CN115926198A - 可注射组织再生型填充剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可注射组织再生型填充剂及其制备方法，具体涉及一种能够光固化快速成型的可注射组织再生型填充剂及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种新型组织填充剂。该填充剂包括增稠溶剂和悬浮在增稠溶剂中的多孔微球；所述多孔微球是由水凝胶球堆砌而成，且具有独特的三维多孔结构，具备较好的生物相容性。该多孔微球独特的结构有利于细胞存活，并促进细胞向其内部迁移和增殖，从而诱导组织再生，还具有一定的调控细胞功能及命运的作用，在组织工程和医美领域具有重要应用价值。且其制备工艺较简单、制备条件温和、周期短、绿色环保、成本较低，具有很好的转化前景，可规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及可注射组织再生型填充剂及其制备方法，具体涉及一种能够光固化快速成型的可注射组织再生型填充剂及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。
背景技术
随着再生医学和微创临床治疗的快速发展，其中再生型组织填充材料是重要的研究领域之一。近日，国内外陆续上市了少女针、童颜针等几款高分子再生型组织填充剂，这也标志着医美领域已经由以注射玻尿酸为主的“填充时代”逐步进入以材料诱导组织更替的“再生时代”。所以，开发新一代再生型组织填充材料具有巨大临床需求及市场空间。
从组织填充材料的发展历史来看，主要分为三个阶段。第一阶段为以液体硅胶、金属、陶瓷、聚丙烯酰胺(PAAG)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为代表的生物惰性填充材料。这一类材料在体内不可降解，长时间在体内滞留容易形成不可逆的肉芽肿、结节等并发症，其中，PAAG由于较大的毒性已经被FDA和国家药监局禁止使用，因此这些材料已逐渐被市场淘汰；第二阶段是以胶原、透明质酸(玻尿酸)、琼脂糖等为代表的生物降解填充材料，这类材料维持填充效果时间较短，需要长时间持续使用才能长期保证效果。尤其以透明质酸为主的材料需要进行一系列的化学交联才能满足在体内起到长期填充的效果，这也间接带来了许多并发症，如结节、炎症反应、过敏性并发症等，而琼脂糖作为新兴产品还需观望。第三阶段就是以脱细胞真皮基质、聚己内酯(PCL)和聚左旋乳酸(PLLA)为基料开发的一系列再生型组织填充产品，由于这些产品都是近期才上市，目前还没有较多的临床数据来评估这些材料长期的安全性和有效性。但是从目前市场上统计的数据来看，这些再生材料的缺点就是填充效果较慢，前期需要羧甲基纤维素钠或者透明质酸作为过渡，其作用机理主要是通过物理刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白，从而达到组织填充的效果。
针对以上填充剂的共性问题，开发兼具安全性和高效性的新型组织填充材料具有重大意义，以改善产品带来的诸多并发症，同时提高组织填充的效率。进一步拓展其在生物医学领域中的应用，带动相关产品研发。
发明内容
针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种新型组织填充材料及其制备方法。
本发明可注射组织再生型填充剂，包括增稠溶剂和悬浮在增稠溶剂中的多孔微球；
所述多孔微球是由水凝胶球堆砌而成，且具有三维多孔结构，多孔微球的粒度为100～500μm；
所述三维多孔结构的孔径为微米级；
水凝胶球的粒度为50～50000nm；三维多孔结构的孔径为1～2000μm。
在本发明一个实施方式中，所述多孔微球由光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物为原料制备而成。
在一个具体的实施方式中，所述增稠溶剂包括增稠剂和水，所述增稠剂为透明质酸、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、壳聚糖中的任意一种；所述水为生理盐水、注射用水、超纯水等常用的任意一种。
本发明还提供本发明所述可注射组织再生型填充剂的制备方法。
本发明可注射组织再生型填充剂的制备方法，包括以下步骤：
a、将光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物共溶于溶剂，混匀后得到生物墨水；
b、利用3D打印系统，将步骤a所述生物墨水光固化成球形；
c、随后用溶剂洗脱以除去未交联的光固化生物材料单体、残留的光引发剂和游离的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，得到多孔微球；
d、将步骤c所述的多孔微球与增稠溶剂混匀，得到可注射组织再生型填充剂。
本发明一个实施方式中，所述光固化生物材料单体包括可光交联的蛋白质或多肽，所述光引发剂包括苯基-2，4，6-三甲基苯酰次膦酸锂、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，2,4,6(三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦中的至少一种；所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物优选普朗尼克F68。
优选的，所述光固化生物材料单体为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和甲基丙烯酸酐改性柞蚕丝蛋白(ASF-MA)中的至少一种。
在本发明的一个实施方式中，步骤a的生物墨水中，光固化生物材料单体的浓度为0.01～0.5g/mL，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度为0.01～0.6g/mL，光引发剂的浓度为0.001～0.1g/mL。
在本发明的一个实施方式中，步骤a的溶剂为去离子水、注射用水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖溶液、生理盐水溶液和细胞培养液的任意一种。
在本发明的一个实施方式中，步骤b中，多孔微球的形态和尺寸由3D打印系统中的图形模式决定，将图片模型导入3D打印系统中，同时将生物墨水放入含有硅胶膜的载玻片上，最后采用光源直接照射生物墨水使其固化成微球型。生物墨水固化时间可以根据固化情况进行调节，在本发明一个实施方式中，固化时间为3秒～40秒；所述光源的波长为200～1046nm，优选光源的波长为320～980nm。
在本发明的一个实施方式中，步骤c中，采用去离子水、注射用水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖溶液、生理盐水溶液或细胞培养基进行洗脱，洗脱的时间为1～24小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤d中，可注射组织再生型填充剂由多孔微球与适当的增稠溶剂混合而成，增稠溶剂的作用是保证在注射过程中多孔微球均匀悬浮。
在一个具体的实施方式中，增稠溶剂体积为多孔微球体积的40％～90％。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明所制备的可注射组织再生型填充剂，主要成分为多孔微球，该多孔微球具有独特的宏微纳跨尺度结构，具备较好的生物相容性，是一种新型可注射再生型组织填充材料。该多孔微球独特的结构有利于细胞存活，并促进细胞向其内部迁移和增殖，从而诱导组织再生，还具有一定的调控细胞功能及命运的作用，在组织工程和医美领域具有重要应用价值。
(2)本发明可注射组织再生型填充剂以GelMA、光引发剂和普朗尼克为基本原料，羧甲基纤维素钠为溶剂，通过“自组装-3D打印-洗脱-悬浮”的方法制备，其制备工艺较简单、制备条件温和、周期短、绿色环保、成本较低，具有很好的转化前景，可规模化生产。
附图说明
图1是实施例1中多孔微球的3D打印原理图。
图2是实施例1中多孔微球制备过程中3D打印所需的图片模型。
图3是实施例1中光固化多孔微球的光学显微镜图。
图4是实施例1中光固化多孔微球的扫描电镜图。
图5是实施例2中可注射组织再生型填充剂体外诱导大鼠成纤维细胞的胶原蛋白基因表达图。
图6是实施例3中可注射组织再生型填充剂体内注射后三周的组织解剖图。
图7是实施例3中可注射组织再生型填充剂体内注射后三周的Ⅰ型胶原蛋白免疫组化图。
具体实施方式
本发明可注射组织再生型填充剂，包括增稠溶剂和悬浮在增稠溶剂中的多孔微球；
所述多孔微球是由水凝胶球堆砌而成，且具有三维多孔结构，多孔微球的粒度为100～500μm；
所述三维多孔结构的孔径为微米级；
水凝胶球的粒度为50～50000nm；三维多孔结构的孔径为1～2000μm。
在一个具体的实施方式中，水凝胶球的粒度为50～10000nm；三维多孔结构的孔径为1～200μm。
本发明可注射组织再生型填充剂，具有独特的多孔微球结构，该微球特殊的多孔结构有助于营养物质的扩散并提供相对较高的表面积，增强细胞在微球内部的迁移，从而可促进成纤维细胞增殖和迁移并诱导其分泌大量胶原蛋白，实现组织填充效果。同时，体内分泌的大量金属蛋白酶可通过空隙与微球材料内部充分接触，可快速降解材料，避免过度炎症导致组织纤维化，防止过度增生产生硬结。以上特点表明该多孔微球诱导成纤维细胞分泌胶原蛋白的同时也在慢慢降解，待产生的胶原足够起到填充作用的时候，微球自身也完全降解。该多孔微球在组织填充等医美领域具有极大应用潜力。
在本发明一个实施方式中，所述多孔微球由光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物为原料制备而成。可制备不同尺寸、形状的多孔微球，并且可通过调节两种溶液的比例来控制纳米颗粒和微米颗粒的数量，用于额头、眼周、鼻骨等不同软组织部位的填充。
本领域常用的增稠溶液均适用于本发明，在一个具体的实施方式中，所述增稠溶剂包括增稠剂和水，所述增稠剂为羧甲基纤维素钠(CMC)、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖中的任意一种。
在一个具体的实施方式中，增稠剂优选为CMC，其工作体积为多孔微球体积的40％～90％。
本发明还提供本发明所述可注射组织再生型填充剂的制备方法。
本发明可注射组织再生型填充剂的制备方法，包括以下步骤：
a、将光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物共溶于溶剂，混匀后得到生物墨水；
b、利用3D打印系统，将步骤a所述生物墨水光固化成球形；
c、随后用溶剂洗脱以除去未交联的光固化生物材料单体、残留的光引发剂和游离的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，得到多孔微球；
d、将步骤c所述的多孔微球与增稠溶剂混匀，得到可注射组织再生型填充剂。
本发明可注射组织再生型填充剂的制备方法，以光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物为基本原料，通过“自组装-3D打印-洗脱-悬浮”的方法制备而成。该方法利用聚氧乙烯一聚氧丙烯一聚氧乙烯两亲性嵌段共聚物与光固化生物材料单体混合后发生相分离并驱动光固化生物材料单体自组装成微纳米液滴，然后在光引发剂的作用下经3D打印光固化后形成微纳米颗粒，最后经洗脱得到稳定的具有微结构的多孔微球，再与增稠剂充分混匀，得到可注射组织再生型填充剂。
所述光固化生物材料单体为本领域常用的可光交联的蛋白质或多肽，采用其他类的光固化材料单体，比如甲基丙烯酰化透明质酸，则无法很好的得到本发明的多孔结构。在本发明的实施方式中，所述光固化生物材料优选为GelMA和ASF-MA中的至少一种。
本发明使用的光引发剂可以采用本领域内所有含自由基的光引发剂，包括但不限于苯基-2，4，6-三甲基苯酰次膦酸锂、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2,4,6(三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦等。
聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，是一类新型的高分子非离子表面活性剂，在本发明一个优选的实施方式中，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物为F68。
在本发明的一个实施方式中，步骤a的生物墨水中，光固化生物材料单体的浓度为0.01～0.5g/mL，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度为0.01～0.6g/mL，光引发剂的浓度为0.001～0.1g/mL。
聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度对光固化多孔水凝胶材料的形成及其孔径尺寸有较大影响。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度过低，则所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物与光固化生物材料单体的生物墨水中不能发生自组装，则无法得到具有本发明所述光固化多孔水凝胶材料。而随着聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度增高，所得光固化水凝胶中的纳米颗粒轮廓形成越明显，且纳米颗粒堆砌形成的孔隙逐渐增大。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度过高时，生物墨水体系中局部聚合物浓度过高，最终形成异质结构，即形成含有部分微米级尺度的水凝胶球的光固化多孔水凝胶。在固定聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物和光固化生物材料单体的初始浓度，使之能自组装形成本发明所述光固化多孔水凝胶的基础上，继续增加嵌段共聚物溶液的体积时，会逐渐减弱水凝胶球之间的连接，最终形成单个分散的水凝胶球。
在本发明的一个实施方式中，步骤a和步骤c的溶剂为去离子水、注射用水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖溶液、生理盐水溶液和细胞培养液的任意一种。
在本发明的一个实施方式中，步骤a中，所述混匀为采用移液枪吹打混匀、涡旋混匀和搅拌混匀的至少一种。
步骤b为固化成型步骤，采用3D打印技术，将其制备成微球。具体的，可以采用以下步骤：在3D打印机的系统中，绘制若干个直径为500μm的圆形，每个圆形之间间隔一定距离，并排组成一个长方形的区域图形，将图形导入打印机对应的操作系统中；将步骤a所述的生物墨水放入含有硅胶膜的载玻片上，用图形经光固化成球形，随后洗脱以除去未交联的光固化生物材料单体、残留的光引发剂和游离的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，得到多孔微球；所述光源的波长在200～1046nm之间，优选光源的波长在320～980nm之间。
常用光固化使材料成型的技术均适用于本发明。
在本发明的一个实施方式中，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、光引发剂和光固化生物材料单体的生物墨水需经过3D打印后在光源照射下进行光固化成型。
在本发明的一个实施方式中，步骤b中，微球的形态和尺寸由3D打印系统中的图形模式决定，而图形模式可根据需求进行个性化定制；随后将图片模型导入3D打印系统中，同时将生物墨水放入含有硅胶膜的载玻片上，微球的高度由载玻片上的硅胶膜决定，最后采用紫外光或可见光直接照射生物墨水使其固化成微球型。
生物墨水固化时间可以根据固化情况进行调节，在本发明一个实施方式中，固化时间为3秒～40秒。
步骤c的洗脱可以采用本领域常规洗脱方法，在本发明的一个实施方式中，采用去离子水、注射用水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖溶液、生理盐水溶液或细胞培养基进行洗脱，洗脱的时间为1～24小时。
步骤d中，所述增稠剂为羧甲基纤维素钠、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖中的任意一种。增稠溶剂由增稠剂原液经过适当的稀释而成，增稠溶剂的适当浓度可维持多孔微球自然均匀的悬浮。在本发明的一个实施方式中，所述增稠溶剂的体积为多孔微球体积的40％～90％。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
(1)在样品瓶中先后加入一定量的光引发剂(LAP)和去离子水，配置质量体积百分浓度为0.7％(0.007g/mL)的LAP溶液。向该LAP溶液中加入一定量的GelMA，随后将样品瓶置于37℃至GelMA完全溶解，得到质量体积百分浓度为0.15g/mL的GelMA溶液；
(2)在样品瓶中先后加入1.0g的F68和5.0mL的去离子水，样品瓶置于4℃至F68完全溶解，得到质量体积百分浓度为0.2g/mL的F68溶液；
(3)从步骤1所述的GelMA溶液中取2mL置于样品瓶，加入1ml步骤2所述的F68溶液，机械搅拌1分钟后得到F68初始质量体积百分浓度为20％的GelMA-F68生物墨水；
(4)将绘制好的图片导入3D打印机操作系统；
(5)将2mL步骤3所述的GelMA-F68生物墨水置于覆盖有硅胶膜的载玻片上，其中生物墨水所在区域用厚度为0.1mm的硅胶膜隔开，在所述厚度为0.1mm的硅胶膜上方放置洁净盖玻片，经3D打印机在波长为405nm的近紫外光下照射5秒，得到光固化多孔微球，用去离子水对所述光固化多孔微球洗涤3次，每次50分钟，以除去未交联的GelMA、光引发剂和游离的F68；
(6)将洗涤完的多孔微球转移至生理盐水溶液中，充分混匀。光学显微镜下观察其结构(图2)，随后取部分样品拿去做扫描电镜，其超微结构如图3所示。
图2给出了多孔微球3D打印所需的图片模型，可根据需求调整图片中的球形大小及间距，从而定制个性化微球。
图3给出了多孔微球在光学显微镜下的形态，结果显示，多孔微球的直径在500μm左右，微球边缘有纳米级胶球。
图4给出了多孔微球的扫描电子显微镜下的形态，结果显示，多孔微球由若干个微纳米级胶球堆砌而成。
实施例2
(1)在样品瓶中先后加入一定量的光引发剂(LAP)和去离子水，配置质量体积百分浓度为0.7％(0.007g/mL)的LAP溶液。向该LAP溶液中加入一定量的GelMA，随后将样品瓶置于37℃至GelMA完全溶解，得到质量体积百分浓度为0.15g/mL的GelMA溶液；
(2)在样品瓶中加入1.0g的F68和5.0mL的去离子水，样品瓶置于4℃至F68完全溶解，得到质量体积百分浓度分别为15％、21％、24％和30％的F68溶液；
(3)从步骤1所述的GelMA溶液中取2mL置于样品瓶，加入1ml步骤2所述的F68溶液，机械搅拌1min后分别得到F68初始质量体积百分浓度为5％、7％、8％和10％的GelMA-F68生物墨水；
(4)将步骤3中得到的4组生物墨水分别与1×105大鼠真皮成纤维细胞充分混匀，得到生物活性墨水；
(5)将2mL步骤4所述的生物活性墨水置于覆盖有硅胶膜的载玻片上，其中生物活性墨水所在区域用厚度为0.1mm的硅胶膜隔开，在所述厚度为0.1mm的硅胶膜上方放置洁净盖玻片，所述生物活性墨水经3D打印机在波长为400～480nm的蓝光下照射5秒，得到光固化多孔细胞微球，用去离子水对所述光固化多孔细胞微球洗涤3次，每次50分钟，以除去未交联的GelMA、光引发剂和游离的F68；
(6)将洗涤完的多孔细胞微球转移至六孔板中培养14天，每隔3天换一次细胞培养液。14天后提取多孔细胞微球的RNA，采用QPCR检测Ⅰ-Ⅳ型胶原蛋白的表达。
图5给出了不同配比的多孔微球诱导大鼠真皮成纤维细胞基因表达情况，结果显示，不同配比的多孔微球均可诱导大鼠真皮成纤维细胞高效分泌Ⅰ和Ⅳ型胶原蛋白、少量分泌Ⅲ型胶原蛋白、不分泌Ⅱ型胶原蛋白。而Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白均与抗衰老相关。
实施例3
(1)在样品瓶中先后加入一定量的光引发剂(LAP)和去离子水，配置质量体积百分浓度为0.7％(0.007g/mL)的LAP溶液。向该LAP溶液中加入一定量的GelMA，随后将样品瓶置于37℃至GelMA完全溶解，得到质量体积百分浓度为0.15g/mL的GelMA溶液；
(2)在样品瓶中先后加入1.0g的F68和5.0mL的去离子水，样品瓶置于4℃至F68完全溶解，得到质量体积百分浓度为0.2g/mL的F68溶液；
(3)从步骤1所述的GelMA溶液中取2ml置于样品瓶，加入1ml步骤2所述的F68溶液，机械搅拌1分钟后分别得到F68初始质量体积百分浓度为24％的GelMA-F68生物墨水；
(4)将2mL步骤3所述的GelMA-F68生物墨水置于覆盖有硅胶膜的载玻片上，其中生物墨水所在区域用厚度为0.5mm的硅胶膜隔开，在所述厚度为0.5mm的硅胶膜上方放置洁净盖玻片，经3D打印机在波长为405nm的近紫外光下照射5秒，得到光固化多孔微球，用去离子水对所述光固化多孔微球洗涤3次，每次50分钟，以除去未交联的GelMA、光引发剂和游离的F68；
(5)将洗涤完的多孔微球与适当的羧甲基纤维素钠溶液中充分混匀，即得到可注射组织再生型填充剂，静置待用；
(6)将步骤5的可注射组织再生型填充剂，按每只大鼠100uL的剂量皮下注射，分别设置阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(商用聚左旋乳酸)、无孔材料和组织再生型填充剂4个组；
(7)在3周后取注射位点的皮下组织，如图6所示，并无明显炎症反应及感染。随后对组织进行固定、脱水、包埋、切片、Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色等一系列操作。
图6给出了大鼠皮下注射填充剂后的大体观察，结果显示，三组填充剂均没有出现明显的感染和脓肿，均显示了较好的生物相容性。
图7给出了大鼠皮下注射填充剂后组织的病理切片结果图，结果显示，组织再生型填充剂(多孔微球)组产生的Ⅰ型胶原蛋白最多，降解速度也最快。说明多孔微球具有较好的填充效果。
综上，本发明光固化可注射组织再生型填充剂可以较好地诱导Ⅰ型胶原蛋白沉积，降解性、生物相容性良好，同时具有制备工艺简单、可大量产业化等优势，在医美领域具有广阔的市场前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.可注射组织再生型填充剂，其特征在于：包括增稠溶剂和悬浮在增稠溶剂中的多孔微球；
所述多孔微球是由水凝胶球堆砌而成，且具有三维多孔结构，多孔微球的粒度为100～500μm；
所述三维多孔结构的孔径为微米级；
水凝胶球的粒度为50～50000nm；三维多孔结构的孔径为1～2000μm。
2.根据权利要求1所述的可注射组织再生型填充剂，其特征在于：所述多孔微球由光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物为原料制备而成。
3.根据权利要求1所述的可注射组织再生型填充剂，其特征在于：所述增稠溶剂包括增稠剂和水，所述增稠剂为羧甲基纤维素钠、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖中的任意一种。
4.权利要求1～3任一项所述的可注射组织再生型填充剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将光固化生物材料单体、光引发剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物共溶于溶剂，混匀后得到生物墨水；
b、利用3D打印系统，将步骤a所述生物墨水光固化成球形；
c、随后用溶剂洗脱以除去未交联的光固化生物材料单体、残留的光引发剂和游离的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，得到多孔微球；
d、将步骤c所述的多孔微球与增稠溶剂混匀，得到可注射组织再生型填充剂。
5.根据权利要求5所述的可注射组织再生型填充剂的制备方法，其特征在于：所述光固化生物材料单体包括可光交联的蛋白质或多肽，所述光引发剂包括苯基-2，4，6-三甲基苯酰次膦酸锂、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，2,4,6(三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦中的至少一种；所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物优选普朗尼克F68；优选所述光固化生物材料单体为甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酸酐改性柞蚕丝蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的可注射组织再生型填充剂的制备方法，其特征在于：步骤a的生物墨水中，光固化生物材料单体的浓度为0.01～0.5g/mL，聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的浓度为0.01～0.6g/mL，光引发剂的浓度为0.001～0.1g/mL。
7.根据权利要求5所述的可注射组织再生型填充剂的制备方法，其特征在于：步骤a和步骤c的溶剂为去离子水、注射用水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖溶液、生理盐水溶液和细胞培养液的任意一种；步骤c中的洗脱的时间为1～24小时。
8.根据权利要求5所述的可注射组织再生型填充剂的制备方法，其特征在于：步骤b中，多孔微球的形态和尺寸由3D打印系统中的图形模式决定，将图片模型导入3D打印系统中，同时将生物墨水放入含有硅胶膜的载玻片上，最后采用光源直接照射生物墨水使其固化成微球型；所述光源的波长为200～1046nm，优选光源的波长为320～980nm。
9.根据权利要求5所述的可注射组织再生型填充剂的制备方法，其特征在于：增稠溶剂的体积为多孔微球体积的40％～90％。
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