CN108578780B - 一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，采用生物三维挤压成型机快速成型方法，将载银离子的珊瑚羟基磷灰石与聚乙烯醇和丝素蛋白混合分别形成皮质骨和松质骨的材料，利用计算机处理人工骨支架三维CAD模型，将生物黏结剂与两种粉末按不同比例混合后分别装入不同的生物三维挤压成型机储液仓中，通过挤压成型得到一种具有力学梯度性能，具有抗感染特性，生物相容性好的的高度仿生骨支架模型。不仅增强了骨支架的机械强度，通过符合个性化要求的生物力学提高病灶缺损处的支撑稳定性，有效改善患处周围受损神经的恢复，而且载银离子还能提高生物材料的成骨潜能和生物相容性，避免对患处产生额外的毒副作用与炎性反应，并促进成骨细胞在植入骨支架上的再生作用。

Description

一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法

技术领域

本发明涉及医用人工骨移植材料的技术领域，具体涉及一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法。

背景技术

骨骼是人体运动系统的重要组成部分，起着支撑、保护身体的作用。但骨骼疾病是现代社会影响人们身体健康的重要疾病之一。骨缺损是目前一种常见的骨骼疾病，而利用骨移植手术进行骨修复是治疗骨缺损的重要方式之一。

骨修复材料是进行骨移植、修复骨缺损的重要材料。传统骨移植多采用自体骨或者异体骨进行移植。自体骨虽然一直是进行骨修复和移植的理想材料，但存在供体不足、患者的二次损伤、出血量高、供骨部位容易出现并发症等缺点。而如果用异体骨取代自体骨移植则存在着出现排斥反应等风险，因此，利用人工骨来代替天然骨进行骨移植的研究越来越受到科研人员的重视。

天然骨是一种具有梯度结构的纳米级多孔复合材料，外层是起支撑作用的密质骨，逐渐向髓腔过渡是孔径从几百微米到几毫米的松质骨，天然骨的这种梯度结构，使其具有良好的生物力学性能。骨组织主要由羟基磷灰石与胶原两大部分组成。羟基磷灰石是一种无机物质，其具有良好的生物相容性和生物活性，植入骨组织后能在界面上和骨形成很强的化学性键合，具有骨传导和骨诱导性。

聚乙烯醇(PVA)为类似天然软骨组织的多孔结构亲水性物质，作为无毒副作用的生物胶水用于支架材料的粘结，具有优异的润滑性、生物相容性及弹性模量，且材料本身弹性高、易于成型，与天然骨关节的吸收和渗出体液的力学性能相近，广泛应用于软骨组织工程、细胞载体、药物控释系统等生物医学领域中。

丝素蛋白(SF)源于蚕丝脱胶而得的纤维状蛋白质，由18种氨基酸构成，因其独特的亚单元结构，使表面存在的大量羟基、羧基和氨基等活性基团易与高分子材料交联进行化学改性，从而改变材料表面的电荷性，具有优异的生物相容性、弹性回复率和药物缓控释等特性，可作为智能水凝胶材料用于载药组织工程骨支架中高效载药。并且SF可通过反复冷冻-融化的方式增加SF的β-折叠结构使其具有更好的力学性能，在达到增韧效果的同时可负载更多生长因子，促使成骨细胞的粘附和增殖，加速缺损组织修复。

人体骨骼是一种矿物质化的高密度结缔组织，根据骨骼内、外空间结构的不同分为皮质骨和松质骨。骨松质分布于长骨的两端、短骨、扁骨及不规则骨的内部，由许多针状或片状的骨小梁互相交织构成蜂巢状立体结构，有利于维持骨骼的坚硬度及立体形态，承受较大的重量和抵抗压力。工程骨支架作为可替代人体骨骼的功能化仿生骨支架，为满足个性化骨缺损修复和药物缓控释的要求，支架的空间结构和力学特性应与人体各部位骨缺损处所需的力学强度和生物特性相符合，单一结构支架的力学性能、生物相容性、载药性等均无法达到理想的治疗和修复能力。目前也尚无报道利用载银离子珊瑚羟基磷灰石和聚乙烯醇制备人工骨支架外层皮质骨，同时利用载银离子珊瑚羟基磷灰石、聚乙烯醇和丝素蛋白制备人工骨支架内层的松质骨，从而形成具有力学梯度且具有抗菌性能的人工骨支架。

发明内容

本发明的目的是提供一种载银离子具有力学梯度的高度类似天然骨的人工骨支架的制备方法。

采用生物三维挤压成型机快速成型方法，将载银离子的珊瑚羟基磷灰石与聚乙烯醇和丝素蛋白混合分别形成皮质骨和松质骨的材料，利用计算机处理人工骨支架三维CAD模型，将生物黏结剂与两种粉末按不同比例混合后分别装入不同的生物三维挤压成型机储液仓中，通过挤压成型得到一种具有力学梯度性能，具有抗感染特性，生物相容性好的的高度仿生骨支架模型。不仅增强了骨支架的机械强度，通过符合个性化要求的生物力学提高病灶缺损处的支撑稳定性，有效改善患处周围受损神经的恢复，而且载银离子还能提高生物材料的成骨潜能和生物相容性，避免对患处产生额外的毒副作用与炎性反应，并促进成骨细胞在植入骨支架上的再生作用。

本发明的技术方案为：

所述一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：取颗粒大小为140～200μm珊瑚羟基磷灰石粉末以及10^－4mol/L AgNO₃溶液按100g粉末对应1L溶液的比例进行配比，将珊瑚羟基磷灰石粉末浸泡在AgNO₃溶液中，搅拌后静置至少24小时；之后取出珊瑚羟基磷灰石粉末，并用去离子水洗涤，洗涤后真空冷冻干燥至少48小时，得到载银珊瑚羟基磷灰石粉末，避光备用；

步骤2：将PVA粉与蒸馏水混合形成12％PVA的溶液，水浴加热至90～99℃，保温至少1小时使PVA粉充分溶解，自然冷却后再放入冷冻环境中，反复冷冻-融化多次，形成浓度为12％的PVA水凝胶试样；

步骤3：将载银珊瑚羟基磷灰石粉末与12％PVA水凝胶按质量比：m(CHA-Ag):m(PVA)＝1:1.2～1:1.6充分搅拌使其混合均匀，形成制备骨支架皮质骨的材料；

步骤4：取丝素蛋白粉末、PVA粉和水按1:4:35质量比均匀混合后加入蒸馏水，水浴加热至90～99℃，保温至少1小时使PVA粉和丝素蛋白粉末充分溶解，自然冷却后再放入冷冻环境中，反复冷冻-融化多次，形成SF/PVA复合水凝胶试样；

步骤5：将SF/PVA复合水凝胶和载银珊瑚羟基磷灰石按质量比：m(SF/PVA)：m(CHA-Ag)＝1:1.2～1:1.6进行充分混合，形成制备骨支架松质骨的材料；

步骤6：将步骤3得到的制备骨支架皮质骨的材料、步骤5得到的制备骨支架松质骨的材料、生物粘结剂分别按照质量比为70％:10％:20％、30％:50％:20％、10％:70％:20％三种比例充分混合后，分别加入挤压成型机的储液腔A、B和C中；

步骤7：建立人工骨支架三维模型，并对三维模型进行分层切片处理，获取分层截面数据；将每层截面由内到外分成3个梯度a、b、c，其中a区形状是具有可变直径的中心区域，b、c为中心区域外侧具有相应宽度的环形，在同一径向上，a区半径：b区外环半径：c区外环半径＝1.5:2.5:4.5；

步骤8：按照步骤7的分层截面数据和每层截面的梯度分区，将挤压成型机储液腔A、B和C中放入的原材料分别挤压至分层截面的a、b、c三个分区中；

步骤9：重复步骤8，直至所有分层打印完毕，支架制作完成；取出支架，对支架进行强化、打磨处理。

进一步的优选方案，所述一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，其特征在于：步骤1中制备珊瑚羟基磷灰石粉末的过程为：

步骤1.1：选用南海滨珊瑚，用去离子水超声波反复浸泡冲洗，烘干制成人工骨毛坯；

步骤1.2：将人工骨毛坯置于化学合成釜内，加入磷酸氢二铵试剂，进行充分的水热交换反应，将珊瑚碳酸钙转变成珊瑚羟基磷灰石；

步骤1.3：将珊瑚羟基磷灰球磨后成细颗粒粉末状，过目筛后取颗粒大小为140～200μm的粉末。

进一步的优选方案，所述一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，其特征在于：步骤4中的丝素蛋白粉末采用以下步骤制备：

步骤4.1：称取一定量的蚕丝，用蒸馏水洗净以除去杂质，在干燥箱中于45～55℃条件下烘干，取出备用；

步骤4.2：配置质量分数为0.02％的碳酸钠溶液，加热至100℃，将步骤4.1中得到的蚕丝投入碳酸钠溶液中，煮沸后用蒸馏水充分冲洗以彻底除去丝胶，烘干后获得丝素纤维；

步骤4.3：将干燥的蚕丝纤维粉碎得到粒径为300nm的丝素蛋白粉末。

有益效果

(1)利用生物3D打印机在每层截面各部分采用的粉末混合材料不相同，形成具有梯度力学性能的骨支架，在外部形成相对致密的皮质骨，充分发挥最佳营养物质交换状态及屏蔽其他组织侵入的作用；在内部形成多孔结构的松质骨，有利于维持骨骼的坚硬度及立体形态，承受较大的重量和抵抗压力，还拥有大比表面积提高载药率，以及为骨细胞的粘附和迁移提供支撑；还需具有优异的生物相容性和水溶液稳定性，有利于调整适宜的药物缓释速率，使支架的降解速率、药物缓释控制与新骨再生的速率相匹配。

(2)在制成松质骨的材料中加入了丝素蛋白，丝素蛋白不仅能增加骨骼的韧性，使其具有更好的力学性能，丝素蛋白的降解速率会直接影响人体充质干细胞的代谢，进而改变新骨形成的速率，同时丝素蛋白还可以作为高效的药物载体进行药物控制释放和定位靶向给药，还可作为生长因子载体，有利于成骨细胞的粘附和增殖，促进新骨生成，达到加快修复骨缺损组织的目的。

(3)本发明中采用了载银离子的珊瑚羟基磷灰石，在保留了天然珊瑚的多孔结构，生物相容性好具有较大的孔径、较高的孔隙率和孔隙交通率的基础上，载入银离子，银离子具有优良的抗菌性，对多种菌类都有杀菌作用，而且能够重复进行杀菌活动，保持持久的抗菌效果，解决了植骨材料加载抗生素的作用越来越局限化的问题。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

所述一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取颗粒大小为140～200μm珊瑚羟基磷灰石粉末以及10^－4mol/L AgNO₃溶液按100g粉末对应1L溶液的比例进行配比，将珊瑚羟基磷灰石粉末浸泡在AgNO₃溶液中，搅拌半小时后静置至少24小时；之后取出珊瑚羟基磷灰石粉末，并用去离子水洗涤，洗涤后真空冷冻干燥至少48小时，得到载银珊瑚羟基磷灰石粉末，避光备用。

步骤1中制备珊瑚羟基磷灰石粉末的过程为：

步骤1.1：选用南海滨珊瑚，用去离子水超声波反复浸泡冲洗，烘干制成人工骨毛坯；

步骤1.2：将人工骨毛坯置于化学合成釜内，加入磷酸氢二铵试剂，进行充分的水热交换反应，将珊瑚碳酸钙转变成珊瑚羟基磷灰石；

步骤1.3：将珊瑚羟基磷灰球磨后成细颗粒粉末状，过目筛后取颗粒大小为140～200μm的粉末。

步骤2：将PVA粉与蒸馏水混合形成12％PVA的溶液，水浴加热至90～99℃，保温至少1小时使PVA粉充分溶解，自然冷却后再放入冰箱约-18℃的冷冻环境中，反复冷冻-融化3次，形成浓度为12％的PVA水凝胶试样。

步骤3：将载银珊瑚羟基磷灰石粉末与12％PVA水凝胶按质量比：m(CHA-Ag):m(PVA)＝1:1.2～1:1.6充分搅拌使其混合均匀，形成制备骨支架皮质骨的材料；这里对质量比的限定非常重要，含银的珊瑚羟基磷灰石含量太低则不能有效的杀菌，含量过高则会有一定的毒性，影响细胞的正常生长。

步骤4：取丝素蛋白粉末、PVA粉和水按1:4:35质量比均匀混合后加入蒸馏水，水浴加热至90～99℃，保温至少1小时使PVA粉和丝素蛋白粉末充分溶解，自然冷却后再放入冰箱约-18℃的冷冻环境中，反复冷冻-融化3次，形成SF/PVA复合水凝胶试样。

步骤4中的丝素蛋白粉末采用以下步骤制备：

步骤4.1：称取一定量的蚕丝，用蒸馏水洗净以除去杂质，在干燥箱中于45～55℃条件下烘干8h，取出备用；

步骤4.2：配置质量分数为0.02％的碳酸钠溶液，在电磁炉中加热至100℃，将步骤4.1中得到的蚕丝投入碳酸钠溶液中，煮沸0.5h后用蒸馏水充分冲洗以彻底除去丝胶，烘干后获得丝素纤维；

步骤4.3：将干燥的蚕丝纤维粉碎得到分子量约为250000，粒径为300nm的丝素蛋白粉末。

步骤5：将SF/PVA复合水凝胶和载银珊瑚羟基磷灰石按质量比：m(SF/PVA)：m(CHA-Ag)＝1:1.2～1:1.6进行充分混合，形成制备骨支架松质骨的材料。

步骤6：将步骤3得到的制备骨支架皮质骨的材料、步骤5得到的制备骨支架松质骨的材料、生物粘结剂分别按照质量比为70％:10％:20％、30％:50％:20％、10％:70％:20％三种比例充分混合后，分别加入挤压成型机的储液腔A、B和C中。

步骤7：采用Micro-CT扫描人体损伤处骨组织，获取损伤骨组织图像数据，导入Mimics软件，重构人体损伤部位的骨骼三维模型；将重构的人体损伤部位的骨骼三维模型以STL格式导入3D挤压成型机系统；计算机处理人体损伤部位的骨骼三维模型，将其从下至上顺序分割成间距为Δh的二维截面图形N份，获取分层截面数据，Δh为层厚，一般设定为0.1-0.3mm；根据天然骨组织各部分的力学特性，将每层截面由内到外分成3个梯度a、b、c，其中a区形状是具有可变直径的中心区域，b、c为中心区域外侧具有相应宽度的环形，在同一径向上，a区半径：b区外环半径：c区外环半径＝1.5:2.5:4.5。

步骤8：启动生物三维挤压成型机，i＝1；打印i层时，按照步骤7的分层截面数据和每层截面的梯度分区，将挤压成型机储液腔A、B和C中放入的原材料分别挤压至分层截面的a、b、c三个分区中，形成第i层；第i层成型之后，3D挤压成型机喷头上升0.1-0.3mm，开始喷洒第i+1层，打印第i+1层时，根据分割好的图形采用不同的材料，以制备出具有力学梯度性能的骨支架。

步骤9：重复每一次打印，直至所有分层打印完毕，支架制作完成；取出支架，对支架进行强化、打磨处理。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：取颗粒大小为140～200μm珊瑚羟基磷灰石粉末以及10^－4mol/L AgNO₃溶液按100g粉末对应1L溶液的比例进行配比，将珊瑚羟基磷灰石粉末浸泡在AgNO₃溶液中，搅拌后静置至少24小时；之后取出珊瑚羟基磷灰石粉末，并用去离子水洗涤，洗涤后真空冷冻干燥至少48小时，得到载银珊瑚羟基磷灰石粉末CHA-Ag，避光备用；

步骤2：将PVA粉与蒸馏水混合形成12%PVA的溶液，水浴加热至90~99℃，保温至少1小时使PVA粉充分溶解，自然冷却后再放入冷冻环境中，反复冷冻-融化多次，形成浓度为12%的PVA水凝胶试样；

步骤3：将载银珊瑚羟基磷灰石粉末与12% PVA水凝胶按质量比：

m(CHA-Ag):m(PVA)=1:1.2~1:1.6充分搅拌使其混合均匀，形成制备骨支架皮质骨的材料；

步骤4：取丝素蛋白粉末、PVA粉和水按1:4:35质量比均匀混合，水浴加热至 90~99℃，保温至少1小时使PVA粉和丝素蛋白粉末充分溶解，自然冷却后再放入冷冻环境中，反复冷冻-融化多次，形成丝素蛋白/PVA复合水凝胶试样；

步骤5：将丝素蛋白/PVA复合水凝胶和载银珊瑚羟基磷灰石按质量比：

m（丝素蛋白/PVA）：m(CHA-Ag)=1:1.2~1:1.6进行充分混合，形成制备骨支架松质骨的材料；

步骤6：将步骤3得到的制备骨支架皮质骨的材料、步骤5得到的制备骨支架松质骨的材料、生物粘结剂分别按照质量比为70%:10%:20%、30%:50%:20%、10%:70%:20%三种比例充分混合后，分别加入挤压成型机的储液腔A、B和C中；

步骤7：建立人工骨支架三维模型，并对三维模型进行分层切片处理，获取分层截面数据；将每层截面由内到外分成3个梯度a、b、c，其中a区形状是具有可变直径的中心区域，b、c为中心区域外侧具有相应宽度的环形，在同一径向上，a区半径：b区外环半径：c区外环半径=1.5:2.5:4.5；

步骤8：按照步骤7的分层截面数据和每层截面的梯度分区，将挤压成型机储液腔A、B和C中放入的原材料分别挤压至分层截面的a、b、c三个分区中；

步骤9：重复步骤8，直至所有分层打印完毕，支架制作完成；取出支架，对支架进行强化、打磨处理。

2.根据权利要求1所述一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，其特征在于：步骤1中制备珊瑚羟基磷灰石粉末的过程为：

步骤1.1：选用南海滨珊瑚，用去离子水超声波反复浸泡冲洗，烘干制成人工骨毛坯；

步骤1.2：将人工骨毛坯置于化学合成釜内，加入磷酸氢二铵试剂，进行充分的水热交换反应，将珊瑚碳酸钙转变成珊瑚羟基磷灰石；

步骤1.3：将珊瑚羟基磷灰球磨后成细颗粒粉末状，过目筛后取颗粒大小为 140～200μm的粉末。

3.根据权利要求1所述一种载银离子具有力学梯度的人工骨支架的制备方法，其特征在于：步骤4中的丝素蛋白粉末采用以下步骤制备：

步骤4.1：称取一定量的蚕丝，用蒸馏水洗净以除去杂质，在干燥箱中于45~55℃条件下烘干，取出备用；

步骤4.2：配置质量分数为0.02%的碳酸钠溶液，加热至 100℃，将步骤4.1中得到的蚕丝投入碳酸钠溶液中，煮沸后用蒸馏水充分冲洗以彻底除去丝胶，烘干后获得丝素纤维；

步骤4.3：将干燥的蚕丝纤维粉碎得到粒径为 300nm的丝素蛋白粉末。