CN104399119B - 基于3d生物打印制备高力学性能软骨的方法 - Google Patents

基于3d生物打印制备高力学性能软骨的方法 Download PDF

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本发明提供了一种基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，包括蚕丝纤维制备、明胶溶液制备、含细胞的生物墨水制备、3D软骨打印、将打印好的组织进行细胞培养分化形成软骨的步骤。本发明利用3D生物打印技术解决了细胞二维培养的两极分化及细胞高体表比问题；通过藻朊酸钠与钙离子形成离子键、明胶与甲基丙烯酸酐形成共价键使3D打印软骨具有优异的力学性能且不易破裂；明胶除了具有普通生物材料类水凝胶的生物相容性及可降解特性外，还有生物活性，对细胞的生长和分化以及细胞功能的实现十分有利。

Description

基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法
技术领域
本发明属于3D生物打印技术领域，特别涉及一种基于3D生物打印制备具有利于细胞生长分化环境的高力学性能软骨的方法。
背景技术
现阶段仿生软骨研究所用支架材料大部分为凝胶类材料，PVA、PEG由于具有无毒、亲水、可降解及细胞相容性被大量研究，但是这些水凝胶的拉伸断裂能小，约为10Jm‐ 2(软骨约为1000Jm‐ 2)，凝胶内裂纹对其力学性能影响巨大，力学性能差；市场上合成水凝胶具有优异的力学性能，拉伸断裂能大，凝胶内裂纹对其力学性能影响小，但是这些水凝胶不能进行细胞的培养；上述材料都不具有可以使细胞多样性及多功能的生物活性。传统的细胞培养是在如培养皿般的二维表面进行，虽然这种方法简单快捷，但是培养表面非常坚硬的，会导致细胞的两极分化以及人为细胞高体表比。
发明内容
本发明目的是要提供一种基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，以解决现有技术中仿生软骨存在的力学性能差，细胞存活率小的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，包括如下步骤：
a)蚕丝纤维制备：蚕茧剪成碎片，将碎片放入碳酸钠溶液中搅拌煮沸，将蚕丝漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴溴化锂溶液后培养，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析，取出透析盒中蚕丝溶液，离心，在4℃下储存；
b)明胶溶液制备：在磷酸缓冲液中加入明胶，不断搅拌直到明胶全部溶解，边 搅拌边向溶液中加入甲基丙烯酸酐溶液，反应，接着用磷酸缓冲液稀释，然后用透析膜在去离子水里透析1周，最后将溶液用冻干1周；
c)含细胞的生物墨水制备：在磷酸缓冲液中加入明胶，搅拌溶解，接着加入藻朊酸钠、二水合硫酸钙、蚕丝纤维、光引发剂，加入软骨干细胞，顺时针轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用；
d)3D软骨打印：在双喷头打印机的喷头A中装入上述含细胞的生物墨水，喷头B内中装入PCL；在37℃温度下，根据设定的程序，喷头B打印出PCL框架，然后喷头A将培养基挤出在PCL特定间隙中，形成第一层结构，在第一层结构上面转换方向继续打印，形成第二层结构，第一层和第二层垂直交错布置，如此叠加打印，每一层均与其上下两层的垂直交错，从而形成含有软骨干细胞的软骨结构，打印完成以后，在光下照射；
e)将打印好的组织进行细胞培养分化形成软骨。
步骤a中，将蚕茧剪成边长0.5‐1.0cm碎片，将碎片放入体积摩尔浓度为0.02M的碳酸钠溶液中搅拌煮沸30‐50min，将蚕丝进行三次20min的漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴体积摩尔浓度为7.0‐12.0M的溴化锂溶液在30‐70℃下培养2‐5h，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析24‐60h，取出透析盒中蚕丝溶液，离心两次，在4℃下储存。
步骤b中，在磷酸缓冲液中加入质量浓度为7.0‐12％wt的明胶，在30‐60℃下不断搅拌直到明胶全部溶解，以0.1‐1.0mL/min的速度边搅拌边向溶液中加入0.5‐1.5mL质量浓度为94％的甲基丙烯酸酐溶液，在50℃条件下反应1h，接着用40℃的40mL磷酸缓冲液稀释，然后用12000‐14000透析膜在40℃去离子水里透析1周，最后将溶液用冻干1周。
步骤c中，在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量1％wt‐10％wt的明胶，在 40‐80℃下搅拌溶解，接着加入磷酸缓冲液质量的1％wt‐10％wt的藻朊酸钠、藻朊酸钠质量0.1328倍的二水合硫酸钙、磷酸缓冲液质量的0.01％wt‐0.5％wt的蚕丝纤维、磷酸缓冲液质量的0.01％wt‐1％wt光引发剂，加入软骨干细胞，顺时针轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用。
所述光引发剂为I2959。
基于磷酸缓冲液体积的细胞密度为：5×106cells/mL
步骤d中，在双喷头打印机的喷头B内中装入PCL，PCL的温度为80℃，喷头A中装入含细胞的生物墨水，维持其温度低于15℃；打印完成以后，在8mW/cm2密度的365nmUV光下照射10min。
本发明的有益效果是：本发明利用3D生物打印技术解决了细胞二维培养的两极分化及细胞高体表比问题；以PCL材料形成特殊的支架，PCL是一种半结晶型聚合物，由ε-己内酯用钛催化剂、二羟基或三羟基引发剂开环聚合制得结构为[CH2-(CH2)4-COO]n的聚酯，解决了立体细胞培养问题，而且该结构提供了有利于细胞生长分化的间隙；明胶除了具有普通生物材料类水凝胶的生物相容性及可降解特性外，还有生物活性，对细胞的生长和分化以及细胞功能的实现十分有利；利用藻朊酸钠与钙离子形成离子键、明胶与甲基丙烯酸酐形成共价键提高凝胶的力学性能，使打印形成的软骨具有优异的力学性能而且不易破裂，拉伸断裂能可达到7000Jm‐ 2(软骨约为1000Jm‐ 2，大部分凝胶为10Jm‐ 2)，拉伸长度可达原长20倍，即使凝胶内裂纹存在，也可拉伸至原长的17倍(大部分凝胶拉伸至原长1.2倍，合成凝胶可达10‐20倍，但是有内部裂纹存在会使该值大大降低)；细胞存活率在第一天大于95％，在第7天和第14天分别检测到细胞存活率达到90％；在细胞培养分化的第14天检测到SOX9增加了一倍，说明软骨干细胞成功的向软骨细胞分化。
附图说明
图1是双喷头生物打印的示意图；
图2是三维软骨形成过程的示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)蚕丝纤维制备：将蚕茧剪成边长0.5cm碎片，将碎片放入体积摩尔浓度为0.02M的碳酸钠溶液中搅拌煮沸40min，将蚕丝进行三次20min的漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴体积摩尔浓度为10.0M的溴化锂溶液在70℃下培养3h，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析24h，取出透析盒中蚕丝溶液，离心两次，在4℃下储存。
(2)明胶溶液制备：在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量7.0％wt的明胶，在45℃下不断搅拌直到明胶全部溶解，以0.5mL/min的速度边搅拌边向溶液中加入1.5mL质量浓度为94％的甲基丙烯酸酐溶液，在50℃条件下反应1h，接着用40℃的40mL磷酸缓冲液稀释，然后用12000透析膜在40℃去离子水里透析1周，最后将溶液用冻干1周。
(3)含细胞的生物墨水制备：在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量6％wt的明胶，在60℃下搅拌溶解，接着加入磷酸缓冲液质量的1％wt的藻朊酸钠、藻朊酸钠质量0.1328倍的二水合硫酸钙、磷酸缓冲液质量的0.5％wt的蚕丝纤维、磷酸缓冲液质量的0.5％wt光引发剂，加入软骨干细胞(基于磷酸缓冲液体积的细胞密度：5×106cells/mL)，顺时针轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用。
(4)3D软骨打印：在双喷头打印机的喷头B内中装入PCL，PCL的温度为80℃，喷头A中装入含细胞的生物墨水，维持其温度低于15℃；在37℃温度下，根据 设定的程序，喷头B打印出PCL框架，然后喷头A将培养基挤出在PCL特定间隙中，形成第一层结构，在第一层结构上面转换方向继续打印(具体如图2所示)，形成第二层结构，第一层和第二层垂直交错布置，如此叠加打印，每一层均与其上下两层的垂直交错，形成含有软骨干细胞的软骨结构，打印完成以后，在8mW/cm2密度的365nmUV光下照射10min。
(5)将打印好的组织进行细胞培养分化形成软骨。
本实施例制备的软骨，拉伸断裂为7089Jm‐ 2，拉伸长度为原长的20.6倍，细胞存活率在第一天为96.2％，在第7天和第14天分别检测到细胞存活率分别为90.1％、89.6％；在细胞培养分化的第14天检测到SOX9增加了一倍。
实施例2
(1)蚕丝纤维制备：将蚕茧剪成边长1.0cm碎片，将碎片放入体积摩尔浓度为0.02M的碳酸钠溶液中搅拌煮沸50min，将蚕丝进行三次20min的漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴体积摩尔浓度为7.0M的溴化锂溶液在50℃下培养5h，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析48h，取出透析盒中蚕丝溶液，离心两次，在4℃下储存。
(2)明胶溶液制备：在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量10.0％wt的明胶，在60℃下不断搅拌直到明胶全部溶解，以1.0mL/min的速度边搅拌边向溶液中加入0.5mL质量浓度为94％的甲基丙烯酸酐溶液，在50℃条件下反应1h，接着用40℃的40mL磷酸缓冲液稀释，然后用14000透析膜在40℃去离子水里透析1周，最后将溶液用冻干1周。
(3)含细胞的生物墨水制备：在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量1％wt的明胶，在40℃下搅拌溶解，接着加入磷酸缓冲液质量的5％wt的藻朊酸钠、藻朊酸钠质量0.1328倍的二水合硫酸钙、磷酸缓冲液质量的0.3％wt的蚕丝纤维、磷 酸缓冲液质量的0.01％wt光引发剂，加入软骨干细胞(基于磷酸缓冲液体积的细胞密度：5×106cells/mL)，顺时针轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用。
(4)3D软骨打印：在双喷头打印机的喷头B内中装入PCL，PCL的温度为80℃，喷头A中装入含细胞的生物墨水，维持其温度低于15℃；在37℃温度下，根据设定的程序，喷头B打印出PCL框架，然后喷头A将培养基挤出在PCL特定间隙中，形成第一层结构，在第一层结构上面转换方向继续打印(具体如图2所示)，形成第二层结构，第一层和第二层垂直交错布置，如此叠加打印，每一层均与其上下两层的垂直交错，从而形成含有软骨干细胞的软骨结构，打印完成以后，在8mW/cm2密度的365nmUV光下照射10min。
(5)将打印好的组织进行细胞培养分化形成软骨。
本实施例制备的软骨，拉伸断裂能为6978Jm‐ 2，拉伸长度为原长的19.5倍，细胞存活率在第一天为96.8％，在第7天和第14天分别检测到细胞存活率分别为90.7％、90.1％；在细胞培养分化的第14天检测到SOX9增加了一倍。
实施例3
(1)蚕丝纤维制备：将蚕茧剪成边长0.8cm碎片，将碎片放入体积摩尔浓度为0.02M的碳酸钠溶液中搅拌煮沸30min，将蚕丝进行三次20min的漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴体积摩尔浓度为12.0M的溴化锂溶液在30℃下培养2h，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析60h，取出透析盒中蚕丝溶液，离心两次，在4℃下储存。
(2)明胶溶液制备：在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量12％wt的明胶，在30℃下不断搅拌直到明胶全部溶解，以0.1mL/min的速度边搅拌边向溶液中加入1mL质量浓度为94％的甲基丙烯酸酐溶液，在50℃条件下反应1h，接着用40℃的40mL磷酸缓冲液稀释，然后用13000透析膜在40℃去离子水里透析1 周，最后将溶液用冻干1周。
(3)含细胞的生物墨水制备：在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量10％wt的明胶，在80℃下搅拌溶解，接着加入磷酸缓冲液质量的10％wt的藻朊酸钠、藻朊酸钠质量0.1328倍的二水合硫酸钙、磷酸缓冲液质量的0.01％wt的蚕丝纤维、磷酸缓冲液质量的1％wt光引发剂，加入软骨干细胞(基于磷酸缓冲液体积的细胞密度：5×106cells/mL)，顺时针轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用。
(4)3D软骨打印：在双喷头打印机的喷头B内中装入PCL，PCL的温度为80℃，喷头A中装入含细胞的生物墨水，维持其温度低于15℃；在37℃温度下，根据设定的程序，喷头B打印出PCL框架，然后喷头A将培养基挤出在PCL特定间隙中，形成第一层结构，在第一层结构上面转换方向继续打印(具体如图2所示)，形成第二层结构，第一层和第二层垂直交错布置，如此叠加打印，每一层均与其上下两层的垂直交错，从而形成含有软骨干细胞的软骨结构，打印完成以后，在8mW/cm2密度的365nmUV光下照射10min。
(5)将打印好的组织进行细胞培养分化形成软骨。
本实施例制备的软骨，拉伸断裂为7078Jm‐ 2，拉伸长度为原长的20倍，细胞存活率在第一天为97.1％，在第7天和第14天分别检测到细胞存活率分别为90.4％、89.5％；在细胞培养分化的第14天检测到SOX9增加了一倍。

Claims (7)

1.一种基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a)蚕丝纤维制备：蚕茧剪成碎片，将碎片放入碳酸钠溶液中搅拌煮沸，将蚕丝漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴溴化锂溶液后培养，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析，取出透析盒中蚕丝溶液，离心，在4℃下储存；
b)明胶溶液制备：在磷酸缓冲液中加入明胶，不断搅拌直到明胶全部溶解，边搅拌边向溶液中加入甲基丙烯酸酐溶液，反应，接着用磷酸缓冲液稀释，然后用透析膜在去离子水里透析1周，最后将溶液冻干1周；
c)含细胞的生物墨水制备：在磷酸缓冲液中加入步骤b)制备的明胶，搅拌溶解，接着加入藻朊酸钠、二水合硫酸钙、蚕丝纤维、光引发剂，加入软骨干细胞，顺时针轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用；
d)3D软骨打印：在双喷头打印机的喷头A中装入上述含细胞的生物墨水，喷头B内中装入PCL；在37℃温度下，根据设定的程序，喷头B打印出PCL框架，然后喷头A将培养基挤出在PCL特定间隙中，形成第一层结构，在第一层结构上面转换方向继续打印，形成第二层结构，第一层和第二层垂直交错布置，如此叠加打印，每一层均与其上下两层的垂直交错，从而打印形成含有软骨干细胞的软骨结构，打印完成以后，在光下照射；
e)将打印好的组织进行细胞培养分化形成软骨。
2.如权利要求1所述的基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：步骤a中，将蚕茧剪成边长0.5‐1.0cm碎片，将碎片放入体积摩尔浓度为0.02M的碳酸钠溶液中搅拌煮沸30‐50min，将蚕丝进行三次20min的漂洗，镊子取出过夜干燥，向蚕丝上滴体积摩尔浓度为7.0‐12.0M的溴化锂溶液在30‐70℃下培养2‐5h，将培养的蚕丝装入透析盒中在超纯水里透析24‐60h，取出透析盒中蚕丝溶液，离心两次，在4℃下储存。
3.如权利要求1所述的基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：步骤b中，在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量的7.0‐12％wt的明胶，在30‐60℃下不断搅拌直到明胶全部溶解，以0.1‐1.0mL/min的速度边搅拌边向溶液中加入0.5‐1.5mL质量浓度为94％的甲基丙烯酸酐溶液，在50℃条件下反应1h，接着用40℃的40mL磷酸缓冲液稀释，然后用12000‐14000透析膜在40℃去离子水里透析1周，最后将溶液冻干1周。
4.如权利要求1所述的基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：步骤c中，在磷酸缓冲液中加入磷酸缓冲液质量1％wt‐10％wt的明胶，在40‐80℃下搅拌溶解，接着加入磷酸缓冲液质量的1％wt‐10％wt的藻朊酸钠、藻朊酸钠质量0.1328倍的二水合硫酸钙、磷酸缓冲液质量的0.01％wt‐0.5％wt的蚕丝纤维、磷酸缓冲液质量的0.01％wt‐1％wt光引发剂，加入软骨干细胞，轻柔的搅拌均匀，5℃温度下遮光保存备用。
5.如权利要求4所述的基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：基于磷酸缓冲液体积的细胞密度为：5×106cells/mL。
6.如权利要求1或4所述的基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：所述光引发剂为I2959。
7.如权利要求1所述的基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其特征在于：步骤d中，在双喷头打印机的喷头B内中装入PCL，PCL的温度为80℃，喷头A中装入含细胞的生物墨水，维持其温度低于15℃；打印完成以后，在8mW/cm2密度的365nmUV光下照射10min。
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