CN115138305A - 一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法、装置及核壳微囊 - Google Patents

一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法、装置及核壳微囊 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种GelMA‑海藻酸盐核壳微囊的制备方法及装置，本发明实施例中，利用共轴静电液滴(CEM)系统和内外双层同心同轴针头得到GelMA‑海藻酸盐核壳微囊，避免通过油相获得GelMA微球，仅通过两种水性液体即可制备出核壳微囊，得到的GelMA‑海藻酸盐核壳微囊在GelMA微球表面包裹了一层海藻酸盐水凝胶“外壳”，避免相邻的GelMA相互融合，也可作为隔室防止载细胞GelMA微球在细胞培养阶段的相互粘连。此外，在后期的体内应用或临床转化，仅需将核壳微囊在柠檬酸钠中浸泡十多秒，即可溶解海藻酸盐“外壳”，此过程对细胞没有任何伤害。因此，利用本发明实施例提供的制备方法制备得到的核壳微囊在细胞移植、药物释放和组织工程等生物医学领域具有潜在的应用前景。

Description

一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法、装置及核壳微囊
技术领域
本发明涉及生物医学基础研究领域，特别是涉及一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法及装置。
背景技术
水凝胶微球因其较大的表面积体积比，可有效的促进营养物质和氧气运输，并改善细胞与基质的相互作用，从而保持封装细胞的长期活力。此外，微球之间的间隙空间进一步促进了氧气和营养物质的扩散和代谢废物的交换。水凝胶微球可以模拟天然细胞外基质(ECM)，例如：甲基丙烯酸化明胶(GelMA)微球含有许多精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspatic acid，RGD)序列和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)的靶序列，与天然ECM非常相似。GelMA微球甚至可以通过调节其物化性质模拟ECM的机械性能，并提供微环境线索，例如细胞间信号传导和ECM结合，以指导干细胞的行为。GelMA微球已经在骨骼、神经系统、血管、心脏等微组织工程应用中取得了重要进展。因此，载细胞GelMA水凝胶微球在组织工程领域中的干细胞扩增和移植方面具有广阔的应用前景。
静电液滴法是常见的制备GelMA微球的方式之一，能够低成本、高通量地制造微米级别的GelMA微球。在静电液滴喷涂过程中，水凝胶前体溶液通过注射器挤出，同时在针尖施加电压，当施加的电压超过临界阈值，便可克服针尖液体的表面张力，导致形成带电的液滴射流，称为泰勒锥(Taylor cone)。然而，由于GelMA微球的水溶性，因此，必须通过油相获得GelMA微球，而将GelMA微球从油相转移到水溶液中的方法与大多数研究采用的传统分离方法相同，即反复高速离心和循环洗涤。该滤油方法需要多重工序，不仅费时费力而且还会导致微球聚集、微球表面油残留、回收效率低以及增加污染风险等。此外，与正常培养的细胞相比，高速离心和较长时间与油相的接触会导致细胞活力的降低。
此外，在实际应用过程中，相邻的载细胞GelMA微球倾向于相互融合和自组装形成体积较大的簇团，这将不可避免的对物质转运造成影响，并导致形状和尺寸无法控制，无法充分发挥载细胞GelMA微球的可注射性优势。
因此，目前亟需一种能够稳定可控地制备GelMA微球的方法。
发明内容
为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法、装置，以稳定可控地制备GelMA微球。
第一方面，本发明提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法，所述方法包括：
在共轴静电液滴系统的内外通道中分别注入GelMA溶液和海藻酸盐溶液；
在静电电压的作用下，所述GelMA溶液和海藻酸盐溶液从内外双层同心同轴针头的喷嘴喷入收集液中，得到初步交联的核壳微囊；
将所述初步交联的核壳微囊暴露于蓝光下，交联GelMA核心，得到GelMA-海藻酸盐核壳微囊；
其中，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的海藻酸盐壳层作为隔室防止所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粘连，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的GelMA核心提供细胞黏附着和生长基质。
可选地，所述方法还包括：
配置GelMA前体溶液和所述海藻酸盐溶液，将目标细胞和与所述GelMA前体溶液充分混匀，得到所述GelMA溶液，所述GelMA溶液中的细胞浓度为3×106/ml。
可选地，所述内外双层同心同轴针头包括：28G的内针和21G的外针，所述内针插入所述外针，所述内针的外径为：350μm，内径为：170μm，所述外针的外径为：810μm，内径为：510μm。
可选地，所述内外双层同心同轴针头的喷嘴尖端到收集液面的垂直距离保持在4cm恒定，以形成稳定的泰勒锥。
可选地，基于所述内外双层同心同轴针头，所述GelMA溶液的流速为10～20μl/分钟，所述海藻酸盐溶液流速45～120μl/分钟。
可选地，所述收集液为CaCl2溶液，所述收集液的浓度为1％-5％w/v。
可选地，所述GelMA溶液的浓度为5.0％w/v，所述海藻酸盐溶液的浓度为1.8％w/v，以使所述海藻酸盐壳层顺利包住GelMA核心，形成单分散性良好的球状核壳微囊，并且使GelMA溶液在预设时间内充分交联。
可选地，所述静电电压的大小为12kV-13.5kV，以制备体积小，形状为球形的核壳微囊。
第二方面，本发明提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备装置，所述装置用于执行上述第一方面所述的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法，所述装置包括：
高压静电仪，用于提供静电电压；
内外双层同心同轴针头；
具有内外通道的共轴静电液滴系统；
两个微量注射泵，用于分别调节内通道的GelMA溶液和外通道的海藻酸盐溶液的流速。
第三方面，本发明提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊由上述第一方面所述的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法制得，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊包括：海藻酸盐壳层和GelMA核心；
所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的海藻酸盐壳层作为隔室防止所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粘连，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的GelMA核心提供细胞黏附着和生长基质。
与现有技术相比，本发明包括以下优点：
本发明实施例中，利用共轴静电液滴(CEM)系统，可以稳定地制备GelMA-海藻酸盐核壳微囊，得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊在GelMA微球表面包裹了一层海藻酸盐水凝胶“外壳”，避免相邻的GelMA微球相互融合，从而能够稳定可控地制备GelMA微球。
本发明实施例中，利用共轴静电液滴系统和内外双层同心同轴针头即可得到形貌稳定，大小合适的GelMA-海藻酸盐核壳微囊，避免通过油相获得GelMA微球，无需引入任何油相，仅通过两种水性液体来实现，即可制备出核壳微囊，也就无需将GelMA微球从油相转移到水溶液中，解决了繁琐的滤油工序对细胞和生产带来影响。此外，海藻酸盐壳层可作为隔室防止载细胞GelMA微球在细胞培养阶段的相互粘连。后期的体内应用或临床转化，仅需将核壳微囊在柠檬酸钠中浸泡十多秒，海藻酸盐凝胶由于Na+与Ca2+的交换而极易溶解，且此过程对细胞没有任何伤害。因此，利用本发明实施例提供的制备方法制备得到的核壳微囊在细胞移植、药物释放和组织工程等生物医学领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法的流程图；
图2是本发明实施例中一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备装置的示意图；
图3是本发明实施例中的共轴静电液滴系统示意图，其中(A)示出了共轴静电液滴系统搭建实物图，(B)示出了共轴静电液滴的局部放大实物图，(C)、(D)示出了泰勒锥实物图；
图4是利用本发明实施例提供的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法制备粒径小、均一的球形核壳微囊的结果示意图，其中，(A)示出了共轴静电液滴法制备核壳微囊示意图，(B)示出了GelMA被染色液着色后数分钟内所制备的微囊，(C)示出了制备的微囊的局部放大图，比例尺为：200μm；(D)示出了制备得到的核壳微囊的尺寸分布直方图，(E)示出了GelMA核心的尺寸分布直方图；
图5是利用本发明实施例提供的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法在不同的喷射电压下制备得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粒径变化结果分析图；
图6是利用本发明实施例提供的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法在不同的核液流速和壳液流速制备得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粒径变化结果分析图；
图7是利用本发明实施例得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊体外3D培养及细胞再接种的试验结果示意图，其中，(A)、(B)、(C)分别示出了载hDPSCs的核壳微囊体外培养1天、4天和14天的光镜图像，(D)示出了核壳微囊粒径随着时间的变化趋势，(E)和(F)分别示出了长期培养后溶解掉壳层，得到的载细胞GelMA微凝胶低倍镜(×4)光镜图和高倍镜(×10)光镜图，(G)(H)分别示出了细胞聚集体再次接种于平板第1和3天的生长状态，其中，(A)(B)(E)的比例尺为：500μm；(C)、(F)(G)(H)的比例尺为：100μm。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规试剂产品。
第一方面，本发明实施例提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法，图1是本发明实施例中一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法的流程图；如图1所示，该方法包括以下步骤：
S101，在共轴静电液滴系统的内外通道中分别注入GelMA溶液和海藻酸盐溶液。
其中，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的海藻酸盐壳层作为隔室防止所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粘连，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的GelMA核心提供细胞黏附着和生长基质。
本发明一种可选地实施方式中，在步骤S101之前，所述方法还包括：配置GelMA前体溶液和所述海藻酸盐溶液，将目标细胞和与所述GelMA前体溶液充分混匀，得到所述GelMA溶液，所述GelMA溶液中的细胞浓度为3×106/ml。
具体地，用去离子水先配置0.5％w/v的光引发剂LAP溶液，再用其溶解GelMA，在磁力搅拌器上加热至37℃充分溶解GelMA 30分钟，配置成GelMA前体溶液，整个配置过程避光；将海藻酸盐溶解在去离子水中，在磁力搅拌器上充分溶解120分钟配置成海藻酸盐前体溶液。
本发明实施例中探索发现，低浓度海藻酸盐(1.4％，w/v)几乎无法顺利包裹住低浓度的GelMA核心(2.5％，w/v)，在落入收集液前便发生两种液体分离，因此制备出的微凝胶为海藻酸盐微球，并未形成核壳结构，GelMA溶液浓度继续增加则无法形成稳定泰勒锥。高浓度的海藻酸盐(1.8％和2.0％，w/v)可以顺利包住低浓度的GelMA核心(2.5％和5.0％，w/v)，形成单分散性良好的球状核壳微囊；而继续加大GelMA溶液浓度，则会导致微囊的核心和整体形状从球形变成橄榄球形，粒径也会有所增加。中等浓度的海藻酸盐溶液(1.4％和1.6％，w/v)对不同浓度的核心溶液表现各异，其中1.6％的海藻酸盐溶液可以成功包被2.5％GelMA溶液，而随着核心液体浓度增加或壳层液体浓度降低，可出现8字形核壳结构、逗号状核壳结构，梭形核心结构等等。由于2.5％w/v GelMA溶液无法在蓝光下经过较短的时间(＜120s)充分交联；并且浓度越高的水凝胶内部结构愈加致密，越不利于物质转运与交换。
本发明实施例中探索发现，5％w/v GelMA溶液的粘度与水相似，由于1.8％w/v海藻酸盐溶液具有较高的粘度，壳层具有足够的表面张力来平衡平衡力下的电场力，两种水凝胶溶液(核心液体和壳层液体)的黏度差是形成核壳微囊的必要条件，壳溶液的足够高的黏度以及内外两种溶液之间的低内张力值对于形成稳定的复合泰勒锥至关重要。
因此，本发明一种可选地实施方式中，所述GelMA溶液的浓度为5.0％w/v，所述海藻酸盐溶液的浓度为1.8％w/v，以使所述海藻酸盐壳层顺利包住GelMA核心，形成单分散性良好的球状核壳微囊，并且使GelMA溶液在预设时间内充分交联。
S102，在静电电压的作用下，所述GelMA溶液和海藻酸盐溶液从内外双层同心同轴针头的喷嘴喷入收集液中，得到初步交联的核壳微囊。
本发明一种可选地实施方式中，所述内外双层同心同轴针头包括：28G的内针和21G的外针，所述内针插入所述外针，所述内针的外径为：350μm，内径为：170μm，所述外针的外径为：810μm，内径为：510μm。
在制备过程中，内外双层同心同轴针头的规格决定了形成稳定的泰勒锥喷射模式所需的流速，因此，本发明一种可选地实施方式中，基于该内外双层同心同轴针头的规格，为了形成稳定的泰勒锥，所述GelMA溶液的流速为10～20μl/分钟，所述海藻酸盐溶液流速45～120μl/分钟。
本发明实施例中探索发现，当内通道液体速率保持一定时，随着外通道液体流速的增加，核心平均直径基本不发生明显变化，均维持在250-280μm之间，而微囊整体平均直径逐渐变大。当壳层流体(海藻酸盐溶液)速率保持一定时，核心流体(GelMA溶液)速率增加对平均粒径变化无明显影响。包封细胞时为了尽可能缩短细胞离开培养基的时间，降低其活性受影响的可能性，可以优选，核心液体和壳层液体流速分别为15μl/min和60μl/min来制备载细胞核壳结构。
本发明一种可选地实施方式中，所述静电电压的大小为12kV-13.5kV，以制备体积小，形状为球形的核壳微囊。
本发明实施例中探索发现，随着外加静电电压从12kV增加到13kV，制得微囊的核心的平均直径从313.4μm降低到277.4μm，制得微囊整体的平均直径从363.9μm下降到345.9μm；超过13kV后，两制得微囊的核心的平均直径和制得微囊整体的平均直径，随着电压增加而增加，14.5kV核心和微囊平均直径分别为361.1μm和403.1μm。在外加电压小于13.5kV时，微囊的平均直径小于400μm，因此制备体积小，形貌较好的核壳微囊的电压范围为：12kV-13.5kV，其中最佳电压为13kV。
本发明一种可选地实施方式中，所述收集液为CaCl2溶液，所述收集液的浓度为1％-5％w/v。
海藻酸盐可被二价阳离子(如Ca2+)在温和条件下快速凝胶化，因此，本发明实施例中，选择收集液为CaCl2溶液，以使海藻酸盐快速凝胶化形成核壳微囊的壳层。其中，CaCl2溶液浓度从1％w/v升至5％w/v，制备的微囊的粒径及形貌未发生明显变化，因此，所述收集液的浓度为1％-5％w/v，最佳浓度为1％w/v。
本发明实施例中探索发现，稳定的泰勒锥是核壳微囊形成的前提，内外双层同心同轴针头的喷嘴尖端与收集溶液表面之间的垂直距离超过4cm无法形成稳定泰勒锥，而小于4cm会导致电弧火花的产生，易造成设备短路，因此，本发明一种可选地实施方式中，所述内外双层同心同轴针头的喷嘴尖端到收集液面的垂直距离保持在4cm恒定，以形成稳定的泰勒锥。
S103，将所述初步交联的核壳微囊暴露于蓝光下，交联GelMA核心，得到GelMA-海藻酸盐核壳微囊。
本发明实施例中，在GelMA溶液和海藻酸盐溶液从内外双层同心同轴针头的喷嘴喷入收集液的过程中，射流形成双层液滴，在两种流体混合之前在收集液立即通过离子交联海藻酸盐，形成壳层，包裹GelMA核心，然后光交联GelMA核心，即可从收集液中获取GelMA-海藻酸盐核壳微囊。
具体地，核壳微囊的光交联时间为90s。
海藻酸盐是一种天然聚合物，不仅具有生物相容性好、毒性低、通透性好等优点，还可被二价阳离子(如Ca2+)在温和条件下快速凝胶化。海藻酸盐水凝胶瞬间凝胶化后，作为壳层结构包裹GelMA核心，然后光交联GelMA核心，最后可以立即从水溶液中收集核壳微囊，无需繁琐和费力的提取方法。制备过程中每分钟就能获得约2500个微囊，此方法的高通量性有利于核壳微囊的大规模生产，并在组织工程和再生医学领域具有临床应用潜力。
第二方面，本发明实施例还提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备装置，如图2、图3所示，图2是GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备装置的示意图，图3是本发明实施例中的共轴静电液滴系统示意图，其中(A)示出了共轴静电液滴系统搭建实物图；(B)示出了共轴静电液滴的局部放大实物图；(C-D)示出了泰勒锥实物图。所述装置用于执行上述任一实施例所述的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法，所述装置包括：
高压静电仪，用于提供静电电压；
内外双层同心同轴针头；
具有内外通道的共轴静电液滴系统；
两个微量注射泵，用于分别调节内通道的所述GelMA溶液和海藻酸盐溶液的流速。
第三方面，本发明实施例还提供了一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊由上述任一实施例所述的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法制得，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊包括：海藻酸盐壳层和GelMA核心；
所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的海藻酸盐壳层作为隔室防止所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粘连，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的GelMA核心提供细胞黏附着和生长基质。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法。
实施例1
将28G的内针(外径：350μm，内径：170μm)插入21G的外针(外径：810μm，内径：510μm)组装成内外双层同心同轴针头，其连接处焊接固定。用去离子水先配置0.5％w/v的光引发剂LAP溶液，再用其溶解GelMA，在磁力搅拌器上加热至37℃充分溶解GelMA 30分钟，配置成5％w/v浓度的GelMA前体溶液，整个配置过程避光；将海藻酸盐溶解在去离子水中，在磁力搅拌器上充分溶解120分钟配置成1.8％w/v各种不同浓度海藻酸盐前体溶液。本发明实施例中，还在GelMA溶液中添加了蓝色颜料，以更好地可视化核壳微囊的结构。
将两台微量注射泵相互垂直放置，分别通过10ml注射器针筒与共轴针头连接，直流高压电正极电夹与针头接触，负极通过导电铜丝与收集液接触，共轴针头喷嘴尖端与收集溶液表面之间的垂直距离设为4cm。
GelMA溶液(核心流体)和海藻酸盐溶液(壳层流体)通过共轴静电液滴系统分别从内外通道注入。内通道的GelMA溶液和外通道的海藻酸盐溶液的流速由两个单独的垂直放置的微量注射泵独立调节。电压为由Wisman高压静电仪提供。在静电力的作用下，喷头尖端的两种同心流体液滴被分解成微米级液滴，并喷入收集液CaCl2溶液中。在两种液体混合之前，外壳的海藻酸钠溶液立即凝胶成海藻酸钙，由于重力因素，初步交联的核壳微囊沉降入收集液底部。随后将微囊暴露于蓝光照射以光交联GelMA核心，最后将微囊收集起来。为了验证核壳微囊两种不同水凝胶材料的分层，本发明实施例所有操作均在室温下的生物安全柜中进行。采用NanoMeasurer V1.2.5尺寸分析软件对总共350～400个随机光镜图像的微囊进行粒径分析。
如图4所示，利用本发明实施例提供的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法可以制备得到粒径小、均一的球形核壳微囊，其中，(A)示出了共轴静电液滴法制备核壳微囊示意图；(B)示出了GelMA被染色液着色后数分钟内所制备的微囊；(C)示出了制备的微囊的局部放大图；比例尺：200μm；(D)示出了制备得到的核壳微囊的尺寸分布直方图；(E)示出了GelMA核心的尺寸分布直方图。
可见，本发明实施例中GelMA-海藻酸盐核壳微囊制备完成即沉降到器皿底部，既不互相粘连，也不与收集皿底部粘连，原材料损失少，产率高。通过对GelMA进行染色，进一步验证核壳微囊中不同材料的分层，以蓝色GelMA为核心，以未染色的海藻酸盐为壳层，大多数染成蓝色的GelMA核心显示了核壳微囊的偏心结构，如图(C)所示。整个微囊的平均直径为359.2±12.1μm，而核心GelMA微凝胶的直径为277.6±25.6μm。
实施例2
制备得到的核壳微囊的直径直接影响营养物质和氧气的扩散。因此，本发明实施例对相关工艺参数进行了筛选，外加电压(10～15kV)、核液(GelMA溶液)流速(10～20μl/min)、壳液(海藻酸盐溶液)流速(45～120μl/min)。进一步对液体流速、电压进行了优化，每次只改变其中一个变量，而其余变量保持不变。
用显微镜观察并用Image J测量了在不同电压和流速下泰勒锥射流产生的核壳微囊的直径。在不同的喷射电压下制备得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粒径变化结果分析图，如图5所示：
由图可知，随着外加电压从12kV增加到13kV，制备得到的核壳微囊的核心的平均直径从313.4μm降低到277.4μm，微囊整体的平均直径从363.9μm下降到345.9μm；超过13kV后，两者的直径随着电压增加而增加，14.5kV核心和微囊平均直径分别为361.1μm和403.1μm。在外加电压小于13.5kV时，核壳微囊的平均直径小于400μm，因此制备体积小，形貌较好的核壳微囊的最佳电压为13kV。
在此最适施加电压下，对核液流速和壳液流速进行了筛选，得到在不同的核液流速和壳液流速制备得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粒径变化结果分析图，如图6所示：
当核液流速保持一定时，随着壳液流速的增加，核心平均直径基本不发生明显变化，均维持在250-280μm之间，而微囊整体平均直径逐渐变大。当壳液流速保持一定时，核液流速增加与两者的平均粒径变化无明显影响。包封细胞时为了尽可能缩短细胞离开培养基的时间，降低其活性受影响的可能性，最终选择核液流速和壳液流速分别为15μl/min和60μl/min来制备载细胞核壳结构。
实施例3
采用离心管收集第3-5代人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)，与5％w/v浓度的GelMA水凝胶前体溶液充分混匀，配置成细胞浓度为3×106/ml的细胞悬液，根据实施例1中的方法制备载细胞核壳微囊，收集后置于6孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养并观察细胞形态。细胞3D长期培养后，为了验证溶解壳层的操作对细胞后续发挥功能无明显影响，本发明实施例中，用柠檬酸钠溶液溶解掉海藻酸盐壳层，得到载hDPSCs的GelMA微球，类似球形。将其重新接种平板上，一天后，黏附在平板的微球上的hDPSCs开始从微球上往平板迁移爬行，迅速增殖，3天局部汇合度便达到70％以上，同时在细胞的作用下，GelMA微球很快降解消失。
图7是利用本发明实施例得到的GelMA-海藻酸盐核壳微囊体外3D培养及细胞再接种的试验结果示意图。其中，(A)、(B)、(C)分别示出了载hDPSCs的核壳微囊体外培养1天、4天和14天的光镜图像；(D)示出了核壳微囊粒径随着时间的变化趋势；(E)和(F)分别示出了长期培养后溶解掉壳层，得到的载细胞GelMA微球低倍镜(×4)光镜图和高倍镜(×10)光镜图；(G)(H)分别示出了细胞聚集体再次接种于平板第1和3天的生长状态；其中，(A)(B)(E)的比例尺为：500μm；(C)、(F)(G)(H)的比例尺为：100μm。
由图7中(A)可见，hDPSCs的加入并未影响微囊的形态和粒径，并且细胞较均匀的分布在内层核心GelMA中。由图7中(B)(C)可见，封装在GelMA核心中的hDPSCs可以在体外培养过程中正常存活、铺展和增殖。此外，经过较长时间(14天)的培养，GelMA核心中的细胞没有迁移到海藻酸盐壳层中，并且也未发生相邻的微囊相互融合的现象。可见，采用本发明实施例提供的方法制得的核壳微囊，经过几次简单的生理盐水或PBS清洗可以直接用来细胞3D培养，在实际应用中更省时和方便。此外，海藻酸盐壳层还可有效避免相邻的微球聚集，为长期稳定的3D细胞培养提供隔室。并且采用本发明实施例提供的方法制得的核壳微囊可以方便的在普通培养板中进行体外培养，降低了未来临床转化的生产成本。
由图7中(D)可见，在培养一段时间后，GelMA核和核壳微囊的粒径有所增加，两者的平均粒径在培养3天后几乎达到最大。
由图7中(E)、(F)可见，用柠檬酸钠溶液溶解掉海藻酸盐壳层，得到的载hDPSCs的GelMA微球。由图7中(G)、(H)可见，接种一天后，黏附在平板的微球上的hDPSCs开始从微球上往平板迁移爬行，迅速增殖，3天局部汇合度便达到70％以上，同时在细胞的作用下，GelMA微球很快降解消失。可见，溶解壳层后，GelMA核心上的细胞能够保持原有的活力，迁移和扩散到周围其他环境。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法及装置进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
在共轴静电液滴系统的内外通道中分别注入GelMA溶液和海藻酸盐溶液；
在静电电压的作用下，所述GelMA溶液和海藻酸盐溶液从内外双层同心同轴针头的喷嘴喷入收集液中，得到初步交联的核壳微囊；
将所述初步交联的核壳微囊暴露于蓝光下，交联GelMA核心，得到GelMA-海藻酸盐核壳微囊；
其中，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的海藻酸盐壳层作为隔室防止所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粘连，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的GelMA核心提供细胞黏附着和生长基质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
配置GelMA前体溶液和所述海藻酸盐溶液，将目标细胞和与所述GelMA前体溶液充分混匀，得到所述GelMA溶液，所述GelMA溶液中的细胞浓度为3×106/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内外双层同心同轴针头包括：28G的内针和21G的外针，所述内针插入所述外针，所述内针的外径为：350μm，内径为：170μm，所述外针的外径为：810μm，内径为：510μm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述内外双层同心同轴针头的喷嘴尖端到收集液面的垂直距离保持在4cm恒定，以形成稳定的泰勒锥。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，基于所述内外双层同心同轴针头，所述GelMA溶液的流速为10～20μl/分钟，所述海藻酸盐溶液流速45～120μl/分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述收集液为CaCl2溶液，所述收集液的浓度为1％-5％w/v。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述GelMA溶液的浓度为5.0％w/v，所述海藻酸盐溶液的浓度为1.8％w/v，以使所述海藻酸盐壳层顺利包住GelMA核心，形成单分散性良好的球状核壳微囊，并且使GelMA溶液在预设时间内充分交联。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述静电电压的大小为12kV-13.5kV，以制备体积小，形状为球形的核壳微囊。
9.一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备装置，其特征在于，所述装置用于执行上述权利要求1-8中任意一项所述的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法，所述装置包括：
高压静电仪，用于提供静电电压；
内外双层同心同轴针头；
具有内外通道的共轴静电液滴系统；
两个微量注射泵，用于分别调节内通道的GelMA溶液和外通道的海藻酸盐溶液的流速。
10.一种GelMA-海藻酸盐核壳微囊，其特征在于，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊由上述权利要求1-8中任意一项所述的GelMA-海藻酸盐核壳微囊的制备方法制得，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊包括：海藻酸盐壳层和GelMA核心；
所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的海藻酸盐壳层作为隔室防止所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的粘连，所述GelMA-海藻酸盐核壳微囊的GelMA核心提供细胞黏附着和生长基质。
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