CN114053483A - 用于活细胞3d打印的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于活细胞3D打印的组合物以及活细胞3D打印的方法。该组合物包括双键修饰的氨基正电荷材料，双键修饰的海藻酸钠和紫外光引发剂。该组合物可在常温条件下打印出包含细胞且保真性较好的基本结构，并通过较短时间的紫外交联方式进行固化，可应用于活细胞打印。这种方法不仅解决了传统钙离子交联海藻酸钠支架的不稳定性，大大的提高了三维打印效率，而且改善了海藻酸钠的生物惰性，获得的聚电解质基双键交联网络水凝胶支架对细胞生物相容性好，进一步扩大了海藻酸钠在组织工程领域的应用价值。

Description

用于活细胞3D打印的组合物和方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于活细胞3D打印的组合物和活细胞3D打印的方法。
背景技术
海藻酸钠是提取自褐藻的天然聚阴离子多糖，其水溶液具有较高的黏度，可在极其温和的条件下快速形成凝胶，生物相容性好，且能够实现快速离子交联，因此已被广泛应用于构建三维打印墨水。但是使用钙离子交联后的海藻酸钠支架的稳定性较差，在生理环境下钙离子容易与周围的钠离子发生置换，从而导致支架坍塌。虽然海藻酸钠具有优异的生物相容性，能够提供包载细胞存活的环境，但是海藻酸钠不具备生物活性，也不具备诱导干细胞分化的能力，细胞在海藻酸钠支架上粘附与铺展效果较差。目前为了改进海藻酸钠支架的生物惰性问题，有研究者在海藻酸钠中的羧基上接枝精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列(RGD)，从而促进细胞在海藻酸钠支架上的粘附[J.Yu,Y.Gu,K.T.Du,S.Mihardja,R.E.Sievers,R.J.Lee,Biomaterials 2009,30,751]。但是这种海藻酸钠支架依然使用钙离子进行交联，稳定性仍然不足。
针对海藻酸钠支架稳定性的问题，有研究者利用海藻酸钠和聚赖氨酸制备了聚电解质基生物墨水(打印剂)，在静电相互作用下，可在常态中3D打印成大尺寸自支撑结构支架，实现了支架表面电荷可调控性，加强了支架的正电性，可以有效促进细胞粘附。但是这种方法只能在打印过程中保持支架自支撑，后续仍需使用化学交联剂来维持海藻酸钠支架形态稳定，无法应用于活细胞3D打印[Lin Z,Wu M,He H,Liang Q,Hu C,Zeng Z,et al,AdvFunct Mater.2019；29(9)]。
目前常用的活细胞3D打印方式是紫外光固化，即在打印的同时对材料进行紫外固化，这种方法具有条件温和、对细胞无伤害等特点，但对材料的要求较高，需要在极短的时间能发生紫外交联并塑性，否则打印出的支架结构无法良好地保持，因此这种方法大大缩小了材料的选择范围。同样，许多紫外光固化墨水，例如甲基丙烯酸化明胶(GelMA)，需要在较高温度下打印，低温平台接收，否则即使紫外交联也易坍塌。虽然也有研究者在海藻酸钠羧基上接枝甲基丙烯酸基团，使用光交联替代钙离子交联方式，以提高海藻酸钠支架的稳定性，也无需有对细胞造成损害的化学交联剂，但是这样的支架仍然缺乏生物活性[O.Jeon,K.H.Bouhadir,J.M.Mansour,E.Alsberg,Biomaterials 2009,30,2724]。因此制备具有可控稳定性和生物活性的海藻酸钠生物墨水具有很好的研究意义和应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，尤其是针对海藻酸钠稳定性差、存在生物惰性等问题，本发明旨在提供一种工艺简单、可紫外光固化的可应用于活细胞打印的海藻酸钠生物墨水，该生物墨水是基于氨基正电荷和海藻酸钠的聚电解质基双键交联网络水凝胶。
本发明的技术问题通过一下技术方案予以解决：
一种用于活细胞3D打印的组合物，包括双键修饰的氨基正电荷材料，双键修饰的海藻酸钠和紫外光引发剂，所述氨基正电荷材料是带正电荷的含氨基的材料。
进一步地，所述氨基正电荷材料包括壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或丙烯酰胺。
进一步地，所述双键修饰是指经甲基丙烯酸酐、丙烯腈或聚氯乙烯处理。
进一步地，所述紫外光引发剂包括安息香及其衍生物、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、4-二甲胺基-苯甲酸乙酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
进一步地，所述双键修饰的氨基正电荷材料与水的质量比为1％～20％，所述双键修饰的海藻酸钠与水的质量比为1％～20％，所述紫外光引发剂与水的质量比为0.05％～1％。
本发明另外还提供一种活细胞3D打印的方法，包括：对氨基正电荷材料和海藻酸钠分别进行丙烯酸酯基团接枝处理，将所述接枝处理后的氨基正电荷材料和海藻酸钠与紫外光引发剂和待打印的细胞混合，进行活细胞3D打印。
进一步地，所述方法还包括：在打印过程中用紫外光照射。
进一步地，所述接枝处理采用甲基丙烯酸酐进行处理，其中氨基正电荷材料与甲基丙烯酸酐的摩尔比为10：1～1：2；其中所述海藻酸钠与甲基丙烯酸酐的摩尔比为2：1～1：10。
进一步地，所述S3中光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
进一步地，所述活细胞3D打印在4～37℃的温度下进行紫外光固化，所述紫外光固化时间为1～60秒。
进一步地，本发明还提供一种聚电解质基水凝胶用于活细胞3D打印的应用。该基于氨基正电荷/海藻酸钠的聚电解质基双键交联网络水凝胶可在常温条件下打印出包含细胞且保真性较好的基本结构，并通过较短时间的紫外交联方式进行固化。不仅解决了传统钙离子交联海藻酸钠支架的不稳定性，大大的提高了三维打印效率；而且改善了海藻酸钠的生物惰性，获得的氨基正电荷/海藻酸钠聚电解质基双键交联网络水凝胶支架对细胞生物相容性好，进一步扩大了海藻酸钠在组织工程领域的应用价值。本发明制备方法简单快捷、成本低、非常适合工业化生产。
本发明与现有技术对比的有益效果是：
(1)海藻酸钠接枝双键后通过紫外光固化形成的水凝胶比钙离子交联的方式稳定性高；
(2)由于海藻酸钠和氨基正电荷材料的电荷作用提高了生物墨水的粘度，实现了低浓度海藻酸钠墨水条件下的3D打印的稳定性；
(3)双键修饰的海藻酸钠和双键修饰的氨基正电荷材料可以通过紫外光固化交联，比较温和简单，细胞毒性小，可用于活细胞打印；
(4)通过加入氨基正电荷材料能够提高包载细胞的存活率，改善了海藻酸钠用于活细胞打印的生物惰性问题。
(5)相比于很多紫外光固化墨水(例如甲基丙烯酸化明胶，GelMA)具有在较高温度下打印，低温平台接收，紫外光固化时间较长等特点；本发明利用聚电解质基双键交联网络生物墨水紫外光固化时间短，且可在常温或37℃下打印，适合细胞生长；
(6)可以通过对支架整体电荷的调节来决定包裹细胞的生长情况。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1是本发明实施例提供的双键修饰前后聚赖氨酸的核磁共振氢谱图；
图2是本发明实施例提供的双键修饰前后海藻酸钠的核磁共振氢谱图；
图3是本发明实施例提供的包裹细胞打印的聚赖氨酸/海藻酸钠双键交联网络水凝胶冻干后的表面形貌图；
图4是本发明实施例提供的聚赖氨酸/海藻酸钠双键交联网络水凝胶打印后的支架实物图；
图5是本发明实施例提供的包裹细胞的聚赖氨酸/海藻酸钠双键交联网络水凝胶支架培养72h后的活/死细胞染色图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明旨在提供一种用于生物3D打印的组合物，包括双键修饰的氨基正电荷材料，双键修饰的海藻酸钠，紫外光引发剂和待培养的细胞，所述氨基正电荷材料包括壳聚糖，聚赖氨酸和氨基酸中的一种或多种。
具体地，所述双键修饰的聚赖氨酸为经过甲基丙烯酸酐处理的聚赖氨酸，双键修饰的海藻酸钠为经过甲基丙烯酸酐处理的海藻酸钠。
本发明实施例提供的聚赖氨酸与海藻酸钠分子都进行了丙烯酸酯基团接枝处理，得到双键接枝的氨基正电荷材料和双键接枝的海藻酸钠，再将其与细胞悬液和光引发剂共同混合得到可用于3D打印的生物墨水，采用先进的3D打印技术可制备氨基正电荷材料和海藻酸钠聚电解质基三维支架，同时通过紫外光使支架进行紫外固化形成基于氨基正电荷材料和海藻酸钠的聚电解质基双键交联网络水凝胶支架。
具体地，聚赖氨酸在PBS缓冲液中经双键修饰，浓度为40-100mg/mL；海藻酸钠在PBS缓冲液中经双键修饰，浓度为5-100mg/mL。具体地，在用于生物3D打印的组合物中，双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)含量为1-20％；双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)含量为1-20％；紫外光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，含量为0.2-1％，以上均为该成分与水的质量比；本发明实施例使用的活细胞可以为干细胞或者分化后的细胞，例如人骨髓来源间充质干细胞、软骨细胞或内皮细胞，细胞浓度为1×106CFU/mL。
本发明实施例还提供一种活细胞3D打印的方法，包括：对氨基正电荷材料和海藻酸钠分子分别进行丙烯酸酯基团接枝处理，得到双键修饰的聚赖氨酸和双键修饰的海藻酸钠，将所述双键修饰的聚赖氨酸和双键修饰的海藻酸钠与紫外光引发剂和待打印的细胞在室温下混合，通过调节各组分的性质和浓度来调节生物墨水的粘度，以针对不同的活细胞进行3D打印。
应理解，在本发明实施例中使用的双键修饰的海藻酸钠和双键修饰的氨基正电荷材料含量应该合理控制，海藻酸钠含量过高不利于细胞的存活，双键修饰的氨基正电荷材料含量过高也会导致交联网络过于致密，不利于细胞的生长和铺展。
实施例一
A.双键修饰聚赖氨酸(ε-PLMA)的制备
首先将10g的聚赖氨酸(ε-PL)溶解于装有170mL的磷酸缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加5mL的甲基丙烯酸酐溶液(市场购得)，在低温条件下避光反应6小时，转速500rpm，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，通过离心的方式去除反应液中的沉淀物；之后将反应液装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析后的反应液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰聚赖氨酸(ε-PLMA)，其结构式为：
Figure BDA0003297053610000061
PL和ε-PLMA的核磁共振氢谱图如图1所示(图中编号与结构式中对应)，其中PLMA-1的双键取代度为51.35％，PLMA-2的双键取代度为30.65％。
B.双键修饰海藻酸钠(AlgMA)的制备
首先将1g海藻酸钠(Alg)在4℃条件下，溶解于装有100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加30mL的甲基丙烯酸酐溶液(浓度同上)，在低温条件下避光反应48小时，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，在反应液中加入等体积的无水乙醇，使双键接枝后的海藻酸钠粗产物沉淀(AlgMA)析出，再使其复溶在100mL的双蒸水中；装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰的海藻酸钠(AlgMA)，其结构式为：
Figure BDA0003297053610000071
Alg和AlgMA的核磁共振氢谱图如图2所示(图中编号与结构式中对应)，其中AlgMA-5的双键取代度为28.17％，AlgMA-6的双键取代度为33.23％。
C.可用于包裹细胞打印的海藻酸钠和聚赖氨酸双键交联网络水凝胶的制备
将步骤A得到的双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)和步骤B得到的双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)，与紫外光引发剂及细胞悬液混合，配制成不同固含量的双键交联网络水凝胶基质前驱体，各组分与水的质量比为：双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)8％(m/v)；双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)4％(m/v)；紫外光引发剂0.1％(m/v)；细胞浓度为1×106CFU/mL。本实施例中的紫外光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，细胞悬液为人骨髓来源间充质干细胞(hBMSC)。
室温下将各组分混合均匀，即可得到可用于三维生物打印的紫外光固化水凝胶基质的生物墨水。采用先进的3D打印技术打印支架，并同时使用紫外手电筒对支架进行紫外光固化，得到最终的三维结构水凝胶支架。如图3和图4所示。同时，细胞在支架中保持相对活性状态，如图5所示，图5显示了包裹细胞的双键交联网络水凝胶打印支架培养72h后的细胞染色图片，图中的亮点为活细胞染色图片。
实施例二
A.双键修饰聚赖氨酸(ε-PLMA)的制备
首先将20g的聚赖氨酸(ε-PL)溶解于装有170mL的磷酸缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加8mL的甲基丙烯酸酐溶液(纯度为99.9％)，在低温条件(4℃)下避光反应6小时，转速500rpm，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，通过离心的方式去除反应液中的沉淀物；之后将反应液装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析后的反应液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰聚赖氨酸材料(ε-PLMA)。
B.双键修饰海藻酸钠(AlgMA)的制备
首先将3g海藻酸钠(Alg)在4℃条件下，溶解于装有100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加30mL的甲基丙烯酸酐溶液，在低温条件下避光反应48小时，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，在反应液中加入等体积的无水乙醇，使双键接枝后的海藻酸钠粗产物沉淀(AlgMA)析出，再使其复溶在100mL的双蒸水中；装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)。
C.可用于包裹细胞打印的海藻酸钠和聚赖氨酸双键交联网络水凝胶的制备
将步骤A得到的双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)和步骤B得到的双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)，与紫外光引发剂(本实施例中的紫外光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)及细胞悬液混合(本实施例中的细胞悬液为人骨髓来源间充质干细胞)，配制成不同固含量的双键交联网络水凝胶基质前驱体，各组分与水的质量比为：双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)10％；双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)8％；紫外光引发剂0.2％；细胞浓度为1×106CFU/mL。
室温下将各组分混合均匀，即可得到可用于三维生物打印的紫外光固化水凝胶基质的生物墨水。采用先进的3D打印技术打印支架，并同时使用紫外手电筒对支架进行紫外光固化，得到最终的三维结构水凝胶支架。同时，细胞在支架中保持相对活性状态。
实施例三
A.双键修饰聚赖氨酸(ε-PLMA)的制备
首先将15g的聚赖氨酸(ε-PL)溶解于装有170mL的磷酸缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加5mL的甲基丙烯酸酐溶液(纯度为99.9％)，在低温条件下避光反应6小时，转速500rpm，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，通过离心的方式去除反应液中的沉淀物；之后将反应液装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析后的反应液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰聚赖氨酸(ε-PLMA)。
B.双键修饰海藻酸钠(AlgMA)的制备
首先将2g海藻酸钠(Alg)在4℃条件下，溶解于装有100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加30mL的甲基丙烯酸酐溶液，在低温条件下避光反应48小时，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，在反应液中加入等体积的无水乙醇，使双键接枝后的海藻酸钠粗产物沉淀(AlgMA)析出，再使其复溶在100mL的双蒸水中；装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰的海藻酸钠(AlgMA)。
C.可用于包裹细胞打印的海藻酸钠和聚赖氨酸双键交联网络水凝胶的制备
将步骤A得到的双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)和步骤B得到的双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)，与紫外光引发剂及细胞悬液混合，配制成不同固含量的双键交联网络水凝胶基质前驱体，各组分与水的质量比为：双键修饰的聚赖氨酸(ε-PLMA)15％；双键修饰的海藻酸钠(AlgMA)12％；紫外光引发剂0.3％；细胞浓度为1×106CFU/mL。其中紫外光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，细胞悬液为软骨细胞。
室温下将各组分混合均匀，即可得到可用于三维生物打印的紫外光固化水凝胶基质的生物墨水。采用先进的3D打印技术打印支架，并同时使用紫外手电筒对支架进行紫外光固化，得到最终的三维结构水凝胶支架。同时，细胞在支架中保持相对活性状态。
实施例四
A.双键修饰聚赖氨酸(ε-PLMA)的制备
首先将25g的聚赖氨酸(ε-PL)溶解于装有170mL的磷酸缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加10mL的甲基丙烯酸酐溶液(纯度为99.9％)，在低温条件下避光反应6小时，转速500rpm，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，通过离心的方式去除反应液中的沉淀物；之后将反应液装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析后的反应液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰聚赖氨酸材料(ε-PLMA)。
B.双键修饰海藻酸钠(AlgMA)的制备
首先将4g海藻酸钠(Alg)在4℃条件下，溶解于装有100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加40mL的甲基丙烯酸酐溶液，在低温条件下避光反应48小时，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，在反应液中加入等体积的无水乙醇，使双键接枝后的海藻酸钠粗产物沉淀(AlgMA)析出，再使其复溶在100mL的双蒸水中；装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)。
C.可用于包裹细胞打印的海藻酸钠和聚赖氨酸双键交联网络水凝胶的制备
将步骤A得到的双键修饰的聚赖氨酸(ε-PLMA)和步骤B得到的双键修饰的海藻酸钠(AlgMA)，与紫外光引发剂及细胞悬液混合，配制成不同固含量的双键交联网络水凝胶基质前驱体，各组分与水的质量比为：双键修饰的聚赖氨酸材料(ε-PLMA)8％；双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)16％；紫外光引发剂0.1％；细胞浓度为1×106CFU/mL。其中紫外光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，细胞悬液为内皮细胞。
室温下将各组分混合均匀，即可得到可用于三维生物打印的紫外光固化水凝胶基质的生物墨水。采用先进的3D打印技术打印支架，并同时使用紫外手电筒对支架进行紫外光固化，得到最终的三维结构水凝胶支架。同时，细胞在支架中保持相对活性状态。
实施例五
A.双键修饰聚乙烯亚胺的制备
首先将20g的聚乙烯亚胺溶解于装有170mL的磷酸缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加5mL的甲基丙烯酸酐溶液(纯度为99.9％)，在低温条件下避光反应6小时，转速500rpm，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，通过离心的方式去除反应液中的沉淀物；之后将反应液装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析后的反应液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰聚乙烯亚胺。
B.双键修饰海藻酸钠(AlgMA)的制备
首先将3g海藻酸钠(Alg)在4℃条件下，溶解于装有100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加30mL的甲基丙烯酸酐溶液，在低温条件下避光反应48小时，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，在反应液中加入等体积的无水乙醇，使双键接枝后的海藻酸钠粗产物沉淀(AlgMA)析出，再使其复溶在100mL的双蒸水中；装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰的海藻酸钠(AlgMA)。
C.可用于包裹细胞打印的海藻酸钠和聚乙烯亚胺双键交联网络水凝胶的制备
将步骤A得到的双键修饰的聚乙烯亚胺和步骤B得到的双键修饰的海藻酸钠材料，与紫外光引发剂及细胞悬液混合，配制成不同固含量的双键交联网络水凝胶基质前驱体，各组分与水的质量比为：双键修饰的聚乙烯亚胺12％；双键修饰的海藻酸钠10％；紫外光引发剂0.2％；细胞浓度为1×106CFU/mL。其中紫外光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，细胞悬液为软骨细胞。
室温下将各组分混合均匀，即可得到可用于三维生物打印的紫外光固化水凝胶基质的生物墨水。采用先进的3D打印技术打印支架，并同时使用紫外手电筒对支架进行紫外光固化，得到最终的三维结构水凝胶支架。同时，细胞在支架中保持相对活性状态。
实施例六
A.双键修饰壳聚糖的制备
首先将10g的壳聚糖溶解于装有170mL的磷酸缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加10mL的甲基丙烯酸酐溶液(纯度为99.9％)，在低温条件下避光反应6小时，转速500rpm，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，通过离心的方式去除反应液中的沉淀物；之后将反应液装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析后的反应液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰壳聚糖。
B.双键修饰海藻酸钠(AlgMA)的制备
首先将3g海藻酸钠(Alg)在4℃条件下，溶解于装有100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)的三口烧瓶中，通过分液漏斗缓慢滴加40mL的甲基丙烯酸酐溶液，在低温条件下避光反应48小时，通过不时滴加NaOH使整个反应过程中保证pH＝8。待反应结束后，在反应液中加入等体积的无水乙醇，使双键接枝后的海藻酸钠粗产物沉淀(AlgMA)析出，再使其复溶在100mL的双蒸水中；装入透析袋中透析7天，早晚各换一次双蒸水，以去除反应副产物和残余反应物；将透析液冷冻干燥4天，即可得到高纯度的双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)。
C.可用于包裹细胞打印的海藻酸钠和壳聚糖双键交联网络水凝胶的制备
将步骤A得到的双键修饰的壳聚糖和步骤B得到的双键修饰的海藻酸钠，与紫外光引发剂及细胞悬液混合，配制成不同固含量的双键交联网络水凝胶基质前驱体，各组分与水的质量比为：双键修饰的壳聚糖8％；双键修饰的海藻酸钠材料(AlgMA)7％；紫外光引发剂0.4％；细胞浓度为1×106CFU/mL。其中紫外光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，细胞悬液为内皮细胞。
室温下将各组分混合均匀，即可得到可用于三维生物打印的紫外光固化水凝胶基质的生物墨水。采用先进的3D打印技术打印支架，并同时使用紫外手电筒对支架进行紫外光固化，得到最终的三维结构水凝胶支架。同时，细胞在支架中保持相对活性状态。
实施例七
对实施例一到六的甲基丙烯酸酐溶液换成丙烯腈或聚氯乙烯进行双键修饰氨基正电荷材料和海藻酸钠，然后将紫外光引发剂替换为安息香及其衍生物、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮或4-二甲胺基-苯甲酸乙酯等紫外光引发剂材料，操作步骤同实施例六，结果与实施例六基本相同。本发明提供的聚电解质基水凝胶提高了低浓度海藻酸钠生物墨水的打印性能，解决了钙离子交联的海藻酸钠水凝胶的不稳定性，并且实现了支架整体电荷的调控，改善了海藻酸钠的生物惰性，从而促进了包裹细胞的存活和增殖，为天然线性高分子海藻酸钠广泛应用于各种组织工程方向奠下基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于活细胞3D打印的组合物，包括双键修饰的氨基正电荷材料，双键修饰的海藻酸钠和紫外光引发剂，所述氨基正电荷材料是带正电荷的含氨基的材料。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述氨基正电荷材料包括壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或丙烯酰胺。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述双键修饰是指经甲基丙烯酸酐、丙烯腈或聚氯乙烯处理。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述紫外光引发剂包括安息香及其衍生物、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、4-二甲胺基-苯甲酸乙酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述双键修饰的氨基正电荷材料与水的质量比为1％～20％，所述双键修饰的海藻酸钠与水的质量比为1％～20％，所述紫外光引发剂与水的质量比为0.05％～1％。
6.一种活细胞3D打印的方法，包括：对氨基正电荷材料和海藻酸钠分别进行丙烯酸酯基团接枝处理，将所述接枝处理后的氨基正电荷材料和海藻酸钠与紫外光引发剂和待打印的细胞混合，进行活细胞3D打印。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨基正电荷材料包括壳聚糖，聚赖氨酸和氨基酸中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述双键修饰是指经甲基丙烯酸酐处理。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述双键修饰的氨基正电荷材料与水的质量比为1％～20％，所述双键修饰的海藻酸钠与水的质量比为1％～20％，所述紫外光引发剂与水的质量比为0.05％～1％。
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