CN108969801B - 一种具有光热效应的细胞外基质复合薄膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有光热效应的细胞外基质复合薄膜及其制备方法，该方法如下：在可见光致细胞脱附的细胞培养表面上培养细胞，培养过程中加入具有光热效应的纳米颗粒，当形成细胞片层后，清洗并冷冻干燥后在其上再次培养细胞，形成细胞片层，通过光致细胞脱附获得完整的细胞片层，清洗并脱细胞处理进而获得具有光热效应的细胞外基质复合薄膜。本发明方法最终制得的复合薄膜具有光热效应，由细胞外基质堆叠而成，复合的纳米颗粒被完全覆盖于其中，避免了颗粒直接暴露影响薄膜的细胞相容性，可应用于骨组织缺损修复工程等领域。此外本发明的制备方法工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。

Description

一种具有光热效应的细胞外基质复合薄膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及骨组织缺损修复工程领域，具体涉及一种具有光热效应的细胞外基质复合薄膜及其制备方法。
背景技术
组织和器官中的细胞被细胞外基质包围，细胞外基质由各种蛋白质和蛋白多糖组成，不仅为细胞生长提供支持和保护，更重要的是与细胞的相互作用调节细胞的形态发生过程，影响细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。有研究表明，轻度热刺激诱导人间充质干细胞的早期分化并增强从人间充质干细胞分化的成骨细胞的成熟，主要表现为分化早期碱性磷酸酶活性增强，分化中后期骨特异性基因如OSX、OP、BMP2、Rux2等表达的上调。[J Chen,Z DShi,X Y Ji,et al.Enhanced Osteogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells byPeriodic Heat Shock in Self-Assembling Peptide Hydrogel.Tissue Eng Part A,2013,19:716-728]。热疗的主要挑战是如何将热量施加到目标部位以最小化对周围正常组织的影响并防止并发症。具有光热效应的材料能在光照后有效升温，因此，如能获得具有光热效应的细胞外基质复合薄膜，植入骨缺损处后对其施加光照达到目标部位的升温，诱导新骨形成，在骨组织缺损修复工程具有很强的实际应用意义和研究价值。
在体外培养过程中，细胞本身在与基板连接处分泌出一层细胞外基质。如果进行胰酶处理，细胞外基质在细胞脱离培养表面之前就会被消化掉，无法获得所需的细胞外基质层。而单纯的机械剥离，会导致细胞外基质超微结构发生一定改变，进而影响其后续对其它细胞增殖分化的作用。
本发明在近年来报道的光致细胞薄层获取技术基础上，开发了一种具有光热效应细胞外基质复合薄膜。该方法利用光致细胞薄层脱附技术能够获得具有细胞外基质含量高、活性功能良好的细胞薄层的特点[Y Hong,M F Yu,W J Weng,K Cheng,H M Wang,JLin.Light-induced cell detachment for cell sheet technology.Biomaterials,2013,34(1):11-18]，在细胞培养过程中加入不同的具有光热效应的颗粒，并经过一系列的处理获取了一种具有光热效应细胞外基质复合薄膜。该方法获得的细胞外基质薄膜保持了原有的超微结构和组成成分，同时具有良好的机械性能，并且具有光热效应的颗粒均匀分布于复合薄膜中，可应用于骨组织缺损修复工程等领域。本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用，所得到的复合薄膜具有良好的光热效应、生物相容性和组织修复特性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有光热效应细胞外基质复合薄膜及其制备方法，所述的具有光热效应细胞外基质复合薄膜可通过控制具有光热效应的纳米颗粒的种类、浓度及添加时间去调控细胞外基质的结构及光热性能。
一种具有光热效应细胞外基质复合薄膜，由细胞外基质与具有光热效应的纳米颗粒组成，所述的纳米颗粒被完全覆盖于细胞外基质间，所述的复合薄膜因细胞外基质堆叠而具有均匀致密的三维网状结构和良好的生物相容性。
其制备方法，包括如下步骤：
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2～1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2～3天换液一次，培养周期为5～10天，在培养周期的最后1～3天加入20～100μg/mL具有光热效应的纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的具有光热效应颗粒复合的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2～1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2～3天换液一次，培养周期为5～10天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃～-20℃冷冻30～60min，取出后在25～37℃解冻20～45min，上述冷冻-解冻过程循环重复3～10次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
所述的细胞培养表面采用TiO2纳米点薄膜。
所述的具有光热效应的纳米颗粒为纳米石墨烯颗粒、纳米氧化石墨烯颗粒、纳米还原氧化石墨烯颗粒、纳米金球颗粒、纳米金棒颗粒中的一种或多种。
所述的纳米石墨烯颗粒的直径为10～20nm；纳米氧化石墨烯颗粒的直径为80～100nm；纳米还原氧化石墨烯颗粒的直径为30～40nm；纳米金球颗粒的直径为10～50nm；纳米金棒颗粒的直径为10～20nm，长度为50～60nm。
本发明的薄膜及制备方法具有如下特点：
1)采用TiO2纳米点薄膜作为细胞培养表面进行细胞培养，紫外光照射后，细胞片层从培养表面脱附下来，光致细胞薄层脱附技术有利于减少细胞片层的机械损伤，从而获得完整的细胞片层。
2)具有光热效应的颗粒不仅存在于细胞内而且存在于细胞连接处，最终获取的是颗粒均匀分布的复合薄膜，并且具有良好的光热特性。
3)所获取的具有光热效应细胞外基质复合薄膜不仅保存了细胞外基质的重要组成成分，而且因细胞外基质堆叠而具有均匀致密的三维网状结构。同时纳米颗粒也因细胞外基质堆叠被完全覆盖在细胞外基质间，避免了纳米颗粒与后期接种细胞的直接接触，保留了良好的生物相容性。
本发明的具有光热效应细胞外基质复合薄膜，保持了细胞外基质的超微结构，具有良好的生物相容性及光热效应，为培养同种或异种细胞提供了有利的微环境，有利于细胞的粘附、增殖以及分化。光热效应纳米颗粒的存在，有利于通过外界施加光照来有效的调控目标材料温度的升高，进一步诱导干细胞的定向分化，可应用于骨组织缺损修复工程等领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。
附图说明
图1是复合薄膜示意图,1-b为1-a的空间展开图；
图2是具有光热效应的细胞外基质复合薄膜的拉曼图；
图3是施加光照前后复合薄膜的升温变化折线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为9天，在培养周期的最后1天加入100μg/mL、颗粒直径为10nm的纳米石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为7天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-20℃冷冻45min，取出后37℃解冻20min，上述冷冻-解冻过程循环重复10次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜的示意图如图1所示，图2的拉曼图，证明复合薄膜中有石墨烯存在。图3显示复合薄膜在光照后温度有明显升高，光照20min后薄膜能升温10℃左右，即复合薄膜具有光热效应。
实施例2
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，在培养周期的倒数第2天加入90μg/mL、颗粒直径为15nm的纳米石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照25min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-15℃冷冻40min，取出后37℃解冻25min，上述冷冻-解冻过程循环重复8次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例3
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，在培养周期的倒数第3天加入80μg/mL、颗粒直径为20nm的纳米石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为5天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照20min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃冷冻30min，取出后30℃解冻40min，上述冷冻-解冻过程循环重复7次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例4
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为5天，在培养周期的最后1天加入30μg/mL、颗粒直径为80nm的纳米氧化石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃冷冻40min，取出后37℃解冻30min，上述冷冻-解冻过程循环重复5次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例5
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为2天，在培养周期的最后1天加入35μg/mL、颗粒直径为90nm的纳米氧化石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为10天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照20min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-15℃冷冻50min，取出后25℃解冻45min，上述冷冻-解冻过程循环重复6次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例6
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1200r/min离心3min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，在培养周期的倒数第2天加入25μg/mL、颗粒直径为100nm的纳米氧化石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-20℃冷冻45min，取出后30℃解冻35min，上述冷冻-解冻过程循环重复4次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例7
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为10天，在培养周期的最后1天加入20μg/mL、颗粒直径为30nm的纳米还原氧化石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为8天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照10min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃冷冻60min，取出后37℃解冻40min，上述冷冻-解冻过程循环重复6次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例8
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为9天，在培养周期的倒数第2天加入25μg/mL、颗粒直径为35nm的纳米还原氧化石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为5天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-20℃冷冻35min，取出后25℃解冻30min，上述冷冻-解冻过程循环重复5次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例9
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1200r/min离心3min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，在培养周期的最后1天加入30μg/mL、颗粒直径为40nm的纳米还原氧化石墨烯颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照5min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-20℃冷冻45min，取出后25℃解冻45min，上述冷冻-解冻过程循环重复7次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例10
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，在培养周期的倒数第3天加入40μg/mL、颗粒直径为10nm的纳米金球颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为5天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照20min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-20℃冷冻45min，取出后30℃解冻20min，上述冷冻-解冻过程循环重复4次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例11
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，在培养周期的倒数第3天加入45μg/mL、颗粒直径为30nm的纳米金球颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照25min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃冷冻50min，取出后37℃解冻45min，上述冷冻-解冻过程循环重复6次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例12
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为5天，在培养周期的倒数第2天加入50μg/mL、颗粒直径为50nm的纳米金球颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心5min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为8天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃冷冻60min，取出后37℃解冻30min，上述冷冻-解冻过程循环重复7次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例13
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1200r/min离心3min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为7天，在培养周期的最后1天加入40μg/mL、直径为10nm，长度为50nm的纳米金棒颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为10天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照25min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-20℃冷冻40min，取出后25℃解冻45min，上述冷冻-解冻过程循环重复3次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例14
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，在培养周期的倒数第3天加入加入50μg/mL、直径为15nm、长度为60nm的纳米金棒颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，3天换液一次，培养周期为7天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照20min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃冷冻35min，取出后25℃解冻40min，上述冷冻-解冻过程循环重复5次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
实施例15
(1).对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以1×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为9天，在培养周期的倒数第2天加入45μg/mL、直径为20nm，长度为55nm的纳米金棒颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3).将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理。
(4).将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以2×105个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5％CO2的细胞培养箱内培养，2天换液一次，培养周期为8天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖。
(5).将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6).将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-15℃冷冻45min，取出后30℃解冻30min，上述冷冻-解冻过程循环重复6次，之后用去离子水清洗，获得具有光热效应细胞外基质复合薄膜。

Claims (4)

1.一种具有光热效应的细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，该复合薄膜由细胞外基质与具有光热效应的纳米颗粒组成，纳米颗粒被完全覆盖于细胞外基质之间，包括如下步骤：
(1)对可见光致细胞脱附的细胞培养表面以高压蒸汽灭菌进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2～1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述处理后的细胞培养表面上，并放入37℃恒温、5%CO2的细胞培养箱内培养，2～3天换液一次，培养周期为5～10天，在培养周期的最后1～3天加入20～100μg/mL具有光热效应的纳米颗粒，最终在细胞培养表面上形成完整的具有光热效应颗粒复合的细胞片层；
(3)将经上述培养后的培养表面用PBS清洗，然后浸泡于去离子水后进行冷冻干燥，获得载有细胞外基质复合薄膜的培养表面，并对表面进行紫外光照灭菌处理；
(4)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用高糖DMEM培养基混悬，并用计数板计数，以5×104个/cm2～1×106个/cm2的细胞密度将细胞接种于上述获得的载有细胞外基质复合薄膜的培养表面上，并放入37℃恒温、5%CO2的细胞培养箱内培养，2～3天换液一次，培养周期为5～10天，最终在已有的复合薄膜表面形成完整的细胞片层，实现细胞外基质对纳米颗粒的完全覆盖；
(5)将经上述培养后的培养表面移入PBS中，通过波长365nm的紫外光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水对脱附后的细胞片层反复清洗；
(6)将细胞片层浸泡于去离子水中，置于-5℃～-20℃冷冻30～60min，取出后在25～37℃解冻20～45min，上述冷冻-解冻过程循环重复3～10次，之后用去离子水清洗，获得最终具有光热效应细胞外基质复合薄膜。
2.根据权利要求1所述的具有光热效应的细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，所述的具有光热效应的纳米颗粒为纳米石墨烯颗粒、纳米氧化石墨烯颗粒、纳米还原氧化石墨烯颗粒、纳米金球颗粒、纳米金棒颗粒中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的具有光热效应的细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，所述的纳米石墨烯颗粒的直径为10～20nm；纳米氧化石墨烯颗粒的直径为80～100nm；纳米还原氧化石墨烯颗粒的直径为30～40nm；纳米金球颗粒的直径为10～50nm；纳米金棒颗粒的直径为10～20nm，长度为50～60nm。
4.根据权利要求1所述的具有光热效应的细胞外基质复合薄膜的制备方法，其特征在于，所述的可见光致细胞脱附的细胞培养表面是具有TiO2纳米点薄膜的细胞培养表面。
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