万。同时，市场对生物材料的需求也将大幅上升，预计至2025年，我国生物材料市场规模将达到2500亿美元，约为2020年的两倍。当骨组织受损直径达到30mm时，仅仅依靠骨组织的自修复能力不足以使受损部位完全愈合，此类骨缺损被称为不可自愈型骨缺损，由此带来的骨组织健康问题给人类带来了巨大困扰。在现阶段下，从根本上解决解决不可自愈性骨缺损问题的方法便是骨移植治疗。
骨移植治疗主要分为自体骨移植和异体骨移植两类。自体骨移植是从人体内取出健康骨进行填补修复，移植后几乎不发生排斥反应，同时骨内促血管化速度快，抗感染强。但是采用自体骨移植不仅要面临骨源受限的问题，还会对病人进行二次手术导致新的创伤，容易引起体组织并发症。异体骨移植在一定程度上弥补了骨源受限的问题，但移植后易感染、容易产生免疫排斥反应，不适用于临床需求。
在这样的背景下，骨组织工程概念应运而生，人工合成材料制备的骨支架为骨缺损治疗带来了新的希望。骨组织工程是通过体外培养生物活性骨支架后植入骨缺损部位进行骨缺损修复治疗，其中支架材料在骨修复中至关重要。骨缺损修复的支架在几何外形上应该与骨缺损部分匹配，在结构方面应具有内部连通微孔，在材料方面应无毒且具有良好的生物学性能。自21世纪以来，国内外研究重点主要是骨支架材料研发，制备出既能满足生物相容性又具备一定机械性能的骨支架，而3D打印技术的出现，弥补了骨支架结构设计的不足之处，可以使骨支架结构越来越精准。
胡洋等人提供了一种多孔支架的制备方法，包括以下步骤：将HAp纳米粒子作为稳定粒子，海藻酸钠、HAp纳米粒子的水悬液为水相，PCL的二氯甲烷溶液为油相，并加入载有布洛芬的PLLA微球，采用Pickering HIPE物理凝胶法制备了PCL/BSA/ALG-NA/HAp纳米复合多孔载药支架。此制备方法制备的乳液不具备温敏特性和光敏性，对其他成型工艺不友好，而制备的支架也不具备药物长期释放的效果(胡洋.基于Pickering乳液模板法制备生物相容有机/无机纳米复合多孔支架[D].华南理工大学,2015)。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供基于Pockering乳液的PCL/GelMA3D打印生物多孔支架及其制备方法。
本发明的目的是提供一种内孔表面粘附GelMA的可打印性强的高孔隙率支架，目的是在满足一般骨修复中对3D打印支架要求的基础上实现可持续放药，利用多尺度孔促进骨修复以及成血管化。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的制备方法为了促进骨修复，通过PLLA对HA进行改性，然后采用Pirckering双乳液的制备方法，将HA搭载于具有高孔隙率的3D打印支架上。同时水相采用GelMA的水溶液，不仅可以提高其打印性能，还能利用光固化方式快速固化，达到成型性强的效果；另外，水相采用GelMA可以使支架在冻干后，GelMA附着在内孔表面，形成GelMA膜促进细胞向内生长，同时还可以基于GelMA光交联后降解速率变慢的机制实现药物缓释。
本发明提供的基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架，是由聚己内酯、PLLA修饰后的HA和GelMA构成。其中，3D打印浆料的制备是利用Pickering乳液法制备，采用Pickering乳液法制备不仅可以获得高孔隙率，还可以使得油包水体系混合均匀。同时，GelMA最为内水相，具备温敏和光固化效果保证了Pickering乳液的可打印效果，具备更好的应用范围和价值。
本发明提供的基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羟基磷灰石(HA)和左旋聚乳酸(PLLA)分别溶解在二氯甲烷中，对HA所在坩埚进行密封冰水浴超声，超声后进行搅拌，搅拌过程中不断滴加PLLA的二氯甲烷溶液，待搅拌一段时间后，将坩埚放入马弗炉中进行烧结，最后研磨成粉体得到PLLA修饰后的HA粉体；
(2)将甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)溶于水中，再加入光引发剂，GelMA和光引发剂完全溶解后得到GelMA水相，密封静置避光保存；
(3)将PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL加入二氯甲烷中，得到油相溶液，密闭下冰水浴超声，在冰水浴超声过程中，对油相溶液间歇性震荡，混合均匀后，得到PCL油相；
(4)将步骤(3)中的油相HA-PCL放置于震荡机中进行震荡，分多次周期性加入水相GelMA，待水相GelMA全部加入后，震荡一段时间后放入低温静置，然后取出继续震荡至颜色达到均匀一致的状态后即停止震荡，制备得到具有温敏和光交联效果的均匀Pickering乳液。
(5)将步骤(4)所述Pickering乳液用于低温下3D打印，设置气压、打印速率、丝间距、层高、丝径，将步骤(4)中的Pickering乳液装入打印机中进行打印，打印过程中有紫外辐照，打印成型后将支架放入紫外光机中进行光固化，先进行低温预冻，最后冻干处理得到PCL/GelMA生物多孔支架。
进一步地，步骤(1)中，所述HA与二氯甲烷的质量体积比为0.25-0.3g/mL；所述PLLA与二氯甲烷的质量体积比为0.25-0.3g/mL。
进一步地，步骤(1)中，所述冰水浴超声的时间为60min，所述冰水浴超声的温度为5-10℃。
进一步地，步骤(1)所述搅拌的速率为350r/min-450r/min，所述搅拌一段时间为100min-120min。
进一步地，步骤(1)所述PLLA的二氯甲烷溶液的滴加速率控制在0.3mL/min-0.5mL/min。
进一步地，步骤(1)中马弗炉烧结温度为200℃，升温速率和降温速率均为5℃/min。
进一步地，步骤(2)中，所述GelMA和水的质量体积比为20-30mg/mL，所述光引发剂的质量与水的体积之比2-3mg/mL。
进一步地，步骤(2)中，所述GelMA和水的质量体积比为25mg/mL，光引发剂浓度为0.25％。
进一步地，步骤(3)所述PLLA修饰后的HA和二氯甲烷的质量体积比为30-60mg/mL，所述纳米SiO2和二氯甲烷的质量体积比为20-50mg/mL。
进一步地，步骤(3)所述PLLA修饰后的HA和二氯甲烷的质量体积比为50mg/mL，纳米SiO2和二氯甲烷的质量体积比为40mg/mL。
进一步地，步骤(3)所述聚己内酯(PCL)和二氯甲烷的质量体积比为75-125mg/mL。
进一步地，步骤(3)所述超声的时间为30-40min，在冰水浴超声过程中，对油相溶液震荡间隔时间为8-12min。
进一步地，步骤(3)所述超声的时间为30min，在冰水浴超声过程中，对油相溶液震荡间隔时间为8-10min。
进一步地，步骤(3)所述冰水浴的温度为5-10℃。
进一步地，所述PCL/GelMA生物多孔支架为Pickering乳液采用3D打印技术制备，形成均匀性多尺度多孔支架。
进一步地，步骤(4)所述GelMA水相与PCL油相之比为4:3。
进一步地，步骤(4)所述周期性加入GelMA水相的时间间隔为5-10min。
进一步地，步骤(4)所述周期性加入GelMA水相的时间间隔为5-8min。
进一步地，步骤(4)所述低温静置的温度为0到4℃，低温静置的时间为15-20min。
进一步地，步骤(4)所述取出继续震荡的时间为5-10min，震荡功率调至最高。
进一步地，步骤(4)所述制得的Pickering乳液装入料筒中低温保存，其中低温保存分长期(1-20天)保存和短期(12-24h)保存，短期保存的温度为0到4℃，长期保存的温度为-15到-20℃，使用时再震荡。
进一步地，步骤(5)中3D打印时低温控制温度在5-10℃，光固化紫外光波长为360-370nm。
进一步地，步骤(5)中3D打印时低温控制温度在10℃，光固化紫外光波长为365nm。
进一步地，所述气压为0.07-0.08MPA，打印速率为13-18mm/s，丝间距设置为0.6-1.0mm，层高为0.32-0.36mm，丝径为0.4mm-0.6mm，打印的温度控制在5-10℃。
进一步地，步骤(5)所述预冻的温度为-70～-80℃。
进一步地，步骤(5)所述预冻的温度为-80℃，预冻的时间为30min。
进一步地，步骤(5)所述紫外光机中进行光固化的紫外辐照时间为15-25min。
进一步地，步骤(5)所述冻干的时间24-36h。
进一步地，步骤(5)所述冻干的时间为24h。
本发明提供的一种由上述制备方法制得的PCL/GelMA生物多孔支架。
本发明提供的的PCL/GelMA生物多孔支架由PLLA修饰后的HA、聚己内酯和纳米SiO2形成的油相与光引发剂和GelMA水溶液形成的水相构成Pickering乳液3D打印而成，在支架内孔表面沉积GelMA膜，以用其亲水性和高比表面积可实现促成骨和血管化，促进细胞向内生长。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的PCL/GelMA生物多孔支架是在Pickering乳相制备方法与3D打印技术基础上制备而成的，打印成型性高，生物多孔支架上利用Pickering乳液形成小尺度孔，并使得GelMA在冻干后沉积在内孔表面，GelMA膜可改善材料脆性；而通过3D打印技术可以使材料具有大尺度孔，同时可以达到快速成型的目的。与现有的组织工程支架材料相比，该PCL/GelMA生物多孔支架具有高孔隙率，同时GelMA膜可促进细胞粘附，增殖。
(2)本发明提供的的PCL/GelMA生物多孔支架具有良好的生物相容性，利用GelMA内孔膜具有亲水效果，可以改善材料内部的亲水性，促进细胞向PCL/GelMA生物多孔支架内部粘附；同时GelMA内孔膜具有高表面积，可实现载药功能。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的PLLA修饰后的HA的X射线衍射(XRD)图。
图2为本发明实施例1提供的PLLA修饰后的HA的透射电子显微镜(TEM)图。
图3为对比例1-3制备的Pickering乳液支架的孔隙率柱状图。
图4为本发明实施例1提供的PCL/GelMA生物多孔支架的扫描电子显微镜图。
图5为本发明实施例1提供的PCL/GelMA生物多孔支架、对比例1制备的未交联PCL/GelMA的Pickering乳液支架和对比例3制备的PCL多孔支架的红外光谱图。
图6为本发明应用例1提供的PCL/GelMA生物多孔支架载微球后的扫描电子显微镜(SEM)切面图。
图7为本发明实施例1提供的PCL/GelMA生物多孔支架和PCL多孔支架的细胞黏附图。
图8为本发明实施例1提供的PCL/GelMA生物多孔支架和PCL多孔支架的生物相容性表征图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
步骤一：PLLA修饰后的HA的制备
将1.5g的羟基磷灰石和1.5g左旋聚乳酸加入到装有15mL的二氯甲烷坩埚中，密封放置；将装有HA的坩埚在冰水浴环境下密封超声1h，保证HA在溶液中足够分散；使用搅拌机对装有HA的坩埚进行搅拌，搅拌转速设置为400r/min，搅拌不过中不断滴加PLLA的二氯甲烷溶液(浓度为300mg/mL)，滴加速率控制在0.5mL/min，搅拌时间为100min；然后放入马弗炉中烧结，烧结温度控制在200摄氏度，升温和降温速率均设定为5℃/min，然后研磨成粉制得PLLA修饰后的HA。
步骤二：Pickering乳液的制备
将120mg PLLA修饰后的HA，120mg纳米SiO2和300mg PCL加入3mL二氯甲烷中，得到油相混合溶液，油相混合溶液中PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL的质量-体积浓度分别为40mg/mL、40mg/mL和100mg/mL，然后在冰水浴环境下超声30min，在冰水浴超声过程中，每间隔8min对油相混合溶液进行震荡，使油相混合溶液均匀混合，从而制得PCL油相；将100mgGelMA溶解在4mL去离子水中，再加入10mg光引发剂(2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)，得到水相混合溶液，水相混合溶液中GelMA的质量-体积浓度为25mg/mL，水相混合溶液中光引发剂的质量-体积浓度为2.5mg/mL，密封放置3h完全溶解后得到GelMA水相。将PCL油相放置在震荡机上震荡，震荡过程中加入GelMA水相，每次加入2mL，加入2次，时间间隔为8min，待加入完毕后震荡8min放入4℃低温环境中静置30min，最后取出震荡7分钟均匀后得到的Pickering乳液即可装入料筒。
步骤三：PCL/GelMA生物多孔支架的制备
将画好的模型(3D打印支架模型)以STL格式导入3D打印机器中，设置气压为0.07MPA，打印速率为15mm/s，层间距为0.35mm，丝径为0.4mm，将步骤二中制得的Pickering乳液装入打印机中在5℃低温及紫外光照环境下打印，打印温度保持在5℃，打印成型后将支架放入紫外光机中进行光固化，紫外光的波长为365nm，照射时间为20min；然后放入-80℃低温环境下预冻30min，冻干24h，得到PCL/GelMA生物多孔支架。
对比例1
将实施例1步骤二制备的Pickering乳液冻干(-80℃冻干24h)后得到未交联PCL/GelMA的Pickering乳液支架。
对比例2
步骤一：同实施例1的步骤一；
步骤二：将120mg PLLA修饰后的HA，120mg纳米SiO2和300mg PCL加入3mL二氯甲烷中，得到油相混合溶液，油相混合溶液中PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL的质量-体积浓度分别为40mg/mL、40mg/mL和100mg/mL，然后在冰水浴环境下超声30min，在冰水浴超声过程中，每间隔8min对油相混合溶液进行震荡，使油相混合溶液均匀混合，从而制得PCL油相；将100mg GelMA溶解在3mL去离子水中，再加入10mg光引发剂(2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)，得到水相混合溶液，水相混合溶液中GelMA的质量-体积浓度为25mg/mL，光引发剂浓度为0.25％，密封放置3h完全溶解后得到GelMA水相。将PCL油相放置在震荡机上震荡，震荡过程中加入GelMA水相，每次加入2mL，加入2次，时间间隔为8min，待加入完毕后震荡8min放入4℃低温环境中静置30min，最后取出震荡7分钟均匀后得到的Pickering乳液即可装入料筒，将得到的Pickering乳液冻干(-80℃冻干24h)，得到未交联PCL/GelMA的Pickering乳液支架。
对比例3
步骤一：同实施例1的步骤一；
步骤二：将120mg PLLA修饰后的HA，120mg纳米SiO2和300mg PCL加入3mL二氯甲烷中，得到油相混合溶液，油相混合溶液中PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL的质量-体积浓度分别为40mg/mL、40mg/mL和100mg/mL，然后在冰水浴环境下超声30min，在冰水浴超声过程中，每间隔8min对油相混合溶液进行震荡，使油相混合溶液均匀混合，从而制得PCL油相；将PCL油相放置在震荡机上震荡，震荡过程中加入3mL去离子水，每次加入1.5mL，加入2次，时间间隔为8min，待加入完毕后震荡8min放入4℃低温环境中静置30min，最后取出震荡7分钟均匀后得到的Pickering乳液即可装入料筒；将得到的Pickering乳液冻干(-80℃冻干24h)，得到PCL的Pickering乳液支架。
步骤三：同实施例1的步骤三，得到PCL多孔支架。
图1为本发明实施例1提供的PLLA修饰后的HA的X射线衍射(XRD)图。由图1可知，PLLA修饰后的HA具有PLLA的特征峰和HA的特征峰，说明PLLA成功包覆于HA表面，实现疏水改性的目的。
图2为本发明实施例1提供的PLLA修饰后的HA的透射电子显微镜(TEM)图。由图2可知，PLLA修饰后的HA的粒径在纳米尺度且具有良好的分散性。
图3为本发明对比例1-3制备的Pickering乳液支架的孔隙率柱状图。通过由图3可知，对比例1中4mL GelMA内水相的Pickering乳液支架的孔隙率最高。具体步骤：通过使用抽气泵的排水法和使用液压机的压缩法测量不同成分的Pickering乳液冻干后的孔隙率，排水法的抽气时间控制在1h，压缩法的应力为30MPA。抽气排水法首先需要用电子天枰称取Pickering乳液支架质量m1，游标卡尺测量支架的直径d和厚度h，从而得到支架体积V，然后将冻干后的Pickering乳液支架放入水中，在密闭环境下抽气1h后，接着将支架取出并用湿润滤纸沾去支架表面的水，称其质量m2，通过公式2-1计算其孔隙率。
Figure BDA0003611282340000071
而压缩法是通过计算压缩前(V1)和压缩后的体积(V2)，通过直接测量支架得到直径d和厚度h1并计算得到V1，然后将支架放入直径为8mm的模具中，以30MPA的应力压缩支架后得到厚度h2并计算得到V2，通过公式2-2得出。
Figure BDA0003611282340000072
实施例1制备的PCL/GelMA生物多孔支架形貌如图4所示。可以看到大量连通孔结构，孔体积保持在微米尺度，另外内孔表面粗糙且具有GelMA膜的存在。
实施例1制备的PCL/GelMA生物多孔支架、对比例1制备的未交联PCL/GelMA的Pickering乳液支架和对比例3制备的PCL多孔支架的红外结果如图5所示。可以看到在波束为3310时，其峰值有明显变化，可以证明打印过程中Pickering乳液在紫外光照下成功交联。
实施例2
步骤一：PLLA修饰后的HA的制备
将1.25g的羟基磷灰石和1.25g左旋聚乳酸加入到装有10mL的二氯甲烷坩埚中，密封放置；将装有HA的坩埚在冰水浴环境下密封超声60min，保证HA在溶液中足够分散；使用搅拌机对装有HA的坩埚进行搅拌，搅拌转速设置为350r/min，搅拌不过中不断滴加PLLA的二氯甲烷溶液(浓度为250mg/mL)，滴加速率控制在0.3mL/min，搅拌时间为120min；然后放入马弗炉中烧结，烧结温度控制在200摄氏度，升温和降温速率均设定为5℃/min，然后研磨成粉制得PLLA修饰后的HA。
步骤二：Pickering乳液的制备
将90mgPLLA修饰后的HA，150mg纳米SiO2和375mg PCL加入3mL二氯甲烷中，得到油相混合溶液，油相混合溶液中PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL的质量-体积浓度分别为30mg/mL、50mg/mL和125mg/mL，然后在冰水浴环境下超声30min，在冰水浴超声过程中，每间隔12min对油相混合溶液进行震荡，使油相混合溶液均匀混合，从而制得PCL油相；将120mgGelMA溶解在4mL去离子水中，再加入12mg光引发剂(2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)，得到水相混合溶液，水相混合溶液中GelMA的质量-体积浓度为30mg/mL，水相混合溶液中光引发剂的质量-体积浓度为3mg/mL，密封放置3h完全溶解后得到GelMA水相。将PCL油相放置在震荡机上震荡，震荡过程中加入GelMA水相，每次加入2mL，加入2次，时间间隔为10min，待加入完毕后震荡10min放入4℃低温环境中静置30min，最后取出震荡10min，均匀后得到的Pickering乳液即可装入料筒。
步骤三：PCL/GelMA生物多孔支架的制备
将画好的模型(3D打印支架模型)以STL格式导入3D打印机器中，设置气压为0.08MPA，打印速率为13mm/s，层间距为0.32mm，丝径为0.4mm，将步骤二中制得的Pickering乳液装入打印机中在5℃低温及紫外光照环境下打印，打印温度保持在5℃，打印成型后将支架放入紫外光机中进行光固化，紫外光的波长为365nm，照射时间为25min；然后放入-80℃低温环境下预冻30min，冻干36h，得到PCL/GelMA生物多孔支架。
实施例3
步骤一：PLLA修饰后的HA的制备
将1.75g的羟基磷灰石和1.75g左旋聚乳酸加入到装有15mL的二氯甲烷坩埚中，密封放置；将装有HA的坩埚在冰水浴环境下密封超声80min，保证HA在溶液中足够分散；使用搅拌机对装有HA的坩埚进行搅拌，搅拌转速设置为450r/min，搅拌不过中不断滴加PLLA的二氯甲烷溶液(浓度为300mg/mL)，滴加速率控制在0.3mL/min，搅拌时间为100min；然后放入马弗炉中烧结，烧结温度控制在200摄氏度，升温和降温速率均设定为5℃/min，然后研磨成粉制得PLLA修饰后的HA。
步骤二：Pickering乳液的制备
将180mgPLLA修饰后的HA，60mg纳米SiO2和225mg PCL加入3mL二氯甲烷中，得到油相混合溶液，油相混合溶液中PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL的质量-体积浓度分别为60mg/mL、20mg/mL和75mg/mL，然后在冰水浴环境下超声30min，在冰水浴超声过程中，每间隔8min对油相混合溶液进行震荡，使油相混合溶液均匀混合，从而制得PCL油相；将80mgGelMA溶解在4mL去离子水中，再加入8mg光引发剂(2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)，得到水相混合溶液，水相混合溶液中GelMA的质量-体积浓度为20mg/mL，水相混合溶液中光引发剂的质量-体积浓度为2mg/mL，密封放置3h完全溶解后得到GelMA水相。将PCL油相放置在震荡机上震荡，震荡过程中加入GelMA水相，每次加入2mL，加入2次，时间间隔为5min，待加入完毕后震荡5min放入4℃低温环境中静置30min，最后取出震荡5分钟均匀后得到的Pickering乳液即可装入料筒。
步骤三：PCL/GelMA生物多孔支架的制备
将画好的模型(3D打印支架模型)以STL格式导入3D打印机器中，设置气压为0.07MPA，打印速率为18mm/s，层间距为0.36mm，丝径为0.6mm，将步骤二中制得的Pickering乳液装入打印机中在5℃低温及紫外光照环境下打印，打印温度保持在5℃，打印成型后将支架放入紫外光机中进行光固化，紫外光的波长为365nm，照射时间为15min；然后放入-80℃低温环境下预冻30min，冻干24h，得到PCL/GelMA生物多孔支架。
应用例1
步骤一：PLLA修饰后的HA的制备
将1.5g羟基磷灰石和1.5g左旋聚乳酸分别加入到装有15ml二氯甲烷溶液坩埚中，密封放置；将装有HA的坩埚在冰水浴环境下密封超声1h，保证HA在溶液中足够分散；使用搅拌机对装有HA的坩埚进行搅拌，搅拌转速设置为450r/min，搅拌不过中不断滴加PLLA的二氯甲烷溶液(浓度为150mg/mL)，滴加速率控制在0.5mL/min，搅拌时间为120min；然后放入马弗炉中烧结，烧结温度控制在200摄氏度，升温和降温速率均设定为5℃/min，然后研磨成粉制得PLLA修饰后的HA。
步骤二：PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)中空微球制备
将40mg的PLGA溶解在2mL二氯甲烷中，然后加入0.2ml的水，水与二氯甲烷的体积比为1:10；然后使用高速搅拌机，搅拌速率设置为5000r/min，搅拌时间在120s；然后将搅拌过后的溶液加入到5℃低温保存的20ml质量百分比浓度为1％的PVA(聚乙烯醇)水溶液中，然后高速搅拌，搅拌速率为5000r/min，时间为120s；搅拌结束后，将所得溶液放入磁力搅拌机，以600r/min的速率搅拌12h；然后将所得溶液放入高速离心机中离心，转速设置为12000r/min，得到O/W/O(油包水包油)体系的PLGA微球；
步骤三：将120mg或gPLLA修饰后的HA，120mg纳米SiO2和300mgPCL溶解在在二氯甲烷中，得到油相混合溶液，油相混合溶液中PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL的质量体积比分别为40mg/mL、40mg/mL和100mg/mL，然后在冰水浴环境下超声30min，在冰水浴超声过程中，每间隔10min对油相混合溶液进行震荡，使油相混合溶液均匀混合，从而制得PCL油相；将100mgGelMA溶解在4ml去离子水中，再加入10mg光引发剂(2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)，得到水相混合溶液，水相混合溶液中GelMA质量体积比为25mg/mL，光引发剂浓度为0.25％，密封放置2h充分溶解后得到GelMA水相。向GelMA水相中加入步骤二中制得的10mgPLGA微球，震荡后得到含PLGA微球的GelMA水相。将PCL油相放置在震荡机上震荡，震荡过程中加入含PLGA微球的GelMA水相，每次加入2mL，加入2次，时间间隔为8min，待加入完毕后震荡5min放入4℃低温环境中静置30min，最后取出震荡8min均匀后得到的Pickering乳液即可装入料筒。
步骤四：内孔粘附PLGA微球的PCL/GelMA生物多孔支架的制备
将画好的模型(3D打印支架模型)以STL格式导入3D打印机器中，设置气压0.07MPA，打印速率为15mm/s，层间距为0.35mm，丝径为0.4mm，将步骤二中制得的Pickering乳液装入打印机中在5℃及紫外光照环境下打印，打印温度保持在5℃，打印成型后将支架放入紫外光机中进行光固化，紫外光的波长为365nm，照射时间为20min；然后放入-80℃低温环境下预冻30min，冻干24h，得到载PLGA微球的PCL/GelMA生物多孔支架。
图6为本发明应用例1PLGA微球黏附于PCL/GelMA生物多孔支架内孔表面的SEM图。由图6可以看到内孔表面有微球黏附，可以证明PLGA微球成功负载到支架内孔表面。
将实施例1所得的PCL/GelMA生物多孔支架用于细胞黏附测试，BMSCs细胞以1×105的密度接种于48孔板中，培养36h后，采用F-Actin和DApi试剂进行染色处理，观察细胞在支架上的黏附情况。对培养36h后的孔板的具体操作如下：1、吸去原培养液用PBS缓冲液(pH为7.4)润洗两次后，加入200μL质量百分比浓度为4％多聚甲醛溶液室温静置10分钟以固定细胞形态；2、吸去多聚甲醛液体，加入PBS缓冲液(pH为7.4)洗涤3次，每次5分钟；3、将免疫荧光染色二抗稀释液与PBS缓冲液(pH为7.4)按照体积比1:100的比例稀释，混匀形成工作液并按每孔200μL加入48孔板中，室温避光孵育60min；4、用PBS缓冲液(pH为7.4)洗涤3次，每次10min，洗涤结束后加入免疫染色通透液200μL室温避光静置10min；5、用PBS缓冲液(pH为7.4)洗涤2次，每次5min，洗涤结束后直接加入DAPI染色液，室温避光孵育5min；6、PBS缓冲液(pH为7.4)洗涤3次，每次8min，洗涤结束后即可用于激光共聚焦显微镜下拍摄，其拍摄时的机器发射波长分别为560nm和340nm。图7显示了细胞在实施例1制备的PCL/GelMA生物多孔支架和PCL多孔支架上的黏附情况，由图7可知PCL/GelMA生物多孔支架相较于PCL多孔支架具有更好的细胞黏附效果。
PCL/GelMA生物多孔支架的细胞毒性的测试，BMSCs细胞以1.5×104的密度接种于48孔板中，分别在培养1、3、5天后，采用CCK-8试剂盒对BMSCs在改性PCL/GelMA生物多孔支架上的的增殖情况进行检测。具体操作如下：取出孔板，吸出培养基，加入PBS缓冲液(pH为7.4)轻柔润洗孔板3次，在避光条件下向每孔加入200μL的CCK-8工作液(CCK-8原液与完全培养基以1:9的体积比混合)，然后将孔板置于37℃、体积百分比浓度5％CO2培养箱中避光孵育80min。用复吸法从每个孔中均取100μL孵育后的溶液加入到一个新的96孔板中，使用酶标仪测定各支架在450nm处的吸光值。每组设置5个平行样，去除最高值和最低值后。结果如图8所示，从第1天到第5天，PCL/GelMA生物多孔支架上培养的BMSCs细胞相对于PCL多孔支架组有更加明显的增殖，说明PCL/GelMA生物多孔支架可以有效促进细胞的生长和增殖。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将GelMA溶于水中，再加入光引发剂，GelMA和光引发剂溶解得到GelMA水相后密封避光保存；
(2)将经PLLA修饰后的HA、纳米SiO2和PCL混合后加入二氯甲烷中，得到油相溶液，然后冰水浴超声，在冰水浴超声过程中，对油相溶液进行震荡，均匀混合后，得到PCL油相，所述经PLLA修饰后的HA的制备方法为将羟基磷灰石(HA)和左旋聚乳酸(PLLA)分别溶解在二氯甲烷中，对HA所在坩埚进行密封冰水浴超声，超声后进行搅拌，搅拌过程中不断滴加PLLA的二氯甲烷溶液，待搅拌一段时间后，将坩埚放入马弗炉中进行烧结，最后研磨成粉体得到PLLA修饰后的HA粉体，PLLA成功包覆于HA表面；
(3)将步骤(2)得到的PCL油相进行震荡，震荡过程中加入步骤(1)中的GelMA水相，然后继续震荡后，静置，然后取出继续震荡至形成均匀Pickering乳液；
(4)将步骤(3)所述Pickering乳液用于3D打印，设置气压、打印速率、丝间距、层高、丝径，将步骤(3)中的Pickering乳液装入打印机中进行打印，打印过程中有紫外辐照，得到打印好的支架；
(5)将步骤(4)中打印好的支架紫外光照射后，预冻；
(6)将步骤(5)中预冻后的支架冻干，得到PCL/GelMA生物多孔支架。
2.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述GelMA和水的质量体积比为20-30mg/mL，所述光引发剂的质量与水的体积之比2-3mg/mL。
3.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PLLA修饰后的HA和二氯甲烷的质量体积比为30-60mg/mL，所述纳米SiO2和二氯甲烷的质量体积比为20-50mg/mL，所述PCL和二氯甲烷的质量体积比为75-125mg/mL。
4.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述冰水浴超声的时间为30-40min，在冰水浴超声过程中，对油相溶液每隔8-12min进行震荡。
5.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，每5-10min加入一次步骤(1)中的GelMA水相。
6.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述取出继续震荡的时间为5-10min。
7.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，气压为0.07-0.08MPa、打印速率为13-18mm/s、丝间距为0.6-1.0mm、层高0.32-0.36mm、丝径0.4-0.6mm，打印的温度控制在5-10℃。
8.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述紫外光的波长为360-370nm，照射的时间为15-25min，预冻的温度为-70～-80℃。
9.根据权利要求1所述基于Pickering乳液的PCL/GelMA生物多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述冻干的时间为24-36h。
10.权利要求1-9任一项所述制备方法制得的PCL/GelMA生物多孔支架。
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