CN110680954A - 一种3d打印黄原胶水凝胶支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种3D打印黄原胶水凝胶支架，由以下步骤制成：S1.常温下，将黄原胶溶解于超纯水中制得黄原胶水溶液，加入甲基丙烯酸酐后充分搅拌，将体系的pH值调节至8‑10，继续反应3‑5小时，将溶液透析、冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；S2.在无菌环境中，将黄原胶甲基丙烯酸酯溶解于含光引发剂的无菌PBS溶液中制得溶胶，将溶胶与软骨细胞均匀混合，利用3D生物打印机进行挤压式打印形成支架，将支架用紫外光照射使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。本发明还提供了该3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法。本发明所提供的3D打印黄原胶水凝胶支架的力学性能可调节，外形和微结构可控，生物相容性好，可以复合软骨细胞。

Description

一种3D打印黄原胶水凝胶支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种3D打印黄原胶水凝胶支架及其制备方法。
背景技术
组织工程为人体组织器官的再生修复提供了一种新的治疗方法，包括静电纺丝和3D打印技术等常见的材料加工成型技术，前者主要为细胞提供一种二维的微环境，而后者却可以实现仿生组织器官的三维微环境。3D打印技术能在微米级精确度下堆积生物材料，调控活细胞和功能分子的空间分布，进而实现组织和器官复杂生理微环境的重塑。
目前，水凝胶是一种常用的3D打印墨水，其含水量高，而且具有类似于组织的细胞外基质的纤维状的网络结构。水凝胶的原材料可分为人工合成材料和天然生物材料。人工合成材料如PEGDA、PCL等，由于其生物相容性差、生化性能欠佳及降解产物会引起大型动物炎症等而使其应用受限。天然材料水凝胶具有良好的生物相容性和低免疫原性，因而常作为3D生物打印的生物墨水，如透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、明胶、丝胶蛋白等。但这些材料在3D打印上的应用依然存在限制，例如，它们的水凝胶缺乏剪切稀化性，打印时挤压力高，致使其中复合的细胞受到过高的压力，影响细胞的活性，进而影响组织的再生修复。另外这些墨水的前驱溶液表现出低黏性，致使打印后的支架很难保持形状，因而不满足简单的挤压式打印需求；即使能打印，也对打印机及打印技术有更高的要求，如明胶需要低温协助打印。此外，蛋白类的墨水，还存在一定的免疫原性，可能会引起动物炎症，如丝胶蛋白。所以，寻求一种同时满足生物相容性和打印性的生物墨水仍非常必要。
黄原胶（Xanthan gum,XG）是假黄单胞菌属产生的一种细胞外可溶的生物相容性好的高分子支链多糖，于1950年由美国农业部国家农业利用中心首次研发，于1960年实现工业化生产，1964年实现商品化，是继右旋糖酐之后第二个发现的来源于微生物的多糖。黄原胶无毒，不引起眼睛、皮肤的刺激，于1969年经通过美国FDA认证。由于黄原胶生物相容性好，可生物降解，具有透明质酸类似的流变特点和粘稠度，因此有大量涉及黄原胶在骨性关节炎治疗作用的研究。研究发现透明质酸酶对注射的黄原胶的流变性能无影响，黄原胶对关节软骨的保护作用通过大体观和组织学观察证实，局部注射黄原胶确实能保护软骨减少软骨降解。另外，黄原胶还具有抗氧化作用，这可使黄原胶减少在骨髓间充质细胞（BMSC）成软骨分化过程中的炎症因子产生从而起到保护作用。
由于水凝胶的力学强度会直接影响软骨再生的效果，因此提高和保持较好的力学强度对黄原胶应用于软骨修复形成工程透明软骨很有必要。目前3D生物打印中最常用的类型是挤压式打印（extrusion-based printing ,EBB）。挤压式打印目前面临最大的挑战是可打印的生物材料非常有限，从打印的可行性上考虑，它要求材料具有足够的粘稠度以保证打印过程中稳定出丝及出丝后塑型，同时又要求材料的粘性不能太大，粘性太大会导致生物墨水通过针头黏附针头受到的剪切力大大增强，墨水中的细胞存活率就会下降。鉴于此，我们知道黄原胶是有效的增稠剂，其水溶液复合非牛顿流体特点，呈现出高假塑性行为。这些特性使黄原胶尤其适合用在挤压式3D生物打印，会使打印过程进展顺利，打印后保持3D结构形状，紧接着进行紫外光交联形成稳定的水凝胶可以用于后续的软骨组织工程研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种3D打印黄原胶水凝胶支架，该支架力学性能可调节，外形和微结构可控，生物相容性好，可以复合软骨细胞，为组织工程提供一种新的支架材料，有望用于临床上软骨缺损的修复再生。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种3D打印黄原胶水凝胶支架，其由以下步骤制成：
S1.常温下，将黄原胶完全溶解于超纯水中制得黄原胶水溶液，加入甲基丙烯酸酐后充分搅拌，用氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8-10，继续反应3-5小时，将反应得到的溶液用超纯水透析5-7天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于含光引发剂的无菌PBS溶液中制得溶胶，将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射1-5分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
进一步地，所述步骤S1中，黄原胶、超纯水、甲基丙烯酸酐的用量比为1g:（100-200）mL:（0.5-5）mL。
进一步地，所述步骤S1中，氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L。
进一步地，所述步骤S2中，黄原胶甲基丙烯酸酯、含光引发剂的无菌PBS溶液的用量比为（2-6）g:100mL，光引发剂为光引发剂2959，含光引发剂的无菌PBS溶液的浓度为0.1-1%w/v。
进一步地，所述步骤S2中，溶胶与软骨细胞的用量比为1mL:1×107个。
本发明要解决的另一技术问题提供上述3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法。
为解决上述技术问题，技术方案是：
一种3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
S1.常温下，将黄原胶完全溶解于超纯水中制得黄原胶水溶液，加入甲基丙烯酸酐后充分搅拌，用氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8-10，继续反应3-5小时，将反应得到的溶液用超纯水透析5-7天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于含光引发剂的无菌PBS溶液中制得溶胶，将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射1-5分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
进一步地，所述步骤S1中，黄原胶、超纯水、甲基丙烯酸酐的用量比为1g:（100-200）mL:（0.5-5）mL。
进一步地，所述步骤S1中，氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L。
进一步地，所述步骤S2中，黄原胶甲基丙烯酸酯、含光引发剂的无菌PBS溶液的用量比为（2-6）g:100mL，光引发剂为光引发剂2959，含光引发剂的无菌PBS溶液的浓度为0.1-1%w/v。
进一步地，所述步骤S2中，溶胶与软骨细胞的用量比为1mL:1×107个。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）采用3D生物打印技术打印出可复合细胞的黄原胶水凝胶支架，支架的形态可控、精确度高，制备方法简单，反应条件温和，所需条件要求不苛刻；水凝胶支架发生紫外光交联可在短时间内完成，能较好地实现打印后支架的保真性，制得的3D打印黄原胶水凝胶支架具有很好的软骨细胞相容性和生物活性，能为软骨细胞提供生长分化的良好环境，有望用于临床上软骨缺损的修复再生。
2）反应要求简单，并可以通过调整反应体系中黄原胶与甲基丙烯酸酐的比例来调控反应得到的3D打印黄原胶水凝胶支架的孔径、孔隙率及力学强度等。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为本发明实施例2的电镜扫描图；
图2为本发明实施例3的电镜扫描图；
图3为本发明中相同浓度下不同取代率黄原胶水凝胶的压缩模量；
图4为本发明实施例1的结构示意图；
图5为本发明实施例2的结构示意图；
图6为本发明实施例4的结构示意图；
图7为本发明实施例1体外培养7天的细胞染色图；
图8为本发明实施例1体外培养14天的细胞染色图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
按照以下步骤制备3D打印黄原胶水凝胶支架：
S1.常温下，将1g黄原胶完全溶解于100mL超纯水中制得黄原胶水溶液，加入0.5mL甲基丙烯酸酐后充分搅拌，甲基丙烯酸酐与黄原胶的摩尔比约等于0.5，用浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8，继续反应3小时，将反应得到的溶液用超纯水透析5天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，按照2g:100mL的用量比将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于浓度为0.1%w/v的含光引发剂2959的无菌PBS溶液中制得浓度为2%w/v的溶胶，按照1mL:1×107个的用量比将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射2分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
实施例2
按照以下步骤制备3D打印黄原胶水凝胶支架：
S1.常温下，将2g黄原胶完全溶解于100mL超纯水中制得黄原胶水溶液，加入2mL甲基丙烯酸酐后充分搅拌，甲基丙烯酸酐与黄原胶的摩尔比约等于1，用浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9，继续反应4小时，将反应得到的溶液用超纯水透析6天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，按照4g:100mL的用量比将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于浓度为0.5%w/v的含光引发剂2959的无菌PBS溶液中制得浓度为4%w/v的溶胶，按照1mL:1×107个的用量比将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射3分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
实施例3
按照以下步骤制备3D打印黄原胶水凝胶支架：
S1.常温下，将1g黄原胶完全溶解于100mL超纯水中制得黄原胶水溶液，加入2mL甲基丙烯酸酐后充分搅拌，甲基丙烯酸酐与黄原胶的摩尔比约等于2，用浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至10，继续反应5小时，将反应得到的溶液用超纯水透析7天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，按照6g:100mL的用量比将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于浓度为0.8%w/v的含光引发剂2959的无菌PBS溶液中制得浓度为6%w/v的溶胶，按照1mL:1×107个的用量比将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射4分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
实施例4
按照以下步骤制备3D打印黄原胶水凝胶支架：
S1.常温下，将0.5g黄原胶完全溶解于100mL超纯水中制得黄原胶水溶液，加入2.5mL甲基丙烯酸酐后充分搅拌，甲基丙烯酸酐与黄原胶的摩尔比约等于5，用浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至9，继续反应6小时，将反应得到的溶液用超纯水透析7天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，按照3g:100mL的用量比将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于浓度为1%w/v的含光引发剂2959的无菌PBS溶液中制得浓度为3%w/v的溶胶，按照1mL:1×107个的用量比将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射1分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
由附图1和附图2可以看到通过改变改性反应过程中不同甲基丙烯酸酐/黄原胶比例（摩尔比分别为0.5和2）反应得到的3D打印黄原胶水凝胶的内部孔隙结构，甲基丙烯酸酐/黄原胶的摩尔比为2（附图2）的孔隙率较大，孔径较小，XGMA水凝胶的扫描电镜图（标尺为100微米）
由附图3可以看出，以浓度为4%w/v时不同取代率的黄原胶水凝胶（改性过程中甲基丙烯酸酐/黄原胶摩尔比分别为0.5和2）进行力学测试， 测得压缩模量分别为52KPa和181KPa，甲基丙烯酸酐/黄原胶的摩尔比为2反应得到的黄原胶水凝胶压缩模量更大。
由附图4附图5和附图6可以看出，溶胶浓度为4%w/v的3D黄原胶支架（附图6）的保真度最高，溶胶浓度为3%w/v的3D黄原胶支架（附图5）的保真度次之，溶胶浓度为2%w/v的3D黄原胶支架（附图4）的保真度最低。
由附图7和附图8可以看出，软骨细胞与黄原胶水凝胶复合进行3D打印后可以继续在支架中生长增殖。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种3D打印黄原胶水凝胶支架，其特征在于：其由以下步骤制成：
S1.常温下，将黄原胶完全溶解于超纯水中制得黄原胶水溶液，加入甲基丙烯酸酐后充分搅拌，用氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8-10，继续反应3-5小时，将反应得到的溶液用超纯水透析5-7天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于含光引发剂的无菌PBS溶液中制得溶胶，将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射1-5分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架，其特征在于：所述步骤S1中，黄原胶、超纯水、甲基丙烯酸酐的用量比为1g:（100-200）mL:（0.5-5）mL。
3.根据权利要求1所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架，其特征在于：所述步骤S1中，氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架，其特征在于：所述步骤S2中，黄原胶甲基丙烯酸酯、含光引发剂的无菌PBS溶液的用量比为（2-6）g:100mL，光引发剂为光引发剂2959，含光引发剂的无菌PBS溶液的浓度为0.1-1%w/v。
5.根据权利要求1所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架，其特征在于：所述步骤S2中，溶胶与软骨细胞的用量比为1mL:1×107个。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.常温下，将黄原胶完全溶解于超纯水中制得黄原胶水溶液，加入甲基丙烯酸酐后充分搅拌，用氢氧化钠溶液将体系的pH值调节至8-10，继续反应3-5小时，将反应得到的溶液用超纯水透析5-7天，完全冻干后得到黄原胶甲基丙烯酸酯；
S2.在无菌环境中，将黄原胶甲基丙烯酸酯完全溶解于含光引发剂的无菌PBS溶液中制得溶胶，将溶胶与软骨细胞均匀混合制成复合软骨细胞的3D打印黄原胶生物墨水，利用3D生物打印机进行挤压式打印，通过喷出的纤维丝逐层堆积形成支架，将支架用紫外光照射1-5分钟使其交联得到3D打印黄原胶水凝胶支架。
7.根据权利要求6所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，黄原胶、超纯水、甲基丙烯酸酐的用量比为1g:（100-200）mL:（0.5-5）mL。
8.根据权利要求6所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L。
9.根据权利要求6所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，黄原胶甲基丙烯酸酯、含光引发剂的无菌PBS溶液的用量比为（2-6）g:100mL，光引发剂为光引发剂2959，含光引发剂的无菌PBS溶液的浓度为0.1-1%w/v。
10.根据权利要求6所述的一种3D打印黄原胶水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，溶胶与软骨细胞的用量比为1mL:1×107个。
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