CN115887765A - 一种3D打印GelMA乳液多级孔支架及其制备方法与应用 - Google Patents
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- Manufacture Of Porous Articles, And Recovery And Treatment Of Waste Products (AREA)
Abstract
本发明公开了一种3D打印GelMA乳液多级孔支架及其制备方法与应用，该制备方法以甲基丙烯酸改性明胶(GelMA)作为乳液稳定剂，水为连续相，将透明质酸接枝多巴胺(HADA)、光引发剂溶于连续相中，十二烷为分散油相，将油相加入水相中，高速搅拌得到稳定的GelMA水包油乳液，以GelMA水包油乳液为墨水，采用挤出式3D打印并进行紫外光照射引发聚合获得三维多孔乳液支架，梯度酒精浸泡除去油相，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。本发明制备的GelMA乳液多级孔支架具有均一的大孔和相互连通的微孔结构、结构优异，具有优良的生物相容性和生物可降解性，该水凝胶支架在生物医药及组织工程领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种3D打印GelMA乳液多级孔支架及其制备方法与应用。
背景技术
要实现优异的仿生功能，理想的生物支架材料应该具有高度层次化的多级孔，因为不同的孔径发挥着不同的重要作用，例如，大孔有利于细胞渗透和营养流动等，微孔有利于细胞黏附和细胞内信号转导等。3D打印技术通过3D打印机将生物材料逐层堆积成三维实体支架，可以实现数字模型向实物的直接转变，并且能够按照实际需求对支架大孔的孔径、孔隙率和孔互连性等进行精确的控制，在宏观尺度上实现个性化定制。但是由于分辨率和打印效率的限制，很难仅通过3D打印实现多级孔结构。
乳液模板法是制备多孔支架的一种便捷且高效的方法，通常是选取合适的连续相、分散相和乳化剂，通过搅拌或剪切制备得到性能稳定的乳液，将连续相通过聚合或溶剂挥发的方法进行固定，再进行处理除去分散相模板，得到具有多孔结构的聚合物支架。通常选择一些化学合成表面活性剂作为乳化剂，但其一般具有生物毒性，且难以完全去除，限制了支架在生物医学领域的应用。为了使制备的乳液无生物毒性，选择使用生物相容性良好的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)作为乳化剂制备水包油(oil-in-water)乳液模板，该乳液制备快速，所形成的多孔支架孔径灵活可调控，同时易于进行界面功能化。GelMA水包油乳液具有优异的稳定性，同时适宜的粘度和流变性使其具有良好的3D适印性。将乳液模板法引入3D打印，在3D打印大孔结构的基础上引入微孔结构，从而实现便捷且高效地制备具有多级孔的支架材料，在组织工程等生物医学领域具有良好的应用前景。
本发明以生物相容性材料甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)作为乳化剂制备水包油(oil-in-water)乳液模板，同时选用透明质酸接枝多巴胺(HADA)辅助增强乳液稳定性，采用3D打印结合乳液模板法构建了多级孔支架。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，该制备方法以甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)为乳化剂的水包油乳液墨水，通过3D打印结合乳液模板法，在紫外光照射下得到一种具有多级孔结构的3D打印GelMA乳液多级孔支架。
本发明的第二目的在于提供上述制备方法制备得到的3D打印GelMA乳液多级孔支架。
本发明的第三目的在于提供上述3D打印GelMA乳液多级孔支架的应用。
本发明的首要目的通过下述技术方案实现：
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)水凝胶预聚液的配置：将制备好的GelMA溶液和HADA溶液混合搅拌均匀，制成水凝胶预聚液；
(2)将步骤(1)制得的水凝胶预聚液中加入光引发剂，避光搅拌溶解，得到光引发剂掺杂水凝胶预聚液混合溶液；
(3)将步骤(2)得到的光引发剂掺杂水凝胶预聚液混合溶液作为水相加入十二烷油相中，高速分散、搅拌，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(4)将步骤(3)得到的GelMA水包油乳液作为墨水，通过挤出式3D打印并进行紫外光照射使GelMA乳液支架在常温下聚合，经过梯度酒精浸泡除去油相，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
优选地，步骤(1)中所述GelMA溶液质量浓度为5～15w/v％，接枝率为65～90％；HADA质量浓度为1～3w/v％。
优选地，步骤(1)中所述搅拌反应温度为30～50℃，搅拌时间为0.5～1h，搅拌速度为100～300rpm。
优选地，步骤(2)中所述光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)中的至少一种；所述光引发剂的质量浓度为0.5～1.5w/v％。
优选地，步骤(2)中所述溶解温度为30～50℃，搅拌时间为10～30min，搅拌速度为100～300rpm。
优选地，步骤(3)中水相和油相的体积比为1：1～1：3。
优选地，步骤(3)中水相和油相的体积比为1：2。
优选地，步骤(4)中所述采用挤出式3D打印工艺条件为：反应温度为23～25℃，挤压气压为0.1～0.45MPa，挤压针头内径为250～400μm，打印速度为3-10mm/s。
优选地，步骤(4)中所述紫外光照射时间为1～5min，紫外光波长为365nm，紫外光光强为10～300mw/cm2。
优选地，步骤(4)中所述梯度酒精浸泡具体步骤为：通过体积分数为50％、75％和100％酒精依次浸泡，浸泡时间为12-48h，浸泡温度25～37℃。
本发明的第二目的通过下述技术方案实现：
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架，由上述制备方法制备得到。
本发明的第三目的通过下述技术方案实现：
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架在组织工程生物医学领域的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下技术优点及有益效果：
(1)本发明采用的GelMA水包油乳液有很高的稳定性，能够在聚合反应中维持乳液的基本结构，利于3D打印GelMA乳液多级孔支架中互连微孔的形成；
(2)本发明采用的HADA溶液对于GelMA水包油乳液的稳定具有促进作用，利于3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备；
(3)本发明在制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架中，GelMA水包油乳液粘度和流变性以及多级孔支架微孔孔径等性质可以通过调节HADA的浓度和水相油相体积比灵活变化，以满足各种应用的需要；
(4)本发明制备的GelMA乳液制备快速，且易于进行界面功能化，以满足各种应用的需要；
(5)本发明制备的GelMA水包油乳液具有适宜的粘度和流变性，其3D适印性良好，打印精度高，可个性化构建不同孔结构及外形的支架模型，即可根据缺失或损伤组织的结构与外形构建个性化的支架打印模型，匹配不同患者的临床需求，从而实现组织工程领域个性化有效治疗；
(6)本发明制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架具有良好的开放大孔和互连微孔结构，孔隙率较高，同时具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此在组织工程等生物医学领域具有较好的应用前景；
(7)本发明制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架制备工艺简单易行，原材料成本低，容易批量生产，有较大应用推广价值。
附图说明
图1为实施例3、4制备的GelMA水包油乳液的实物照片；
图2A分别为实施例3制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架的实物照片；图2B为对比例1制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架的实物照片；图2C为对比例2制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架的实物照片；
图3为实施例4制备的3D打印GelMA乳液多级孔支架内部微孔结构的扫描电镜图；
图4为实施例3中干细胞在GelMA乳液多级孔支架上培养5天的细胞活性效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步具体描述，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚，但实施例仅是范例性质的，并不对本发明的范围构成任何限制。
以下实施例所采用的原料来源说明：明胶、甲基丙烯酸酐、I2959、盐酸多巴胺均采购自Sigma-Aldrich公司，十二烷采购自Aladdin，透明质酸钠采购自源叶生物。
实施例1
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为10w/v％的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液1mL；
(2)在步骤(1)中加入浓度为1w/v％的HADA溶液，50℃，300rpm下搅拌0.5～1h；
(3)在步骤(2)所得混合溶液中加入浓度为1w/v％光引发剂I2959，避光搅拌分散10～30min；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入2mL十二烷，使用高速分散均质机在16000rpm下强烈搅拌2min，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(5)将步骤(4)所得的GelMA水包油乳液转移至配备有微型针头(内径260μm)气动挤出式3D打印机针筒内，设定打印速度为10mm/s，打印气压为0.1MPa，温度为25℃，根据预先设计的圆柱形(d＝12mm)支架模型运动轨迹打印，再经50mw/cm2光强的紫外灯照射1min，引发聚合得到三维多孔乳液支架；
(6)将步骤(5)所得三维多孔乳液支架依次浸泡在50mL体积分数为50％、75％和100％酒精中，每个浓度浸泡8小时，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
实施例2
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为10w/v％的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液1mL；
(2)在步骤(1)中加入浓度为2w/v％的HADA溶液，50℃，300rpm下搅拌0.5～1h；
(3)在步骤(2)所得混合溶液中加入浓度为1w/v％光引发剂I2959，避光搅拌分散10～30min；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入2mL十二烷，使用高速分散均质机在16000rpm下强烈搅拌2min，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(5)将步骤(4)所得的GelMA水包油乳液转移至配备有微型针头(内径260μm)气动挤出式3D打印机针筒内，设定打印速度为10mm/s，打印气压为0.2MPa，温度为25℃，根据预先设计的圆柱形(d＝12mm)支架模型运动轨迹打印，再经50mw/cm2光强的紫外灯照射1min，引发聚合得到三维多孔乳液支架；
(6)将步骤(5)所得三维多孔乳液支架依次浸泡在50mL体积分数为50％、75％和100％酒精中，每个浓度浸泡8小时，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
实施例3
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为10w/v％的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液1mL；
(2)在步骤(1)中加入浓度为3w/v％的HADA溶液，50℃，300rpm下搅拌0.5～1h；
(3)在步骤(2)所得混合溶液中加入浓度为1w/v％光引发剂I2959，避光搅拌10～30min；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入2mL十二烷，使用高速分散均质机在16000rpm下强烈搅拌2min，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(5)将步骤(4)所得的GelMA水包油乳液转移至配备有微型针头(内径260μm)气动挤出式3D打印机针筒内，设定打印速度为10mm/s，打印气压为0.3MPa，温度为25℃，根据预先设计的圆柱形(d＝10mm)支架模型运动轨迹打印，再经50mw/cm2光强的紫外灯照射1min，引发聚合得到三维多孔乳液支架；
(6)将步骤(5)所得三维多孔乳液支架依次浸泡在50mL体积分数为50％、75％和100％酒精中，每个浓度浸泡8小时，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
实施例4
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为10w/v％的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液1mL；
(2)在步骤(1)中加入浓度为3w/v％的HADA溶液，50℃，300rpm下搅拌0.5～1h；
(3)在步骤(2)所得混合溶液中加入浓度为1w/v％光引发剂I2959，避光搅拌分散10～30min；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入3mL十二烷，使用高速分散均质机在16000rpm下强烈搅拌2min，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(5)将步骤(4)所得的GelMA水包油乳液转移至配备有微型针头(内径260μm)气动挤出式3D打印机针筒内，设定打印速度为10mm/s，打印气压为0.35MPa，温度为25℃，根据预先设计的圆柱形(d＝10mm)支架模型运动轨迹打印，再经50mw/cm2光强的紫外灯照射1min，引发聚合得到三维多孔乳液支架；
(6)将步骤(5)所得三维多孔乳液支架依次浸泡在50mL体积分数为50％、75％和100％酒精中，每个浓度浸泡8小时，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
对比例1
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为10w/v％的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液1mL；
(2)在步骤(1)中加入浓度为3w/v％的HADA溶液，50℃，300rpm下搅拌0.5～1h；
(3)在步骤(2)所得混合溶液中加入浓度为1w/v％光引发剂I2959，避光搅拌分散10～30min；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入3mL十二烷，使用高速分散均质机在16000rpm下强烈搅拌2min，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(5)将步骤(4)所得的GelMA水包油乳液转移至配备有微型针头(内径260μm)气动挤出式3D打印机针筒内，设定打印速度为10.3mm/s，打印气压为0.35MPa，温度为25℃，根据预先设计的圆柱形(d＝10mm)支架模型运动轨迹打印，再经50mw/cm2光强的紫外灯照射1min，引发聚合得到三维多孔乳液支架；
(6)将步骤(5)所得三维多孔乳液支架依次浸泡在50mL体积分数为50％、75％和100％酒精中，每个浓度浸泡8小时，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
对比例2
一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制浓度为10w/v％的甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液1mL；
(2)在步骤(1)中加入浓度为3w/v％的HADA溶液，50℃，300rpm下搅拌0.5～1h；
(3)在步骤(2)所得混合溶液中加入浓度为1w/v％光引发剂I2959，避光搅拌分散10～30min；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入3mL十二烷，使用高速分散均质机在16000rpm下强烈搅拌2min，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(5)将步骤(4)所得的GelMA水包油乳液转移至配备有微型针头(内径260μm)气动挤出式3D打印机针筒内，设定打印速度为10mm/s，打印气压为0.6MPa，温度为25℃，根据预先设计的圆柱形(d＝10mm)支架模型运动轨迹打印，再经50mw/cm2光强的紫外灯照射1min，引发聚合得到三维多孔乳液支架；
(6)将步骤(5)所得三维多孔乳液支架依次浸泡在50mL体积分数为50％、75％和100％酒精中，每个浓度浸泡8小时，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
实施例1至4以及对比例1至2中GelMA可以通过以下方法制备：
(1)称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸盐缓冲液，密封容器，在40℃水浴下以300rpm匀速搅拌30min至明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
(2)在步骤(1)所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酐(MA)，MA的滴加速度控制为3-4s一滴，滴加完毕后升温至50℃，反应5h；
(3)将步骤(2)所得溶液倒入540mL磷酸盐缓冲液中终止反应，50℃下静置过夜混合溶液；
(4)除去步骤(3)中混合溶液中的沉淀物，用去离子水透析反应液5d，每天换水3次，透析袋截留分子量为14000，随后将透析袋中液体冻干，得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
实施例1至4以及对比例1至2中HADA可以通过以下方法制备：
(1)称取0.4g透明质酸钠于100mL圆底烧瓶中，加入50mLMES缓冲液(0.05M，pH5.5)，密封容器，在50℃水浴下以300rpm匀速搅拌至透明质酸钠完全溶解；
(2)待步骤(1)所得溶液降至室温，依次加入192mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(DEC)和116mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下以300rpm搅拌，同时通N2 30min；
(3)称取0.4g盐酸多巴胺于棕色玻璃瓶中，加入2mL MES缓冲液，震荡至完全溶解，通N2 5min以除去O2，用注射器加入步骤(2)溶液中，继续通N2，避光反应1h；
(4)室温下以300rpm搅拌，继续反应24h，然后用pH为5-6的去离子水透析反应液3d，再用去离子水透析1d，每天换3次水，透析袋截留分子量为14000，随后将透析袋中液体冻干，得到泡沫状固体产物HADA，-20℃下密封保存备用。
结论：
(1)图1为实施例3、4制备的GelMA水包油乳液的实物照片，从图1可知，以GelMA为乳化剂制备的水包油乳液呈乳白色凝胶态，未发生破乳及分相，具有良好的稳定性。
(2)从图2A至图2C可知，实施例3按照优选打印参数对乳液墨水进行打印，所得到的支架孔隙结构均一，细丝宽度一致，打印精度高；对比例1打印速度大于优选范围，出现明显的断丝现象，支架缺陷明显；对比例2打印气压大于优选范围，出丝不均匀且宽度过大，宏孔结构缺失。综上可知，按照优选打印参数对GelMA水包油乳液进行3D打印，可实现高精度打印，反之不然。
(3)从图3可知，凝胶支架具有互连微孔结构，孔径分布相对均匀。
(4)从图4可知，GelMA乳液多级孔支架表面无明显死细胞，说明支架具有良好的生物相容性。
上述实施例1至4为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)水凝胶预聚液的配置：将制备好的GelMA溶液和HADA溶液混合搅拌均匀，制成水凝胶预聚液；
(2)将步骤(1)制得的水凝胶预聚液中加入光引发剂，避光搅拌溶解，得到光引发剂掺杂水凝胶预聚液混合溶液；
(3)将步骤(2)得到的光引发剂掺杂水凝胶预聚液混合溶液作为水相加入十二烷油相中，高速分散、搅拌，得到稳定的GelMA水包油乳液；
(4)将步骤(3)得到的GelMA水包油乳液作为墨水，通过挤出式3D打印并进行紫外光照射使GelMA乳液支架在常温下聚合，经过梯度酒精浸泡除去油相，得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
2.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述GelMA溶液质量浓度为5～15w/v％，接枝率为65～90％；HADA质量浓度为1～3w/v％。
3.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述搅拌反应温度为30～50℃，搅拌时间为0.5～1h，搅拌速度为100～300rpm。
4.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)中的至少一种；所述光引发剂的质量浓度为0.5～1.5w/v％。
5.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶解温度为30～50℃，搅拌时间为10～30min，搅拌速度为100～300rpm。
6.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中水相和油相的体积比为1：1～1：3。
7.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述采用挤出式3D打印工艺条件为：反应温度为23～25℃，挤压气压为0.1～0.45MPa，挤压针头内径为250～400μm，打印速度为3-10mm/s；步骤(4)中所述紫外光照射时间为1～5min，紫外光波长为365nm，紫外光光强为10～300mw/cm2。
8.根据权利要求1所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述梯度酒精浸泡具体步骤为：通过体积分数为50％、75％和100％酒精依次浸泡，浸泡时间为12-48h，浸泡温度25～37℃。
9.一种根据权利要求1至8任一项所述的制备方法制备得到3D打印GelMA乳液多级孔支架。
10.一种权利要求9所述的3D打印GelMA乳液多级孔支架在组织工程生物医学领域的应用。
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| CN202211444596.5A CN115887765A (zh) | 2022-11-18 | 2022-11-18 | 一种3D打印GelMA乳液多级孔支架及其制备方法与应用 |
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| CN202211444596.5A CN115887765A (zh) | 2022-11-18 | 2022-11-18 | 一种3D打印GelMA乳液多级孔支架及其制备方法与应用 |
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