CN103948963B - 一种适用于人体脏器构建用的组织工程支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适于人体脏器构建用的组织工程支架，其孔径为5～200μm，孔贯通性良好，具有适当的降解性，能适合细胞在其中的生长。本发明还公开了所述适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，该制备方法是先将丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液配成混合溶液，然后将混合溶液转化成凝胶状态，再经过冷冻干燥、放置回软、高压蒸汽处理过程即得到组织工程支架，通过调整原料丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液之间的比例，或者改变工艺条件可以控制得到的组织工程支架的孔径大小和降解性能，使其满足对人体脏器构建用组织工程支架的要求；该制备方法具有反应条件温和、工艺简单、原料成本低廉的优点，适于工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明属于生物材料与组织工程技术领域，特别涉及一种适于人体脏器构建用的组织工程支架及其制备方法。
背景技术
组织工程是当今医学领域研究热点之一，它的诞生为再造各种有功能的组织或器官带来了希望。文献报道的手术治疗方法常以牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损，不仅效果不佳，而且并发症多。随着生活水平的提高，人们也越来越重视自身的健康安全，因而对组织工程支架的研究也愈加重视。在全世界的范围内，开发一种理想的生物支架是组织工程领域迫切需要解决的难题，也已成为当前的研究热点。
组织工程支架，是一种可与细胞、组织生长相匹配的可降解性生物材料制成的支架，它们完全影响着细胞的活性和功能及器官组织的血管化，极为重要。目前的组织工程支架主要有两大类，即天然细胞外基质支架和人工合成高分子聚合物支架。
天然细胞外基质材料包括壳聚糖、海藻酸盐、胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸等，如将骨髓间充质干细胞放入海藻盐酸支架里培养后，这些细胞被诱导生长成为肝细胞，显示出一些肝脏特有的标记和功能，表达编码白蛋白、甲胎蛋白、连接蛋白32和CYP7A1的基因；也有利用壳聚糖、明胶、透明质酸、胶原和聚乙撑二氧噻吩（PEDOT）等物质为原料制造出许多不同类型的肝脏组织工程支架等，并将取自肝癌的GS5细胞种植于这些支架上，培养后发现当明胶与壳聚糖、各种添加物的比例适当时培养的细胞其生命活力、粘附和繁殖的状态都很好；还有一种思路是创造一种能够为细胞提供类人体微环境的功能性基质和支架，如将脱细胞溶液灌注于大鼠的天然肝中，以除去肝组织中的细胞组分，得到肝细胞外基质等；通过冷化学去细胞化处理法处理小鼠的整个肝脏得到去细胞肝支架（ALS），这种支架保留了原代肝中大部分细胞外基质的主要物质组分，维持了完好无损的血管框架结构。
人工合成支架主要是高分子聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乙酰内酯（PVLA）、聚ε-己内酯乙烷基乙烯基磷酸盐共聚物（PCLEEP）、聚ε-己内酯毫纤维支架上等，效果较好。如通过静电纺丝构建聚醚砜纳米纤维支架，然后进将其行等离子体处理，并在其表面涂上胶原蛋白等支架。
但是迄今为止开发的各类支架都存在着问题。天然材料类存在着成型性、成型后的力学性能差，其生物降解速率太快，与细胞生长状况不匹配，有些材料还有可能具有免疫原性等；合成材料力学性能好，但也存在着难以降解，与细胞生长速率不匹配，材料孔径大小、光滑程度不良，生物、组织相容性差等问题，部分天然-合成材料克服了一些问题，但是在成型、降解方面存在的问题也困扰着组织工程研究人员。特别如人体脏器组织用的支架，对随模具成型性、强力、伸长度、弹性、柔韧性，以及与细胞生长相匹配的降解性能等要求甚高。
因此，开发一种具有生物学信号转递、有贯通孔且孔径大小合适、降解也可调控、具有优秀生物相容性且力学性能非常合适的组织工程支架是亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种适于人体脏器构建用的组织工程支架，该组织工程支架具有力学性能优异，生物相容性好，降解性可控，成型性好，以及促细胞生长的优点。
本发明的另一个目的是提供一种所述人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，该制备方法具有反应条件温和，工艺简单，成本低廉，适于放大生产的优点。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，其特征在于，该制备方法是先将丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液配成混合溶液，然后将混合溶液转化成凝胶状态，再经过冷冻干燥、放置回软、高压蒸汽处理过程即得到组织工程支架。
作为优化，该制备方法具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为2.0～6.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，配成浓度为1.5～2.2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为40～50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，将步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液和壳聚糖溶液搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液搅拌30min，其中丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液的体积比为0.4～0.8:5～8:1；将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃±5℃，使混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料冷冻干燥，在室温下放置1h以上，高压蒸汽处理至少10min，干燥后即得到适于人体脏器构建用的组织工程支架。
作为优化，所述步骤（1）中丝胶蛋白粉末的制备方法为：将茧衣茧壳用醚类浸泡至少48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去蜡质；然后用醇类浸泡至少48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去部分有机物和杂质；再将洗干净的茧壳用蒸馏水煮沸6h，抽滤得到丝胶蛋白溶液，最后将丝胶蛋白溶液浓缩、冷冻干燥得到丝胶蛋白粉末。
作为优化，所述步骤（1）中的稀酸是浓度为0.1mol/L的盐酸或者醋酸。
作为优化，所述步骤（2）中高压蒸汽的温度为90～130℃，压力为0.1～0.5MPa。
本发明还提供一种适于人体脏器构建用的组织工程支架，采用上述制备方法得到，其孔径为5～200μm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明所得的丝胶蛋白/壳聚糖/甘油磷酸钠组织工程支架，孔径较为均匀、孔间贯通，热稳定性好，同时具备良好的生物相容性，降解可调控性及较好的成型性，可以用于人体脏器构建用组织工程支架材料。
（2）本发明将丝胶蛋白/壳聚糖/甘油磷酸钠的混合溶液置于任意模具中，使其从溶液转化成凝胶，再冷冻干燥，放置1h以上回软后，再经过高压蒸汽处理10min以上，在这个过程中，材料分子经过了构型构象的变化，最终形成了带有最匹配人体脏器培养的力学性能的组织工程支架，其力学性能如强力、伸长性、弹性、柔韧性等可控，可以满足人体脏器如尿道、肝脏、心脏、脾、肺、肾脏等的修复、重建、再生等对组织工程支架的要求，具有深远的学术意义和优越的应用价值，应用前景广阔。
（3）本发明的制备方法反应条件温和，工艺简单，原料成本低廉，适于放大生产；而且可根据需要调节物料配比从而调解支架的力学性能和降解时间等，得到满足相应性能的组织工程支架。
（4）本发明得到的组织工程支架具有孔径大小合适、降解可控的优点，通过调节丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液之间的比例，或者高压蒸汽处理的时间或温度，可以控制得到组织工程支架的孔径大小和降解性能，以适于不同的人体脏器对支架的需要。
附图说明
图1为实施例5制备的组织工程支架的外部形貌图。
图2为实施例1、2、5和7制备的组织工程支架的扫描电镜图。
图3为实施例3～6制备的组织工程支架的扫描电镜图。
图4为实施例1、2、5和7制备的组织工程支架的溶失率测试结果曲线图。
图5为实施例3～6制备的组织工程支架的溶失率测试结果曲线图。
图6为实施例5制备的组织工程支架的降解液以及浸提液对L929小鼠成纤维细胞毒性测试，使用倒置显微镜拍摄的L929细胞生长照片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
一、实施例
具体实施例时，所用的丝胶蛋白粉末采用以下方法制备：
将茧衣茧壳用异丙醚浸泡至少48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去蜡质；然后用无水乙醇浸泡至少48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去部分有机物和杂质；再将洗干净的茧壳用蒸馏水煮沸6h，抽滤得到丝胶蛋白溶液，最后将丝胶蛋白溶液浓缩、冷冻干燥得到丝胶蛋白粉末。
实施例1：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液5ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，使混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1d，再在室温（25℃）下放置3h，在121℃、0.1MPa下进行高压蒸汽处理20min，干燥即得到组织工程支架。
实施例2：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液6ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，使混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1.5d，再在室温（25℃）下放置3d，在121℃、0.1MPa下进行高压蒸汽处理20min，干燥后即得到组织工程支架。
实施例3：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液7ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1d，再在室温（25℃）下放置3d后，在115℃、0.1MPa下进行高压蒸汽处理30min，干燥后即得到组织工程支架。
实施例4：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液7ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1d，再在室温（25℃）下放置3d，在115℃、0.1MPa下进行高压蒸汽处理50min，即得到组织工程支架材料。
实施例5：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液7ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1d，再在室温27℃下放置3d，在121℃、0.1MPa下进行高压蒸汽处理25min，干燥后即得到组织工程支架。
实施例6：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液7ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1d，再在室温28℃下放置3d，在121℃、0.1MPa下高压蒸汽处理45min，干燥后即得到组织工程支架。
实施例7：
一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为5.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；
将壳聚糖溶解于浓度为0.1mol/L的稀盐酸溶液中，配成浓度为2%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，称取步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液0.68ml和壳聚糖溶液8ml搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液1ml，搅拌30min；
将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃，混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料于-20℃下放置2h、-80℃下放置24h、置于冷冻干燥机中冷冻干燥1d，再在室温（25℃）下放置3d，在121℃、0.1MPa下进行高压蒸汽处理45min，，即得到组织工程材料。
二、性能测试：
（1）外部形貌图：
图1为实施例5制备的组织工程支架的外部形貌体，由图中可以看出本发明得到的组织工程支架材料可以绕至直径为30mm的玻璃棒缠绕而不发生变形，其具有良好的柔韧性，可以满足人体脏器构建用组织工程支架的力学能性能要求，可以适用于组织器官如尿道、肝脏、心脏、脾、肺、肾脏等的修复、重建、再生等。
（2）扫描电镜测试：
测试实施例1、2、5、和7制备的组织工程支架的扫描电镜图，放大倍数为500倍，如图2，由图中可以看出本发明得到的该组织工程支架的孔径为5～200μm，孔径大小合适，贯通性好，适合细胞在其内部生长；通过调整丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液之间的比例可以调整最终组织工程支架的孔径大小，以适合不同的人体脏器对组织工程材料的需要。
测试实施例3～6制备的组织工程支架的扫描电镜，放大倍数为500倍，如图3所示，由图中可知高压蒸汽处理的温度和时间对孔径大小有重要的影响，当温度为121℃、处理时间为25min时得到的组织工程支架的孔大小更均匀。
（3）细胞毒性测试：
将实施例5制备的组织工程支架进行细胞毒性测试，测试结果如表1和2所示，其中表1为该组织工程支架降解液4天内的细胞毒性评分结果，表2为该组织工程支架不同浓度的浸提液4天内的细胞毒性评分结果。
由表1和2中可以看出，实施例1制备的组织工程支架的RGR评分等级为0级，其具有良好的生物相容性。
（4）溶失率测试：
测试实施例1、2、5和7制备的组织工程支架的溶失率，测试结果如图4所示，由图中可以看出：所得到的组织工程支架的溶失率随着时间的延长而增大；而且根据丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液之间的配比不同，组织工程支架表现出不同的溶失率，说明本发明得到的组织工程支架具有良好的降解性、同时降解速率具有较高的可控性。
测试实施例3～6制备的组织工程支架的溶失率，测试结果如图5所示，由图中可以看出：所得到的组织工程支架的溶失率与高压蒸汽处理的温度和时间有关，在开始3周内溶失率相差不大，但是从第3周开始，呈现出温度越低，时间越短，其溶失率越大的趋势。
（5）对L929小鼠成纤细胞毒性测试：
测试实施例5制备的组织工程支架对L929小鼠成纤细胞毒性测试，测试结果如图6所示，由图中可以看出L929小鼠成纤细胞在该组织工程支架浸提液中的生长性良好，二者具有良好的生物相容性，该组织工程支架可以适用于人体脏器如尿道、肝脏、心脏、脾、肺、肾脏等的修复、重建、再生等。
Claims (4)
1.一种适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，其特征在于，该制备方法是先将丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液配成混合溶液，然后将混合溶液转化成凝胶状态，再经过冷冻干燥、放置回软、高压蒸汽处理过程即得到适于人体脏器构建用的组织工程支架；具体包括以下步骤：
（1）将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为2.0～6.0%(W/V)的丝胶蛋白溶液；将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，配成浓度为1.5～2.2%(W/V)的壳聚糖溶液；将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为40～50%（W/V）的甘油磷酸钠溶液；
（2）在20℃以下，将步骤（1）得到的丝胶蛋白溶液和壳聚糖溶液搅拌混合均匀后，再逐滴加入步骤（1）得到的甘油磷酸钠溶液搅拌30min，其中丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液的体积比为0.4～0.8:5～8:1；将混合溶液置入模具中，控制模具温度为37℃±5℃，使混合溶液凝胶化成型；再将成型后的材料冷冻干燥，在室温下放置1h以上，高压蒸汽处理至少10min，干燥后即得到适于人体脏器构建用的组织工程支架；
所述高压蒸汽的温度为90～130℃，压力为0.1～0.5MPa。
2.根据权利要求1所述的适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中丝胶蛋白粉末的制备方法为：将茧衣茧壳用醚类浸泡至少48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去蜡质；然后用醇类浸泡至少48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去部分有机物和杂质；再将洗干净的茧壳用蒸馏水煮沸6h，抽滤得到丝胶蛋白溶液，最后将丝胶蛋白溶液浓缩、冷冻干燥得到丝胶蛋白粉末。
3.根据权利要求1所述的适于人体脏器构建用的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的稀酸是浓度为0.1mol/L的盐酸或者醋酸。
4.一种适于人体脏器构建用的组织工程支架，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的制备方法得到，其孔径为5～200μm。
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