CN101032430A - 一种制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的方法，先依据仿生学原理，建立骨软骨一体化支架CAD模型；选用II型胶原和壳聚糖制成胶原/壳聚糖、II型胶原和羟基磷灰石制作胶原/羟基磷灰石微聚体干粉；骨软骨支架CAD模型转化成快速成型文件格式(STL)输入三维打印快速成型机，铺粉装置铺设计定粉材，微型喷头在每一层铺好的粉末材料上有选择地喷射戊二醛，喷有粘合剂的位点被粘结在一起，去除多余粉材后即可得到含功能界面组织工程骨软骨仿生一体化支架。本发明具有良好的生物相容性利于软骨细胞粘附、增生和分化；能调控软骨支架的降解速度和机械强度，有利于成骨细胞粘附、增生和分化，可以增加支架的机械强度；移植到患者体内后能够承受正常状态的应力作用，满足植入部位的力学要求；使其降解吸收速度与宿主体内新生组织生长速度相匹配。

Description

一种制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的方法

技术领域

本发明属于医用生物材料制备技术领域，涉及一种制备组织工程骨软骨支架的方法，尤其是含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的制备方法。

背景技术

由创伤或骨病所致关节部位骨软骨缺损临床常见，严重影响患者生活质量，已成为目前肢体残障的主要原因之一。美国发病率为1.5‰～3‰，我国约为美国的5～6倍，且呈逐年上升趋势。临床现有治疗措施均存在明显缺陷，其保守治疗和关节清理术只能暂时缓解疼痛，不能阻止病程的发展；自体骨软骨移植术可造成供区损伤，且来源有限，难以修复较大面积的缺损；异体骨软骨移植术存在免疫排斥反应及传播疾病的可能；人工关节置换术则费用昂贵、并发症较多、翻修率较高，特别是对年轻患者的身心影响大、经济负担重。近年快速发展的组织工程技术，为其再生修复提供了新策略。

目前，单一组织工程软骨和骨组织的构建技术日趋成熟，部分成果已试用于临床，为组织工程技术再生修复骨软骨复合组织缺损奠定了良好的基础。组织工程骨软骨复合组织的再造研究，已经历“分层构建”的可行性初探和近年“一体化构建”的动物实验。然而实验研究发现，其缺损区修复组织质量缺陷、与宿主界面整合欠佳，并缺乏相应的力学功能，致使这一关节部位骨软骨缺损再生的治疗策略难以由动物实验向临床应用过渡。综合分析推断，导致上述问题的主要原因是制备的工程化骨软骨支架不理想，即支架设计、选材和制备工艺尚存在不足。

理想的工程化骨软骨复合组织构建策略不是将再造的软骨和骨组织简单地缝合或粘合在一起，具有功能界面的一体化三维支架构建是决定成败的关键。因此，构建仿生功能界面(钙化层结构)的设想势必解决再造组织质量缺陷、移植物与宿主整合欠佳等问题，这是因为：①通过仿生钙化层特殊界面结构可以将软骨牢固地固定在软骨下骨上，防止植入体内后软骨从软骨下骨上脱离体，从而有利于移植物与宿主界面整合。②利用钙化层结构致密性使植入体内的骨软骨复合组织象宿主一样自然分为氧和营养丰富的成骨微环境、氧和营养缺乏的成软骨微环境，防止植入细胞在成骨性和成软骨性支架间迁移，促进特定区域细胞利用各自微环境向特定方向增殖、分化。

理想的支架材料应具有良好的生物相容性，利于细胞粘附、增生和分化；可降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配；良好的机械特性，能满足植入部位的力学要求。研究表明，正常关节骨软骨复合组织中，软骨细胞外基质主要由II型胶原和蛋白多糖组成、钙化层主要由II型胶原和羟基磷灰石组成、软骨下骨细胞外基质主要由I型胶原和羟基磷灰石组成。目前，组成骨软骨复合组织的医用仿生材料业已上市，国内外生物材料公司均有销售，且具有良好的生物相容性和可控降解性能。因此，仿生材料选择与应用势必解决上述不足。

理想个组织工程骨软骨支架制备需与先进的制备工艺相结合。以往研究多采用层压、熔融铸形及纤维粘结等传统方法制作骨软骨复合支架，工艺复杂、重复性较差，难以实现产业化生产；并且制造的三维支架形状规则，常为长方形或圆柱形，难以满足形状多变的骨软骨缺损。近年来三维打印技术逐渐成熟并在单一组织工程骨和软骨构建中试用，采用该技术不但可以实现骨软骨复合支架一体化制造，同时还可以使其具有临床需要的特定解剖外形和内部空间结构。

实现组织工程骨软骨支架的仿生制备，除了考虑支架仿生设计和仿生选材外，还必需考虑制备工艺即三维打印快速成型技术对生物材料理化性能的要求。如何使仿生支架材料即满足三维打印技术要求，同时又不丧失其生物活性是本发明的关键技术。

发明内容

本发明针对目前组织工程骨软骨存在的不足，即再造组织质量缺陷、与宿主界面整合欠佳、及缺乏相应的力学功能等问题，采用仿生学原理设计工程化骨软骨仿生支架、选择仿生材料并对其进行调控与修饰、然后应用三维打印快速成型先进制备工艺技术制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架。最后通过体内外实验检测并证实，采用本发明技术制备的组织工程骨软骨支架即可以达到支架材料的理想标准，同时还可以实现其制备的规范化、程序化和产业化。

本发明的技术方案包括以下步骤：

(1)依据仿生学原理，根据骨软骨缺损的大小和正常骨软骨的超微结构，应用计算机辅助设计软件建立具有特定解剖外形和仿生内部空间结构的工程化骨软骨一体化支架CAD模型；

(2)根据正常骨软骨各层的组分及比例购买或自制仿生支架原材料，即选用II型胶原和壳聚糖作为软骨支架材料、II型胶原和羟基磷灰石作为钙化层支架材料、I型胶原和羟基磷灰石作为软骨下骨支架材料；然后采用理化交联、矿化结晶及喷雾干燥等技术方法对选定生物材料进行修饰，制成胶原/壳聚糖、胶原/羟基磷灰石微聚体干粉，使其即满足三维打印技术要求又不丧失其生物学活性；

(3)将设计好的工程化骨软骨支架CAD模型转化成快速成型文件格式(STL)输入三维打印快速成型机，铺粉装置铺设计定粉材，微型喷头在每一层铺好的粉末材料上有选择地喷射粘合剂(戊二醛)，喷有粘合剂的位点被粘结在一起，其它地方仍为粉末起支撑作用，去除多余粉材后即可得到含功能界面组织工程骨软骨仿生一体化支架。此外，除了用戊二醛对粉材进行交联外，还可以采用紫外线、温控等辅助方法增加粉材的粘结速度和粘结强度。

(4)支架打印完成后去离子水反复漂洗，低温冻干，X-射线消毒后密封低温储存。

本发明包括以下两种关键技术方法：

(1)一种制备羟基磷灰石/胶原微聚体的方法：

原理：胶原易溶于酸性溶液，碱性、高温条件下胶原分子中带负电荷的梭基游离出来并与羟基磷灰石的Ca²⁺形成稳定具有高结合能的离子键；戊二醛具有两个功能醛基，低温和酸/中性条件下，能够与胶原多肽链的赖氨酸和羟赖氨酸的氨基酸残基反应形成稳定的共价键N-C，当胶原分子的氨基与戊二醛反应后，大量的原来与氨基结合的梭基游离出来，可以加强胶原与羟基磷灰石之间的键合，形成稳定的羟基磷灰石/胶原“聚合体”。因此，利用羟基磷灰石和胶原的理化特性，通过调控反应体系的温度和pH值，使羟基磷灰石以共价键接合方式在胶原表面矿化结晶；戊二醛交联羟基磷灰石周围的胶原，从而形成内为羟基磷灰外层胶原包裹的羟基磷灰石/胶原微聚体。

制备方法包括以下步骤：

①将胶原溶于0.01mol/L～0.1mol/L酸性溶液(盐酸或醋酸溶液)中，充分搅拌使胶原完全溶解，制备成1％～10％胶原-酸溶胀液；

②配制羟基磷灰石水溶液，浓度为3％～10％；

③将胶原-酸溶胀液加入烧杯，置于温控磁力搅拌机上；边搅拌边缓慢加入羟基磷灰石水溶液；必要时，用去离子水调整反应体系体积；

在将羟基磷灰石水溶液加入胶原-酸溶胀液中后，加入NaCI以提高溶液的稳定性。

④充分混均后，启动温控按钮，升高反应体系温度并控制在25℃～37℃；调整溶液pH值在8～12，继续搅拌10～20min；

⑤降低反应体系温度并控制在8℃～10℃，调整溶液pH值在7.35～7.45之间，边搅拌边滴加戊二醛水溶液，控制浓度在0.1％～0.5％之间，滴加完后继续搅拌1h～2h；

⑥升高反应体系温度并控制在25℃～37℃；静置保温16h～24h；

⑦用去离子水反复漂洗去除溶液中杂质，喷雾干燥机干燥、收集、分装密封，X-射线辐照消毒后低温保存。

(2)一种制备胶原/壳聚糖微聚体干粉的方法：

原理：戊二醛具有两个功能醛基，低温和酸性条件下，能够与胶原多肽链的赖氨酸和羟赖氨酸的氨基酸残基反应形成稳定的共价键N-C，当胶原分子的氨基与戊二醛反应后，大量的原来与氨基结合的梭基游离出来，于是胶原分子的梭基将与壳聚糖分子中活泼的羟基键合，形成稳定的胶原/壳聚糖“聚合体”。因此，利用胶原和壳聚糖的理化特性，通过调控反应体系的温度和pH值，以及加入戊二醛作为交联剂，制备壳聚糖和胶原共混“微聚体”。

制备方法包括以下步骤：

①将II型胶原溶于0.2mol/L～0.5mol/L酸性溶液(盐酸或醋酸溶液)中，充分搅拌使胶原完全溶解，制备0.1％～0.5％胶原-酸溶胀液；同法配制0.1％～0.5％壳聚糖-酸溶胀液；

②将胶原-醋酸溶胀液加入烧杯，置于温控磁力搅拌机上；按比例缓慢加入壳聚糖-酸溶胀液；pH值控制器调整溶液pH值(pH＝2～6)，继续搅拌10min～20min；

③然后降低反应体系温度，并控制在4℃～10℃，边搅拌边滴加戊二醛水溶液终浓度为0.1％～0.5％，滴加完后继续搅拌16h～24h；

④去离子水反复漂洗去除杂质，喷雾干燥机干燥、收集、分装、低温保存。

采用本发明技术制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架，与现有的制备技术相比，具有以下特点：

(1)结构--功能特点：仿生一体化支架由软骨层、钙化层和软骨下骨构成，其中，①软骨层支架具有适合软骨细胞增殖、分化的内部空间结构；②软骨下骨层支架具有适合成骨细胞增殖、分化的内部空间结构；③利用钙化层凸凹不平的界面结构增加支架间的连接面积和连接强度，将软骨支架牢固地锚合在软骨下骨上，植入体内后利于组织间应力分散，防止组织间分层。利用钙化层致密结构阻止植入细胞在成骨性和成软骨性支架间迁移，利于特定区域的细胞利用各自微环境向特定方向增殖、分化，从而加强移植物与宿主之间的界面整合。

(2)组成--功能特点：①选用II型胶原和壳聚糖作为软骨层支架材料，一方面仿生材料具有良好的生物相容性利于软骨细胞粘附、增生和分化；另一方面可以通过控制II型胶原和壳聚糖的组成比例来调控软骨支架的降解速度和机械强度；②选用I型胶原和羟基磷灰石作为软骨下骨层支架材料，一方面有利于成骨细胞粘附、增生和分化；另一方面可以增加支架的机械强度；③选用II型胶原和羟基磷灰石作为钙化层支架材料，使界面组成同时具有与软骨相同的II型胶原和与软骨下骨相同的羟基磷灰石，即加强了组织间的连接强度，同时避免因不同组织伸缩性和溶胀性不同导致的界面分离。

(3)通过人工调控仿生材料的组成、比例及其理化特性，实现支架机械强度和降解吸收速度的可控性，使其具有良好的机械特性，移植到患者体内后能够承受正常状态的应力作用，满足植入部位的力学要求；使其降解吸收速度与宿主体内新生组织生长速度相匹配。例如，一体化支架中羟基磷灰石完全被胶原包裹，羟基磷灰石决定支架的刚性，为分散相；胶原决定支架的韧性，为连续相；外露胶原同时具有良好的生物相容性有利用细胞粘附、增殖。通过调整羟基磷灰石颗粒的大小、外层胶原的厚度，实现支架机械强度和降解吸收在一定范围内的可控性。微聚体中羟基磷灰石颗粒越大、外层胶原越薄，支架的机械强度就越大，降解吸收就越慢。

(4)采用本发明技术制备的组织工程骨软骨支架能够达到工程化支架材料的理想标准，同时具有操作简单、成型精度高、重复性好等优点，可以实现一体化支架制备的规范化、程序化和产业化。

具体实施方式

结合实施例详述本发明技术：

1.根据人体正常关节骨软骨复合组织的超微结构确定组织工程骨软骨支架内部三维结构相关参数，其外形限度为直径为5mm、高为1cm圆柱状，实际需要的解剖外形可以通过MRI影像技术获得。然后应用计算机辅助设计软件(CAD)建立骨软骨复合组织一体化支架模型。该支架自上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层三部分组成，各层具有不同的组成成分和内部空间结构，各层之间借助钙化层特殊组成和结构紧密连接。本发明所用的计算机辅助设计软件(CAD)，是一种现有技术，本领域的技术人员根据本文披露的内容，能够设计或编制出该设计软件，在此不做详述。

                  组织工程骨软骨一体化支架主要结构参数

分层	厚度(mm)	直径(mm)	孔隙率(％)	孔径(μm)	孔通率(％)
						软骨层钙化层软骨下骨	2.5～3.50.01～0.355.5～6.5	555	85～90055～60	100～1500200～500	100％0100％

2.根据人体正常关节骨软骨复合组织的基本组分确定支架各层构成的仿生材料与组成比例，选用II型胶原和壳聚糖作为软骨支架材料、II型胶原和羟基磷灰石作为钙化层支架材料、I型胶原和羟基磷灰石作为软骨下骨支架材料。然后依据仿生材料的理化特性，采用理化交联、矿化结晶及喷雾干燥等技术方法对选定生物材料进行修饰，制成胶原/壳聚糖、胶原/羟基磷灰石“微聚体”干粉，使其即满足三维打印技术要求又不丧失其生物学活性；该制备过程采用的三维打印技术，是一种现有技术，可参阅名称为“三维打印成型设备及方法”、专利申请号为200510029726.9的中国发明专利申请文件，或参阅名称为“一种制作三维物体和支撑的打印成型方法”、专利申请号为200610038580.9的中国发明专利申请文件。

              组织工程骨软骨一体化支架组成成分及比例

分层	羟基磷灰石(wt％)	I型胶原(wt％)	II型胶原(wt％)	壳聚糖(wt％)
					软骨层钙化层软骨下骨	/60～7075～80	//20～25	80～9030～40/	10～20//

注：医用纳米羟基磷灰石(南京海泰纳米材料有限公司)；医用I型胶原和II型胶原(四川铭让生物科技有限公司研制)

(1)羟基磷灰石/胶原微聚体研制

制备羟基磷灰石/胶原微聚体干粉的步骤：

①将胶原溶于0.01mol/L HCl溶液中，充分搅拌使胶原完全溶解，制备2％胶原-盐酸溶胀液；配制5％羟基磷灰石水溶液。

②将胶原-盐酸溶胀液加入烧杯，置于温控磁力搅拌机上；边搅拌边缓慢加入羟基磷灰石水溶液。去离子水调整反应体系中溶质浓度，加入适量NaCI以提高溶液的稳定性。

③升高反应体系温度并控制在25℃～37℃；pH值控制器调整溶液pH值(pH＝8～12)，继续搅拌10～20min；

④降低反应体系温度并控制在8℃～10℃，调整溶液pH值(pH＝7.35～7.45)，边搅拌边滴加戊二醛水溶液终浓度为0.1％～0.5％，滴加完后继续搅拌1h～2h；

⑤升高反应体系温度并控制在25℃～37℃；静置保温16h～24h；

⑥去离子水反复漂洗去除溶液中杂质，喷雾干燥机干燥、收集、分装密封，X-射线辐照消毒后低温保存。

⑦扫描电镜(SEM)检测微聚体大小、形态及表面胶原和羟基磷灰石分布情况；透射电镜(TEM)检测微聚体内部胶原和羟基磷灰石的大小、形态及分布情况；X-射线衍射仪(XRD)检测微聚体内羟基磷灰石结晶情况；X-射线光电子能谱(XPS)检测微聚体构成元素的组成情况；傅利叶变换红外光谱(FT-IR)检测微聚体内各分子基团之间键合能改变情况；差示扫描量热分析(DSC)检测微聚体热差改变情况。

⑧根据检测结果对微聚体制备技术进行优化，通过调整物相颗粒大小，组成比例，聚合、交联的温度和pH值等使制备的微聚体满足项目设计要求。

(2)II型胶原/壳聚糖微聚体研制

制备II型胶原/壳聚糖微聚体干粉的步骤：

①将II型胶原溶于0.5mol/L醋酸溶液中，充分搅拌使胶原完全溶解，制备0.5％胶原-醋酸溶胀液；同法配制0.5％壳聚糖-醋酸溶胀液。

②将胶原-醋酸溶胀液加入烧杯，置于温控磁力搅拌机上；按比例缓慢加入壳聚糖-醋酸溶胀液；pH值控制器调整溶液pH值(pH＝2～6)，继续搅拌10min～20min；。

③降低反应体系温度并控制在4℃～10℃，边搅拌边滴加戊二醛水溶液终浓度为0.1％～0.5％，滴加完后继续搅拌16h～24h；

④去离子水反复漂洗去除杂质，喷雾干燥机干燥、收集，双层聚乙烯薄膜小袋分装，低温保存。

⑤对制备的微聚体进行相关检测，根据检测结果对微聚体制备技术进行优化，通过调整物相颗粒大小，组成比例，交联的温度和pH值等使制备的微聚体满足项目设计要求。

3.将设计好的关节骨软骨复合支架CAD模型转化成快速成型文件格式(STL)输入三维打印机。铺粉装置铺设上述研制粉材，0.25％戊二醛使粉材使粉材中的胶原交联粘结，还可以通过紫外线照射和温控等措施增加交联速度和提高交联强度。支架打印完成后去离子水反复漂洗，低温冻干，X-射线消毒后密封低温储存。

4.依据ISO10993系列标准，采用SEM、XRD、FTIR、力学实验、降解性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验等方法对支架的形态结构、力学性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能进行检测。检测结果证明本发明的骨软骨复合组织工程支架具有设计要求的内部空间结构和组成比例；具有良好的组织相容性和生物安全性，利于细胞粘附、增生；具有良好的机械强度，能够满足植入部位的力学要求；具有可控降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配。

5.采用该支架结合种子细胞制备技术、双相凝胶接种技术及组织块体外培养技术构建工程化骨软骨复合组织；大动物(猪)体内植入修复实验结果表明采用本发明的骨软骨复合组织工程支架构建的工程化骨软骨复合组织植入体内后与周围正常组织完全整合，降解时间与周围新生组织生长速度基本匹配；修复组织软骨部分具有类似天然关节软骨的生物学特性、软骨下骨部分能够在较短时间内与宿主骨组织产生骨性结合。

Claims (5)

1.一种制备含功能界面的组织工程骨软骨仿生一体化支架的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)依据仿生学原理，根据骨软骨缺损的大小和正常骨软骨的超微结构，应用计算机辅助设计软件建立具有特定解剖外形和仿生内部空间结构的工程化骨软骨一体化支架CAD模型；

(2)根据正常骨软骨各层的组分及比例购买或自制仿生支架原材料，选用II型胶原和壳聚糖作为软骨支架材料、 II型胶原和羟基磷灰石作为钙化层支架材料、I型胶原和羟基磷灰石作为软骨下骨支架材料；然后采用理化交联、矿化结晶及喷雾干燥技术方法对选定生物材料进行修饰，制成胶原/壳聚糖、胶原/羟基磷灰石微聚体干粉，使其即满足三维打印技术要求又不丧失其生物学活性；

(3)将设计好的工程化骨软骨支架CAD模型转化成快速成型文件格式(STL)输入三维打印快速成型机，铺粉装置铺设计定粉材，微型喷头在每一层铺好的粉末材料上有选择地喷射粘合剂(戊二醛)，喷有粘合剂的位点被粘结在一起，其它地方仍为粉末起支撑作用，去除多余粉材后即可得到含功能界面组织工程骨软骨仿生一体化支架；

(4)支架打印完成后去离子水反复漂洗，低温冻干，X-射线消毒后密封低温储存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的制备胶原/羟基磷灰石微聚体干粉包括以下步骤：

(1)将胶原溶于0.01mol/L～0.1mol/L酸性溶液(盐酸或醋酸溶液)中，充分搅拌使胶原完全溶解，制备成1％～10％胶原-酸溶胀液；

(2)配制羟基磷灰石水溶液，浓度为3％～10％；

(3)将胶原-酸溶胀液加入烧杯，置于温控磁力搅拌机上；边搅拌边缓慢加入羟基磷灰石水溶液；必要时，用去离子水调整反应体系体积；

(4)充分混均后，启动温控按钮，升高反应体系温度并控制在25℃～37℃；调整溶液pH值在8～12，继续搅拌10～20min；

(5)降低反应体系温度并控制在8℃～10℃，调整溶液pH值在7.35～7.45之间，边搅拌边滴加戊二醛水溶液，控制浓度在0.1％～0.5％之间，滴加完后继续搅拌1h～2h；

(6)升高反应体系温度并控制在25℃～37℃；静置保温16h～24h；

(7)用去离子水反复漂洗去除溶液中杂质，喷雾干燥机干燥、收集、分装密封，X-射线辐照消毒后低温保存。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的制备胶原/壳聚糖微聚体干粉包括以下步骤：

(1)将II型胶原溶于0.2mol/L～0.5mol/L酸性溶液(盐酸或醋酸溶液)中，充分搅拌使胶原完全溶解，制备0.1％～0.5％胶原-酸溶胀液；同法配制0.1％～0.5％壳聚糖-酸溶胀液；

(2)将胶原-醋酸溶胀液加入烧杯，置于温控磁力搅拌机上；按比例缓慢加入壳聚糖-酸溶胀液；pH值控制器调整溶液pH值(pH＝2～6)，继续搅拌10min～20min；

(3)然后降低反应体系温度，并控制在4℃～10℃，边搅拌边滴加戊二醛水溶液终浓度为0.1％～0.5％，滴加完后继续搅拌16h～24h；

(4)去离子水反复漂洗去除杂质，喷雾干燥机干燥、收集、分装、低温保存。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的酸性溶液是盐酸或醋酸溶液。

5.根据权利要求2或4所述的制备羟基磷灰石/胶原微聚体的方法，其特征在于：在将羟基磷灰石水溶液加入胶原-酸溶胀液中后，加入NaCI以提高溶液的稳定性。