CN111334461A - 一种用于细胞培养与组织工程的胶体微载体的用途 - Google Patents

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CN111334461A CN202010094310.XA CN202010094310A CN111334461A CN 111334461 A CN111334461 A CN 111334461A CN 202010094310 A CN202010094310 A CN 202010094310A CN 111334461 A CN111334461 A CN 111334461A
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Abstract

本发明公开了一种胶体微载体，所述胶体微载体由光响应交联基团修饰的天然生物大分子和光引发剂，通过一定的方法制备成微米级颗粒；所述胶体微载体能够用于细胞培养，同时，也能够携带细胞注射到体内，促进组织修复。

Description

一种用于细胞培养与组织工程的胶体微载体的用途
技术领域
本发明涉及一种用于细胞培养与组织工程的胶体微载体及其应用
背景技术
近年来，细胞治疗被广泛应用于各大疾病的治疗过程中。细胞体外培养和体内注射是细胞治疗实现临床应用的两大重要问题。目前，二维细胞培养皿是最常用的细胞体外扩增系统。但是，这一系统还存在着一些无法解决的问题。首先，二维培养系统的低空间和培养基利用率使得其在大规模扩增细胞上受到局限，从而无法完全满足临床研究和治疗的需求。其次，普通二维培养系统的材料、生物信号、力学性质和拓扑结构等性能都与体内环境有很大的不同。这导致在通过使用二维培养皿传代培养之后，细胞无法完全保持其在体内的功能、形态和基因表达。最后，培养所得细胞需要消化后才能进行注射治疗，且直接注射会让细胞大量死亡，治疗效果骤减。因此，对细胞体外培养和体内注射系统的研究受到越来越多人的关注。
在这一方面，三维微载体系统作为一种细胞培养工具表现出极大的优势：1、三维微载体能够在有限的空间里为细胞的大规模扩增提供足够大的表面积；2、对微载体材料、携带的生物分子、拓扑结构等性能的选择与改进，可以让细胞的培养环境与体内的更接近。3、在微载体上扩增得到的细胞能够直接注射到体内，且微载体具有支撑和保护作用，使得治疗效果得到提升。但是，目前，能够同时满足细胞培养，包括细胞黏附、增殖、传代、冻存、消化，和细胞体内注射治疗的三维微载体仍有待于被开发。
发明内容
本发明目的是提供一种用于细胞培养与组织工程的胶体微载体，能够实现体外大规模细胞扩增和简便高效的细胞培养操作。同时，能够携带细胞注射到体内，促进组织修复。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种用于细胞培养与组织工程的胶体微载体，能够实现体外大规模细胞扩增和简便高效的细胞培养操作，且能够携带细胞进行体内组织修复。其特征在于所述胶体由光响应交联基团修饰的天然生物大分子、光引发剂和去离子水组成。
进一步，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子质量终浓度以去离子水质量计为0.1～50％。
进一步，所述光引发剂质量终浓度以去离子水质量计为0.001～1％。
进一步，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子中光响应交联基团的接枝取代率为1～90％。
进一步，所述光响应交联基团为邻硝基苄基类光扳机、顺丁烯二酸酐(又称马来酸酐)、柠康酸酐、顺-3-羧基戊烯二酸酐(顺式乌头酸酐)、4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰胺中的一种。
进一步，所述的邻硝基苄基类光扳机的结构如下式I所示：
Figure BDA0002384784550000021
式I中：
X为O、S或N；
R1选自氢、醚键类取代基、酯键类取代基、碳酸酯键类取代基、胺基甲酸酯键类取代基、巯基甲酸酯键类取代基或磷酸酯键类取代基；
R2选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基；
R3，R4，R5，R6中任意的一个或多个选自末端胺基、羟基、巯基、卤素或羧基改性的芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，其余地可自由地选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、羧基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基。
进一步，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子中的天然生物大分子为胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬胺酸、聚精氨酸、聚组氨酸、透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、羧甲基壳聚糖、聚乳酸、聚氨酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙烯亚胺、聚乙二醇及其衍生物中的一种。
进一步，所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone，I2959)或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP)中的一种；所述的光引发剂与光响应交联基团接枝改性的天然生物大分子的质量比为1～3:100。
进一步，所述胶体微载体制备方法为3D打印、微流控、雾化、乳化或挤出中的一种。
进一步，所述3D打印成型方法为数字光处理成型、光固化成型和挤出成型中的一种。
进一步，所述数字光处理3D打印的打印模型设置的层厚范围在1-50微米；打印所用交联光的波长范围为350-450纳米；光强范围为10-100mW cm-2；每层曝光时间范围为100-10000ms。
进一步，所述微流控能够高产率精准控制胶体微载体尺寸，通过微流芯片版图尺寸、流速比率和并行流道数的调节，以102-106个/min的产率获得10-300微米的胶体微液球，再通过微流控过程中即时光交联或形成过程后光交联。
进一步，所述微流控制备胶体微载体过程中，光交联采用的光波长为350-450纳米，光强范围为10-100mW/cm2，即时光交联通过调整光交联区大小，使成形胶体微载体在流道中通过光交联区曝光时间范围在1-100ms；形成过程后光交联采用曝光时间10-120s。
进一步，所述胶体微载体的直径范围在1微米-1000微米。
本发明还提供一种如前所述胶体微载体在细胞培养和组织修复中的应用。
本发明的胶体微载体使细胞能够黏附在微载体表面，并表现出高黏附率、高存活率和高增殖速率。同时，细胞传代可以通过加入新的微载体实现。细胞在原有的微载体上长满后，会迁移到新的微载体上，进行进一步扩增。细胞消化可以通过降解微载体实现。微球降解后，细胞通过离心收获。细胞在微载体上培养后，可以与微载体一起直接冻存，便于运输。复苏后，微载体性能不受影响，能够继续使用。最后，微载体可以携带细胞注射到体内，进行组织修复。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明的用于细胞培养与组织工程的胶体微载体具有良好的生物相容性。在体外，微载体具有良好的细胞相容性。细胞在微载体上表现出高粘附性和高增殖速率，能够满足细胞大规模扩增的需求。在体内，携带细胞的微载体有良好的组织相容性，且对细胞具有保护作用，能够固定细胞，避免细胞快速大量流失，从而加速组织修复。
本发明建立了简便高效的细胞三维培养操作。加入新微载体的传代方法省时省力，且避免了传统的酶消化对细胞造成的损伤。降解微球的细胞消化方法能够收获培养所得的所有细胞，提高了细胞的收获率。微载体能够与细胞一起冻存，贮存和运输，有利于微载体的推广使用。
附图说明
图1为本发明所述胶体微载体实物的照片。
图2为本发明所述的胶体微载体用于脂肪间充质干细胞的扩增，其中图2A为黏附，图2B为增值效率的比较。
图3为本发明所述的胶体微载体用于脂肪间充质干细胞的传代。
图4为本发明所述的胶体微载体用于脂肪间充质干细胞的消化。
图5为本发明所述的胶体微载体用于脂肪间充质干细胞的冻存。
图6为本发明所述的胶体微载体用于大鼠皮肤损伤修复。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子制备参考文献ColosiC,Shin S R,Manoharan V,et al.Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3DTissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink[J].Adv Mater.2016,28(4):677-684.中所述的方法合成。
本发明实施例所述的人源脂肪间充质干细胞(hADSCs)提取与培养方法参考文献Zhou W,Lin J,Zhao K,et al.Single-Cell Profiles and Clinically UsefulProperties of Human Mesenchymal Stem Cells of Adipose and Bone Marrow Origin[J].Am J Sports Med.2019,47(7):1722-1733.
实施例1
实施例子1.1本发明的胶体微球的生产或者制备
实施例子1.1.1数字光处理3D打印制备本发明的胶体微载体
1)将1克接枝取代率为10％的甲基丙烯酸酐修饰的明胶(GELMA)，10毫克苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)溶于10毫升去离子水中，混合均匀，配制成含有质量浓度为5％的GELMA和质量浓度为0.1％的LAP的胶体。
2)将步骤1)配制的胶体通过数字光处理3D打印的方法制备成直径为200、300、400或者500微米的GELMA微球。打印所用交联光的波长为385纳米。打印参数设置如下：
Figure BDA0002384784550000051
微球形态如图1所示。
3D打印所用交联光的波长范围为350-450纳米；光强范围为10-100mW cm-2；每层曝光时间范围为100-10000ms。具体打印的方法可以参照中国发明专利申请，申请号201910483433.X，201910482826.9,201810700414.3,201810699527.6,201910483826.0中所描述的方法，进行3D打印，然后打印出直接为200、300、400或者500微米左右的微粒或者微小载体。这里的微粒子是任何立体的形状，主要是圆球形或者正方体或者无规则的立方体。
实施例子1.1.2微流控法制备本发明的胶体微载体：将实施例子1.1.1步骤1)中所述方法配制的胶体作为分散相，HFE-7500(购自3M Novec)作为连续相分别注射到微流控管中。制备过程中，连续相流速为10毫升每小时，分散相流速为1毫升每小时。最后，用385纳米的光进行交联，光强为20mW cm-2,时间为10秒。
实施例子1.2人源脂肪间充质干细胞(hADSCs)的二维培养：将细胞接种于二维培养皿，用细胞完全培养基，置于30摄氏度、含5％二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。细胞完全培养基为含有10％(体积分数)胎牛血清(购自GIBCO)，1％(体积分数)青链霉素(购自GIBCO)的L-DMEM(购自GIBCO)，每两天更换一次完全培养基。当细胞的面积占培养皿底部的面积达到80-90％时进行传代(紧贴培养皿的表面生长)。传代时，先弃去培养基，用6毫升1％PBS清洗一次，加入1毫升0.005克每毫升胰酶(购自GIBCO)，置于培养箱中消化3分钟。然后用1毫升完全培养基终止消化，离心收集细胞。原代(P0)细胞的接种密度为1000个细胞每平方厘米，扩增细胞的接种密度为5000个细胞每平方厘米。
以下实施例中所接种的细胞的代次由第二代到第五代(P2-P5)。
实施例子1.3：本发明实施例子1.1制备的微球的细胞培养。
hADSCs(实施例子1.2的细胞悬浮液)在GELMA微球上的接种与培养：将1毫升重悬在细胞完全培养基中，浓度为2x105个细胞每毫升的hADSCs，接种到1毫升直径为400微米的GELMA微球上，细胞接种密度为5000个细胞每平方厘米。置于离心管内，在细胞培养箱中孵育2小时，每半小时轻轻摇晃5分钟，使细胞在GELMA微载体表面均匀贴附。细胞贴附后，加入2毫升细胞完全培养基，置于细胞培养箱中进行培养，每两天更换一次完全培养基，细胞完全培养基为含有10％(体积分数)胎牛血清(购自GIBCO)，1％(体积分数)青链霉素(购自GIBCO)的L-DMEM(购自GIBCO)，。
实施例子1.4：商业化微球Cytodex-1的细胞培养
商业化微球Cytodex-1(购自Sigma)的准备：将100微克Cytodex-1微球浸泡于5毫升1％PBS中，过夜。5毫升1％PBS清洗2次，每次5分钟。将Cytodex-1微球浸泡在5毫升1％PBS，121摄氏度，灭菌30分钟。弃去PBS，用5毫升完全培养基清洗2次，5毫升培养基浸泡过夜。
hADSCs在Cytodex-1微球上的接种与培养：将1毫升重悬在细胞完全培养基中，浓度为2x105个细胞每毫升的hADSCs，接种到200微升Cytodex-1微球上，细胞接种密度为5000个细胞每平方厘米。置于离心管内，在细胞培养箱中孵育2小时，每半小时轻轻摇晃5分钟，使细胞在Cytodex-1微载体表面均匀贴附。细胞贴附后，加入2毫升细胞完全培养基(与实施例子1.3相同)，置于细胞培养箱中进行培养，每两天更换一次完全培养基。
不同方法的细胞收集和处理
对于实施例子1.3和1.4的细胞培养，培养1、4、7天后，取出50微升GELMA微球或50微升Cytodex-1微球，进行消化和细胞计数。
GELMA微球消化时，先用完全培养基清洗2次，吸出完全培养基，加入50微升100U/mL的I型胶原酶(购自(Invitrogen)，置于培养箱中孵育5分钟。微球降解后，吸出20微升消化后的细胞悬液，用自动计数仪进行细胞计数。
Cytodex-1微球消化时，先用1％PBS清洗2次，吸出PBS，加入20微升EDTA-Trypsin消化液(购自Sigma),置于培养箱中孵育15分钟。细胞消化后，吸出20微升细胞悬液，用自动计数仪进行细胞计数。
结果如图2所示，细胞黏附率为第一天细胞计数所得数值除以接种的细胞数乘以100％。在接种1天后，细胞在GELMA微球上的黏附率高达100％，细胞在Cytodex-1微球上的黏附率约为80％。在培养7天后，细胞在GELMA微球上扩增约2.4倍，细胞在Cytodex-1微球上扩增约1.4倍(经过方差分析，达到极显著差异)。这说明hADSCs在该GELMA微球表现出高黏附率和高增殖速率，能够作为细胞培养的载体，用于细胞的体外扩增，实际效果要好于商业化的微球载体。本发明的微球在进行消化，是把微球本身溶解，可以全部释放出细胞，而商业化的微球本身不能被溶解，而是让细胞从微球表面洗脱下来，由于表面能比较大，不容易洗脱。另外更为重要的是，本发明的材料具有生物相容性，与生物组织相似，更有利于细胞的生长。这可能是由于传统微球的原因之一。
实施例2
1)将hADSCs按实施例1.3的所述的方法接种到GELMA微球上。
2)细胞传代：按照实施例1.3所述的方法培养7天后，加入1毫升新的GELMA微球，轻轻吹打混匀，继续置于细胞培养箱中进行培养。在培养8、11、14天后，用活死染色试剂盒购自DOJINDO)对细胞进行标记。取出500微升GELMA微球，先吸出培养基，用1％PBS清洗一次，加入500微升含有2微升PI碘化丙啶(购自DOJINDO)和2微升Calcein-AM染料(购自DOJINDO)的完全培养基，置于培养箱中染色30分钟。吸出染料，用1％PBS清洗一次，加入完全培养基，置于荧光显微镜下观察并拍照。
结果如图3所示。细胞会转移到新加入的GELMA微球上(箭头所指)，进行进一步扩增。
实施例3
1)将hADSCs按实施例1.3所述的方法接种到GELMA微球上。
2)细胞消化：按照实施例1.3所述的方法培养7天后，取出500微升GELMA微球，按实施例2所述对细胞进行活死染色标记。然后，按实施例1所述，对细胞进行消化。消化过程中，在培养箱中孵育1分钟、3分钟、5分钟后，取出样品，置于荧光显微镜中观察消化过程，并拍照。
结果如图4所示。直径为400微米的GELMA微球能够在5分钟内被胶原酶I消化，从而收获细胞。同样采用商业微球Cytodex-1进行同样的实验，获得细胞的时间需要花费15分钟，而且得率并不是很高。
实施例4
1)将hADSCs按实施例1.3中所述的方法接种到GELMA微球上。
2)细胞冻存：按照实施例1.3中所述的方法培养1天后，取出500微升GELMA微球，吸出培养基，缓慢加入500微升冻存液，转移到冻存管中，置于-80摄氏度冰箱梯度降温保存。冻存液为含有20％(体积分数)胎牛血清(购自GIBCO)，10％(体积分数)二甲基亚砜(购自GIBCO)的H-DMEM(购自GIBCO)。
3)冻存一个月后，将冻存的带有细胞的GELMA微载体取出，置于37摄氏度水浴锅中快速溶解。将带有细胞的GELMA微载体转移到离心管中，置于细胞培养箱中进行培养。
4)在复苏培养第1、4、7天后，取出50微升GELMA微球，按实施例1步骤7)所述，进行细胞消化和细胞计数。
结果如图5所示。复苏后的细胞能够在微球上继续增殖。
实施例5
1)将hADSCs按实施例1.2中所述的方法接种到二维培养皿上，并培养7天。
2)将hADSCs按实施例1.3中所述的方法接种到GELMA微球上，并培养7天。
3)皮肤损伤模型：利用活体动物SD大鼠，每只大鼠均接受背部皮肤损伤人工造模，缺损为直径10mm，深1mm的圆柱。
4)组织修复：将造模后的SD大鼠分成三组，分别进行如下处理：1、注射100微升按步骤2)处理的载有2x104个hADSCs的GELMA微载体；2、注射100微升按步骤1)处理的2x104个hADSCs；3、不做任何处理(空白对照)。修复7天后，收样，观察，拍照。
结果如图6所示。加入载有细胞的GELMA微载体加速了皮肤的修复，对照的皮肤几乎没有变化，而本发明的微球载体损伤面积明显缩小。
本领域的一般技术人员可以理解，本具体实施例子以人源脂肪间充质干细胞(hADSCs)为例子来说明，但是其它任何细胞培养都可以用本发明的载体进行。

Claims (20)

1.一种胶体微载体在细胞培养和/或组织修复中的用途，其中，所述的胶体微载体按照以下方法制备：提供制备微载体的试剂，该试剂包括光响应交联基团修饰的天然生物大分子、光引发剂和去离子水，该试剂在光照下交联形成胶体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子质量终浓度以去离子水质量计为0.1～50％。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述光引发剂质量终浓度以去离子水质量计为0.001～1％。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子中光响应交联基团的接枝取代率为1～90％。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的光响应交联基团为邻硝基苄基类光扳机、顺丁烯二酸酐(又称马来酸酐)、柠康酸酐、顺-3-羧基戊烯二酸酐(顺式乌头酸酐)、4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰胺中的一种。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，邻硝基苄基类光扳机的结构如下式I所示：
Figure FDA0002384784540000011
式I
式I中：
X为O、S或N；
R1选自氢、醚键类取代基、酯键类取代基、碳酸酯键类取代基、胺基甲酸酯键类取代基、巯基甲酸酯键类取代基或磷酸酯键类取代基；
R2选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基；
R3，R4，R5，R6中任意的一个或多个选自末端胺基、羟基、巯基、卤素或羧基改性的芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，其余地可自由地选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、羧基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子中的天然生物大分子为胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白、弹性蛋白、明胶、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬胺酸、聚精氨酸、聚组氨酸、透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、羧甲基壳聚糖、聚乳酸、聚氨酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙烯亚胺、聚乙二醇及其衍生物中的一种。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于,所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone，I2959)或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP)中的一种；所述的光引发剂与光响应交联基团接枝改性的天然生物大分子的质量比为1～3:100。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于,所述胶体微载体制备方法为3D打印、微流控、雾化、乳化或挤出中的一种。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于,3D打印成型方法为数字光处理成型、光固化成型和挤出成型中的一种。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，打印模型设置的层厚范围在1-50微米；打印所用交联光的波长范围为350-450纳米；光强范围为10-100mW cm-2；每层曝光时间范围为100-10000ms。
12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，采用微流控设备进行制造的时候，通过微流芯片版图尺寸、流速比率和并行流道数的调节，以102-106个/min的产率获得10-300微米的胶体微液球，再通过微流控过程中即时光交联或形成过程后光交联。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，采用的光波长为350-450纳米，光强范围为10-100mW/cm2，即时光交联通过调整光交联区大小，使成形胶体微载体在流道中通过光交联区曝光时间范围在1-100ms；形成过程后光交联采用曝光时间10-120s。
14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述胶体微载体的直径范围在1微米-1000微米。
15.一种进行组织修饰的方法，其中，该方法包括提供微载体，所述微载体，所述的微载体上接种有细胞，让带有细胞的微载体涂覆与损伤的组织上，其中，所述的微载体按以下方法制备：提供制备微载体的试剂，该试剂包括光响应交联基团修饰的天然生物大分子、光引发剂和去离子水，该试剂在光照下形成胶体。
16.根据权利要求15所述的方法，所述的光照的条件为：光波长为350-450纳米，光强范围为10-100mW/cm2，曝光时间10-120s。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子质量终浓度以去离子水质量计为0.1～50％。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述光引发剂质量终浓度以去离子水质量计为0.001～1％。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述光响应交联基团修饰的天然生物大分子中光响应交联基团的接枝取代率为1～90％。
20.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的光响应交联基团为邻硝基苄基类光扳机、顺丁烯二酸酐(又称马来酸酐)、柠康酸酐、顺-3-羧基戊烯二酸酐(顺式乌头酸酐)、4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰胺中的一种。
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