CN116271222B - 一种骨组织工程支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种骨组织工程支架及其制备方法和应用，属于组织工程材料技术领域。本发明提供的骨组织工程支架包括支架基体以及负载于所述支架上的可注射型富血小板纤维蛋白，所述支架基体为具有三周期极小曲面仿生结构的β‑磷酸三钙多孔陶瓷骨支架。本发明在支架基体上同时负载可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1，所得骨组织工程支架既有成骨作用，又有促进软组织再生的作用及早期血管化的作用，有利于骨缺损修复。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程材料技术领域，尤其涉及一种骨组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
种植牙已经成为修复牙体缺失和牙列缺失首选的方式之一，但由于创伤、牙周病、牙槽骨吸收或先天畸形等引起的大范围牙槽骨缺损，尤其是垂直向骨缺损造成的种植部位牙槽骨高度严重不足，因恢复困难，已成为限制种植手术广泛开展的主要障碍。目前临床上主要通过牵张成骨、引导骨组织再生和覆盖植骨等方法，修复种植手术中牙槽骨剩余高度严重不足的垂直骨缺损。但因手术难度大、技术敏感性高、并发症发生率高、疗效不甚理想等因素，使得以上手术方式在临床上无法广泛开展。通过3D打印的加工方式，可以精确、个性化地定制具有复杂多孔结构的骨支架，如根据实际需要制备与患者牙槽骨形态、大小一致的个性化支架。
三周期极小曲面(TriplyPeriodicMinimalSurfaces，TPMS)的几何定义是在欧氏空间内沿X轴、Y轴、Z轴方向成周期性变化且平均曲率为零的曲面，有研究表明人体内骨小梁表面的平均曲率为零，因TPMS结构与松质骨相仿而具有作为骨组织工程支架的应用潜力。其中，通过调节支架的壁厚和孔径，可达到对松质骨密度、弹性模量和渗透率等方面的精确仿生。研究显示，最好的模仿松质骨自然形态的几何结构是由一个连续、不相交的双面曲面分成的两个子空间，而TPMS结构所形成的光滑的无限曲面，能够在没有自交的情况下将空间分割成两部分，是模拟松质骨空间形态的理想几何结构，因此TPMS结构可以达到对松质骨结构高度仿生的效果，研究证明TPMS结构相比传统结构在机械性能上具有显著优势。然而，现有技术中TPMS支架通常只有促进成骨作用，无促进软组织再生作用及早期血管化作用，限制了TPMS支架的进一步应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨组织工程支架及其制备方法和应用，本发明提供的骨组织工程支架既有成骨作用，又有促进软组织再生的作用及早期血管化的作用，有利于骨缺损修复。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种骨组织工程支架，包括支架基体以及负载于所述支架上的可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1，所述支架基体为具有三周期极小曲面仿生结构的β-磷酸三钙多孔陶瓷骨支架。
优选地，所述支架基体的孔隙率为40～70％。
本发明提供了上述技术方案所述骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
提供含有可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1的混合液；
将支架基体浸泡于所述混合液中，采用吹打法使所述混合液呈泡沫状后依次进行成胶处理和冷冻干燥，得到骨组织工程支架。
优选地，所述混合液中可注射型富血小板纤维蛋白的体积分数为1～20％，基质细胞衍生因子1的浓度为50～400ng/mL。
优选地，所述混合液的溶剂包括PBS缓冲液、生理盐水和DMEM培养基中的一种或多种。
优选地，所述成胶处理的温度为37～50℃，时间为10min～24h。
优选地，所述冷冻干燥的温度为-50～-10℃，时间为24～72h。
优选地，所述支架基体的制备方法，包括以下步骤：
将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合，得到混合原料；
将所述混合原料依次进行3D打印和烧结，得到支架基体。
本发明提供了上述技术方案所述的骨组织工程支架或上述技术方案所述制备方法制备得到的骨组织工程支架在制备骨组织修复材料中的应用。
优选地，所述骨组织修复材料为全身松质骨缺损修复材料。
本发明提供了一种骨组织工程支架，包括支架基体以及负载于所述支架上的可注射型富血小板纤维蛋白(injectableplatelet-richfibrin，I-PRF)和基质细胞衍生因子1(Stromalcellderivedfactor1，SDF-1)，所述支架基体为具有三周期极小曲面(TPMS)仿生结构的β-磷酸三钙多孔陶瓷骨支架。本发明在支架基体上同时负载I-PRF和SDF-1，所得骨组织工程支架既有成骨作用，又有促进软组织再生的作用及早期血管化的作用，有利于骨缺损修复。
附图说明
图1为实施例1中提取I-PRF时离心后的兔血实物图；
图2为不同浓度的I-PRF溶液的细胞相容实验CCK-8结果图；
图3为不同浓度的I-PRF溶液的细胞相容实验活死染色结果图；
图4为T支架和SIT支架的数码照片；
图5为400X扫描电镜下T支架和SIT支架的微观形貌图；
图6为细胞黏附于T支架和SIT支架的微观形貌图；
图7为T支架和SIT支架的细胞增殖效果图；
图8为细胞黏附于T支架和SIT支架的荧光染色结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种骨组织工程支架，包括支架基体以及负载于所述支架上的可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1，所述支架基体为具有三周期极小曲面仿生结构的β-磷酸三钙多孔陶瓷骨支架。
本发明提供的骨组织工程支架包括支架基体，所述支架基体为具有三周期极小曲面(TPMS)仿生结构的β-磷酸三钙(β-TCP)多孔陶瓷骨支架；所述支架基体的孔隙率优选为40～70％，更优选为60～70％。本发明后文会详细说明所述支架基体的制备方法。
本发明提供的骨组织工程支架包括负载于所述支架上的可注射型富血小板纤维蛋白(injectableplatelet-richfibrin，I-PRF)和基质细胞衍生因子1(Stromalcellderivedfactor1，SDF-1)。本发明通过在支架基体上同时负载I-PRF和SDF-1，所得骨组织工程支架既有成骨作用，又有促进软组织再生的作用及早期血管化的作用，有利于骨缺损修复，是一种促进骨髓间充质干细胞募集及早期血管化的三维多孔骨支架。具体的，所述支架基体能够恢复骨的结构与功能，有利于骨缺损处骨组织、软组织新生和血管再生。所述I-PRF能够促进细胞增殖、迁移及分化，同时具有抗炎作用与杀菌活性，加速组织愈合过程，为骨缺损修复早期必需的生长因子及趋化因子，赋予骨组织工程支架骨诱导活性，协同促进骨组织早期、快速愈合、促进血管形成。所述SDF-1是一种趋化因子，在肿瘤血管生成和受损组织恢复中起到有利作用，可以促进内皮祖细胞(EPCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)通过VEGF/SDF-1/CXCR4进入内皮细胞通路，有利于血管生成和组织修复；由于VEGF和bFGF在血管生成中起关键作用，SDF-1可以用作VEGF和SDF-1受体的下游靶点，CXCR4可以用作bFGF的下游目标；同时，SDF-1的过度表达也可以促进VEGF和bFGF46的表达并协同它们一起促进血管形成。因此，本发明中骨组织工程支架的开发综合考虑骨组织工程支架的材料、结构、成分及成骨成血管效果等因素，协同机体骨组织修复的生理过程，为骨缺损(如垂直骨缺损)患者提供可能的治疗方案。
本发明提供了上述技术方案所述骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
提供含有可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1的混合液；
将支架基体浸泡于所述混合液中，采用吹打法使所述混合液呈泡沫状后依次进行成胶处理和冷冻干燥，得到骨组织工程支架。
在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法得到。
本发明首先对支架基体的制备方法进行详细说明。在本发明中，所述支架基体的制备方法，优选包括以下步骤：将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合，得到混合原料；将所述混合原料依次进行3D打印和烧结，得到支架基体。在本发明的实施例中，TPMS表面结构优选由大连理工大学王胜法教授课题组使用MatlabR2020a软件设计而成，支架基体被设计为底面直径为8mm、厚度为3mm的圆柱体，孔隙率为70％的TPMS结构，孔壁厚度为200μm；经Magics21.0软件导出STL数字模型文件；使用基于数字激光加工技术的3D打印机(AUTOCERA-M，北京十维科技有限公司，中国)，以TPMS结构导出后的STL数字模型文件为蓝本，将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合后所得混合原料进行3D打印，之后将所得支架坯体进行烧结，得到支架基体。本发明对所述支架基体的制备原料配比以及制备工艺参数没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的技术方案即可；在本发明中，所述3D打印的条件优选包括：光波波长为405nm，光斑尺寸为50μm，曝光时间为6s，曝光功率为30mW/cm2，层厚为25μm。所述3D打印后，本发明优选将所得支架坯体进行洗涤，以去除未固化的光固化树脂单体，然后再进行烧结，得到支架基体。在本发明中，所述洗涤所用试剂优选为乙醇，所述洗涤优选为超声洗涤，所述超声洗涤的时间优选为30s。在本发明中，所述烧结的温度优选为1350℃；升温至所述烧结的温度的升温速率优选为2℃/min；所述烧结的保温时间优选为3h。
本发明提供含有可注射型富血小板纤维蛋白(I-PRF)和基质细胞衍生因子1(SDF-1)的混合液。在本发明中，所述混合液中I-PRF的体积分数优选为1～20％，更优选为1～10％，进一步优选为1～5％；SDF-1的浓度优选为50～400ng/mL，更优选为50～200ng/mL，进一步优选为50～100ng/mL。在本发明中，所述混合液的溶剂优选包括PBS缓冲液、生理盐水和DMEM培养基中的一种或多种，所述PBS缓冲液的pH值优选为7.35～7.45。在本发明的实施例中，具体是将I-PRF加入到DMEM培养基中，得到I-PRF溶液，所述I-PRF溶液中I-PRF的体积分数为5％；将SDF-1加入到PBS缓冲液(7.35～7.45)中，得到SDF-1溶液，所述SDF-1溶液中SDF-1的浓度为100ng/mL；将200μL的I-PRF溶液、500μL的SDF-1溶液以及300μL的DMEM培养基混合，得到1mL混合溶液。
在本发明中，所述I-PRF具体可以由兔耳动脉取血提取得到，不同于人血中I-PRF的提取方法以及新西兰大白兔的心脏采血，本法更加微创、可持续、人性化和无痛化。在本发明中，从兔耳动脉取血提取所述I-PRF的方法具体包括以下步骤：选取6月龄健康雄性新西兰兔，将兔固定后，用碘伏棉球消毒兔耳，采用动脉采血管进行兔耳中央动脉采血，采血40mL，将离心管冰浴5min，然后迅速转移至C-Tech离心机，选择I-PRF模式，在920rpm条件下室温离心7min，体系分层，下层为呈红色液体的红细胞层(BC)，上层为呈黄色液体的I-PRF。本发明所述I-PRF在室温条件下约5～10min后转化为淡黄色凝胶，由于I-PRF凝固时间短，且自然凝固容易堵塞支架基体孔隙，因此采用吹打法进行负载；若直接静置条件下浸泡负载会堵塞支架的孔隙，使得细胞无法黏附支架的孔壁，营养物质、代谢废物及细胞信号因子无法通过支架内部进行交流，而且若直接静置条件下浸泡负载后冻干，培养细胞加入的培养基会导致海绵状的I-PRF塌陷，同样会阻塞支架，影响细胞生长与交流。
得到所述支架基体以及含有I-PRF和SDF-1的混合液后，本发明将所述支架基体浸泡于所述混合液中，采用吹打法使所述混合液呈泡沫状后依次进行成胶处理和冷冻干燥，得到骨组织工程支架。在本发明中，所述吹打法具体是采用枪头反复吹打使所述混合液完全呈现泡沫状并与所述支架基体充分接触，在支架基体上形成一层薄膜。在本发明中，所述成胶处理的温度优选为37～50℃，更优选为37～42℃；时间优选为10min～24h，更优选为2～5h。在本发明中，所述成胶处理的过程中，SDF-1和I-PRF包裹在支架基体表面，再经后续冷冻干燥即可制备得到既有成骨作用，又有促进软组织再生作用及早期血管化作用的骨组织工程支架。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-50～-10℃，更优选为-50～-35℃；时间优选为24～72h，更优选为40～48h。在本发明中，所述冷冻干燥过程中，SDF-1大分子颗粒固定于I-PRF凝胶中，I-PRF凝胶冻干后形成的三维立体结构的粗糙孔隙不仅有利于增大支架的表面积，还有利于细胞的黏附生长。
本发明提供的骨组织工程支架的成分和结构与天然松质骨相仿，通过3D打印的加工方式，能够制备与患者下颌骨松质骨(如牙槽骨)形态、大小一致的个性化支架基体，有较好的生物相容性及促成骨特性；之后采用吹打法同时负载I-PRF和SDF-1，冷冻干燥后所得骨组织工程支架可维持支架基体的三周期极小曲面三维多孔结构，I-PRF和SDF-1在支架基体表面形成致密均匀的凝胶结构，有利于细胞黏附于骨组织工程支架，其三维结构能够为细胞提供良好的生长空间，促进细胞增殖，又可以利于SDF-1紧密结合持续释放，更利于细胞生长，最终促进缺损处骨组织生长与成骨。总之，本发明所述骨组织工程支架具有良好的骨传导、骨生成活性，能够促进缺损处骨组织再生。
本发明提供了上述技术方案所述骨组织工程支架或上述技术方案所述制备方法制备得到的骨组织工程支架在制备骨组织修复材料中的应用。在本发明中，所述骨组织修复材料优选为全身松质骨缺损修复材料，所述全身松质骨缺损修复材料优选包括牙槽骨修复材料、颅顶骨修复材料或股骨修复材料。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
在本实施例中，支架基体被设计为底面直径为8mm、厚度为3mm的圆柱体，孔隙率为70％的TPMS结构，孔壁厚度为200μm(TPMS表面结构由大连理工大学王胜法教授课题组使用MatlabR2020a软件设计而成)；经Magics21.0软件导出STL数字模型文件；使用基于数字激光加工技术的3D打印机(AUTOCERA-M，北京十维科技有限公司，中国)，以TPMS结构导出后的STL数字模型文件为蓝本，将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合后所得混合原料进行3D打印，得到支架坯体；其中，所述混合原料为光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石；所述3D打印的条件包括：光波波长为405nm，光斑尺寸为50μm，曝光时间为6s，曝光功率为30mW/cm2，层厚为25μm；将所述支架坯体置于乙醇中进行超声洗涤30s，以2℃/min的升温速率在1350℃条件下保温烧结3h，得到孔隙率为70％的支架基体，记为T支架；
选取6月龄健康雄性新西兰兔，将兔固定后，用碘伏棉球消毒兔耳，采用动脉采血管进行兔耳中央动脉采血，采血40mL，将离心管冰浴5min，然后迅速转移至C-Tech离心机，选择I-PRF模式，在920rpm条件下室温离心7min，体系分层(如图1所示)，下层为呈红色液体的红细胞层，上层为呈黄色液体的I-PRF(未凝固时称为I-PRF原液，待凝固后称为I-PRF凝胶)；
将所述I-PRF原液加入到DMEM培养基中，得到I-PRF溶液，所述I-PRF溶液中I-PRF的体积分数为5％；将SDF-1(品牌：安迪(R&D)，型号：MAB350-SP)加入到PBS缓冲液(7.35～7.45)中，得到SDF-1溶液，所述SDF-1溶液中SDF-1的浓度为100ng/mL；将200μL的I-PRF溶液、500μL的SDF-1溶液以及300μL的DMEM培养基混合，得到1mL混合溶液；用1mL无菌枪头吸取所述混合液至装有支架基体的48孔板中，反复吹打直至呈现泡沫状并与所述支架基体充分接触，在支架基体上形成一层薄膜，之后放入37℃的培养箱中进行成胶处理2h，成胶处理完成后将所得支架在-50℃条件下冷冻干燥48h，得到同时负载SDF-1和I-PRF的TPMS骨组织工程支架，记为SIT支架。
测试例
对实施例1制备的T支架(作为空白对照)以及SIT支架进行扫描电镜观察及细胞实验验证，具体如下：
1、扫描电镜观察：首先将支架喷金处理后，于15kV加速电压条件下在扫描电显镜下观察样品的微观形貌。
2、MC3T3细胞增殖检测：将MC3T3细胞以1×105/孔的密度接种于48孔板中的支架上，置于37℃、体积分数5％CO2的培养箱中，共设1、2、3天3个时间点，每孔细胞每个时间点设5个复孔。在本实验设定的每个时间点取出，向每孔加入100μLCCK-8溶液后置于培养箱孵育3h后，将48孔板中的CCK-8溶液转移到96孔板中，使用酶标仪在450nm条件下检测其吸光度，并记录各孔OD值；实验重复三次。
3、MC3T3细胞黏附检测：将MC3T3细胞与支架共培养24h后，将培养基从孔板中吸出，PBS润洗3次，每孔加入1mLCalcein-AM/PI混合染色液，置于37℃、体积分数5％CO2环境中避光孵育30min；PBS冲洗后将支架移至在倒置荧光显微镜下观察。
图2为不同浓度的I-PRF溶液的细胞相容实验CCK-8结果图，由图2可知，体积浓度为5％的I-PRF溶液细胞增殖效果最佳。
图3为不同浓度的I-PRF溶液的细胞相容实验活死染色结果图，由图3可知，体积浓度为5％的细胞黏附及增殖效果最好。
图4为T支架和SIT支架的数码照片，左侧为T支架的数码照片，右侧为SIT支架的数码照片。由图4可知，I-PRF凝胶黏附于支架基体上起到连接及支撑作用，且I-PRF凝胶能够包裹SDF-1，使SDF-1实现缓释。
图5为400X扫描电镜下T支架和SIT支架的微观形貌图，左侧为T支架的微观形貌图，右侧为SIT支架的微观形貌图。由图5可知，三周期极小曲面3D打印支架呈现曲面多孔状结构，孔径均匀分布，孔壁粗糙，微孔之间相互交通。
图6为细胞黏附于T支架和SIT支架的微观形貌图，左侧为细胞黏附于T支架的微观形貌图，右侧为细胞黏附于SIT支架的微观形貌图。由图6可知，MC3T3细胞紧密黏附于SIT支架表面，呈长梭形。
图7为T支架和SIT支架的细胞增殖效果图，由图7可知，SIT支架无细胞毒性，且有利于细胞增殖。
图8为细胞黏附于T支架和SIT支架的荧光染色结果图，左侧为细胞黏附于T支架的荧光染色结果图，右侧为细胞黏附于SIT支架的荧光染色结果图。由图8可知，细胞黏附于SIT支架孔壁及孔隙中填塞的凝胶表面，细胞状态良好。
总之，通过电镜观察证实SIT支架的表观形貌及合适的孔隙率有利于细胞黏附，细胞实验证实SIT支架生物学性能良好，有利于细胞黏附、增殖、生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种骨组织工程支架，包括支架基体以及负载于所述支架上的可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1，所述支架基体为具有三周期极小曲面仿生结构的β-磷酸三钙多孔陶瓷骨支架；
所述骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
提供含有可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1的混合液；
将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合，得到混合原料；将所述混合原料依次进行3D打印和烧结，得到支架基体；
将支架基体浸泡于所述混合液中，采用吹打法使所述混合液呈泡沫状后依次进行成胶处理和冷冻干燥，得到骨组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的骨组织工程支架，其特征在于，所述支架基体的孔隙率为40～70％。
3.权利要求1或2所述骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
提供含有可注射型富血小板纤维蛋白和基质细胞衍生因子1的混合液；
将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合，得到混合原料；将所述混合原料依次进行3D打印和烧结，得到支架基体；
将支架基体浸泡于所述混合液中，采用吹打法使所述混合液呈泡沫状后依次进行成胶处理和冷冻干燥，得到骨组织工程支架。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合液中可注射型富血小板纤维蛋白的体积分数为1～20％，基质细胞衍生因子1的浓度为50～400ng/mL。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述混合液的溶剂包括PBS缓冲液、生理盐水和DMEM培养基中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述成胶处理的温度为37～50℃，时间为10min～24h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为-50～-10℃，时间为24～72h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述支架基体的制备方法，包括以下步骤：
将光固化树脂单体、β-磷酸三钙与羟基磷灰石混合，得到混合原料；
将所述混合原料依次进行3D打印和烧结，得到支架基体。
9.权利要求1或2所述的骨组织工程支架或权利要求3～8任一项所述制备方法制备得到的骨组织工程支架在制备骨组织修复材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨组织修复材料为全身松质骨缺损修复材料。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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