CN106552286B - 人工软骨的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人工软骨的制备方法，该方法是先通过3D打印将非水溶性有机高分子材料制备成三维网络状孔隙支架；同时将PVA溶液与纳米羟基磷灰石粉末机械混合，得到HA‑PVA复合溶液；再将HA‑PVA复合溶液对三维网络状孔隙支架进行倒模，使HA‑PVA复合溶液渗入三维网络状孔隙支架内部后，置于人工软骨模具中，通过反复冷冻融化法得到人工软骨/孔隙支架复合体；所得人工软骨/孔隙支架复合体通过溶剂选择性溶解孔隙支架，得到人工软骨。制得的人工软骨生物相容性好、生物力学性能与软骨相近，孔系率高，且具有规整的贯通大孔和小连通孔孔系，能使骨细胞生长进入软骨内部，并与人工软骨完美整合。

Description

人工软骨的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人工软骨的制备方法，属于医用材料制备领域。

背景技术

关节软骨的损伤是骨科的临床常见疾病。目前，对于关节软骨损伤的修复的方法有同体、异体软骨移植，微骨折技术，人工关节置换以及组织工程化软骨和人工软骨材料。同体软骨移植的供体来源有限，而异体软骨移植存在供受体之间的免疫排斥反应等问题。近十年来，多位学者报道微骨折技术治疗软骨缺损效果良好，但是也存在修复过程缓慢，康复方案繁琐，修复物为纤维软骨而不是透明软骨等缺点。传统的人工关节置换不仅成本昂贵，使用年限(10-15年)远小于自然关节软骨的使用寿命(60-70年)。组织工程化软骨被认为是最有应用前景的关节软骨修复材料，但是通过何种方法获取数量充足，活力和分化良好的软骨细胞，以及选择何种支架材料作为细胞载体是软骨组织工程研究的关键问题。既往的研究表明组织工程化软骨方法在体内能够产生部分新生软骨组织，但存在与周围组织整合困难、力学性能较差及后期退化等问题。目前仍处于继续探索阶段。

人工软骨也是一种非常有前景的治疗方案。和组织工程不同，其不要求使软骨再生，而是通过采用一些具有良好生物相容性，能和周围组织整合，同时具有良好的力学性能和摩擦学性能的材料来替代软骨功能。

目前在研的人工软骨材料有：聚乙烯醇水凝胶、透明质酸水凝胶、壳聚糖水凝胶、纤维蛋白水凝胶、藻酸盐凝胶以及多种材料制备的复合水凝胶。其中与天然关节软骨结构与功能接近的聚乙烯醇凝胶(poly vinyl alcohol hydrogen PVA-H)被认为是一种有发展前景的关节软骨修复材料。其优点有：①众多的研究者发现聚乙烯醇水凝胶具有与关节软骨相似的结构。首先，其三维网络结构中含有大量大小不等的孔隙，孔隙大小大约为几个μm至几十个μm数量级。这些具有微米量级的孔隙结构同自然关节软骨的微观结构非常相似，能为骨细胞的长入提供附着面；其网状结构内含有大量水分具有可渗透性，属于微孔结构的亲水材料，能为关节面提供润滑，避免磨屑产生；②它还有良好的生物相容性，长期植入体内无明显的毒性反应。③在力学性能方面最接近软骨。PVA-H具有良好的粘弹性，可以像软骨一样缓冲震荡，其拉伸和压缩弹性模量和软骨相近，明显优于聚乙烯和不锈钢等常规人工关节材料。

但是大量研究发现，通过现有常规的方法制备的人工软骨难以和周围软骨细胞完全整合，限制了软骨组织材料功能的发挥。骨细胞虽然能在人工软骨周围生长但很难和它完全结合并长入其结构内部。研究者认为人工软骨难以和周围组织整合的原因主要为：1、微观孔隙结构不佳，目前制备的PVA水凝胶三维多孔结构联通孔太少，孔隙率和孔径太小，不适合软骨细胞的长入。2、PVA的亲水性导致细胞的粘附能力差。针对这些问题，目前常用的解决办法是制备复合材料，可以在PVA中加入纳米羟基磷灰石(hydroxyapatite HA)、明胶等材料制备复合水凝胶来提高孔隙率和孔径。同时通过加入这些疏水性材料来改变PVA水凝胶的亲水性。但到目前为止，这些办法的效果有限，还没有研究者能彻底解决这个科学问题。

综上所述，关节软骨损伤发病率高，治疗效果差，是临床上一个棘手的难题。人工软骨材料是有前景的解决方案，PVA水凝胶生物力学性质好，但存在不能和周围软骨完全整合的问题，因此研究解决这个问题的方法是个非常迫切的科学问题。

发明内容

针对现有的人工软骨存在微观孔隙结构不佳及人工软骨材料亲和力差等缺陷，本发明的目的是在于提供一种制备生物相容性好、生物力学性能与软骨相近，孔系率高，且具有规整的贯通大孔和小连通孔孔系的人工软骨组织的方法，制备的人工软骨组织生物相容性好，能使骨细胞生长进入软骨内部，并与人工软骨完美整合。

为了实现本发明的技术目的，本发明提供了一种人工软骨的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过3D打印将非水溶性有机高分子材料制备成三维网络状孔隙支架；

(2)将PVA溶液与纳米羟基磷灰石粉末机械混合，得到HA-PVA复合溶液；

(3)将HA-PVA复合溶液在三维网络状孔隙支架进行倒模，使HA-PVA复合溶液渗入三维网络状孔隙支架内部后，置于人工软骨模具中，通过反复冷冻融化法得到人工软骨/孔隙支架复合体；

(4)所得人工软骨/孔隙支架复合体通过溶剂选择性溶解孔隙支架，得到人工软骨。

本发明的技术方案，通过3D打印技术，可以根据实际需要任意设计出一种三维网络状孔隙支架(一般可以由CAD设计孔隙支架的结构)，再以三维网络状孔隙支架为人工软骨内部孔隙的模板制备HA‐PVA复合水凝胶，最后通过溶化脱除三维网络状孔隙支架，即可得到孔隙率高，且大孔孔隙贯通及含有小连通孔的人体软骨。该方法彻底解决了现有方法制备的人体软骨孔隙率低，且连通孔较少的缺陷。

本发明的人工软骨的制备方法还包括以下优选方案。

优选的方案中，有机高分子材料为聚酰胺。优选的聚酰胺高分子材料相对其它高分子材料更适合3D打印；并且其不溶于水，在与HA-PVA复合过程中能稳定存在保持原有结构。

优选的方案中，3D打印为SLS选择性激光烧结技术打印。

优选的方案中，HA-PVA复合溶液中纳米羟基磷灰石粉的含量为3～8wt％，PVA的含量为10～20wt％。适量纳米羟基磷灰石粉的加入，能有效改善PVA的亲水性。

较优选的方案中，HA-PVA复合溶液中纳米羟基磷灰石粉的含量为5wt％，PVA的含量为15wt％。

所述的反复冷冻融化法过程为：先在-20℃以下冷冻5～15小时，再置于室温下融化1～5小时，如此反复进行冷冻-融化至少4次。

优选的方案中，溶剂为醇类。溶剂的选择最好根据非水溶性高分子材料而定，一般要求对选择的非水溶性高分子材料具有很好的溶解性，而不破坏HA-PVA水凝胶；同时选择的溶剂要求容易挥发，在人工骨架内无残留。

优选的方案，HA-PVA复合溶液可加入改善PVA亲水性的添加剂。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

1、本发明选择纳米羟基磷灰石和聚乙烯醇原材料构建生物相容性好、生物力学性能好，且对人体安全的人体软骨；

2、构建孔隙率高，贯穿大孔孔隙和小连通孔相互共存的人体软骨，满足了软骨细胞粘附、及在软骨内部增殖的要求，使人工软骨能和周围骨细胞组织整合；解决了现有技术中软骨缺损修复的难题。

附图说明

【图1】为采用SLS选择性激光烧结制备的各种形状的非水溶性高分子支架；

【图2】为制备人工软骨的工艺流程示意图；

【图3】为对比实施例1制备的PLGA-HA-PVA人工软骨；A：冻干状态的PLGA-HA-PVA人工软骨；B、C：电子显微镜下可见明显的多孔结构；D、E、F：和兔软骨细胞共培养能促进其增殖。

【图4】为对比实施例2采用SLS选择性激光烧结制备的HA-PVA多孔材料。

【图5】为实施例1制备的人工软骨电子显微图：a为软骨表面微孔结构，b为软骨表面大孔结构，c和d为b的局部放大图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

1)以聚酰胺高分子材料为原料，先通过SLS选择性激光烧结技术打印出一种具有三维网络结构的孔隙支架(如图1所述)，孔隙骨架结构稳定，形状可以根据需要进行设计。

2)在PVA溶液中加入纳米羟基磷灰石粉末，持续搅拌混合，制成HA-PVA复合液，控制HA含量为5wt％，PVA含量为15wt％。

3)将制备的HA-PVA复合液在孔隙支架内进行倒模，待HA-PVA复合液完全渗透进入孔隙支架内后，复合物注入模具内；将模具置入‐20℃冰箱中冷冻10小时，再于室温解冻2小时，此为一次冷冻‐解冻循环，如此反复累计5次，增加分子间交联，得到人工软骨/支架复合物；

4)将人工软骨/支架复合物浸入乙醇中，使聚酰胺高分子材料充分溶解，除去。

通过此法所制备出的人工软骨具有良好的孔隙结构，干燥状态下肉眼可见孔隙大小均一，各孔隙相互连通。通过溶胀可重新形成水凝胶，孔隙明显减小(如图2所示)。其电镜下的显微形貌既有孔隙支架溶解后形成的大的连接孔(孔径100-300μm)，孔壁表面粗糙，其表面可以发现HA-PVA反复冻融所形成的小孔(孔径20-40μm)，最终呈现出一种大的连通孔和小的连通孔相互存在的形态，更加利于软骨细胞的粘附和增殖。

通过排无水乙醇法测定了干燥状态下的此种人工软骨的开孔隙率达94.5％，通过排水法测定了水凝胶状态下的开孔隙率达72.1％。制得的多孔聚乙烯醇水凝胶人工软骨具有良好的孔隙结构，良好的连通孔隙结构及孔隙率利于软骨细胞粘附、长入、增殖，保证人工软骨与关节内软骨牢固整合，满足了人工软骨所需生物学性能要求。

通过3D打印制备出不同形状、粗细和孔隙率的聚酰胺孔隙支架来控制最终产物聚乙烯醇人工软骨的孔隙结构。

对比实施例1

采用机械共混-乳化溶剂挥发-冻融法，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、纳米羟基磷灰石(HA)和聚乙烯醇(PVA)复合，制备出了PLGA-HA-PVA人工软骨。其内部有明显的多孔结构，但孔隙大小不均，由几十微米至一百多微米数量级。在体外和兔软骨细胞共同培养(不加诱导因子)，能促进软骨细胞粘附，和增殖(如图3)。仔细分析以上实验结果，可以发现软骨细胞能在人工软骨周围生长但很难和它完全结合并长入其结构内部。也就是说目前的人工软骨难以和周围软骨细胞不能完全整合。

对比实施例2

采用选择性激光烧结技术(SLS)制备HA-PVA复合水凝胶，烧结出了多孔的HA-PVA材料(如图4)。但这种材料的吸水溶胀过程中容易碎裂，不能再成形为水凝胶，究其原因在于PVA不能耐高温，3D打印过程中的高温会使PVA变性，色泽变黄，部分PVA分解为水、醋酸、乙醛和巴豆醛，从而不能再次溶胀为水凝胶。

Claims (8)

1.人工软骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过3D打印将非水溶性有机高分子材料制备成三维网络状孔隙支架；

(2)将PVA溶液与纳米羟基磷灰石粉末机械混合，得到HA-PVA复合溶液；

(3)将HA-PVA复合溶液对三维网络状孔隙支架进行倒模，使HA-PVA复合溶液渗入三维网络状孔隙支架内部后，置于人工软骨模具中，通过反复冷冻融化法得到人工软骨/孔隙支架复合体；

(4)所得人工软骨/孔隙支架复合体通过溶剂选择性溶解孔隙支架，得到人工软骨。

2.根据权利要求1所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的非水溶性有机高分子材料为聚酰胺。

3.根据权利要求1所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的3D打印为SLS选择性激光烧结技术打印。

4.根据权利要求1所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的HA-PVA复合溶液中纳米羟基磷灰石粉的含量为3～8wt％，PVA的含量为10～20wt％。

5.根据权利要求4所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的HA-PVA复合溶液中纳米羟基磷灰石粉的含量为5wt％，PVA的含量为15wt％。

6.根据权利要求1所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的反复冷冻融化法过程为：先在-20℃以下冷冻5～15小时，再置于室温下融化1～5小时，如此反复进行冷冻-融化至少4次。

7.根据权利要求1或2所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的溶剂为醇类。

8.根据权利要求1所述的人工软骨的制备方法，其特征在于，所述的HA-PVA复合溶液加入改善PVA亲水性的添加剂。