CN104958785B - 一种具有二级三维结构的复合骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有二级三维结构的复合骨修复材料及其制备方法。本发明利用低温快速成型技术将纳米羟基磷灰石、丝素和胶原共混物按照设计孔径制备出具有大孔结构的三维复合凝胶，再通过后期的冷冻干燥使溶剂进行升华得到微孔，从而制备出具有二级三维结构的骨修复支架材料。该复合材料综合了纳米羟基磷灰石、丝素和胶原三者的优点，通过调整无机、有机的比例提高复合材料的力学性能，通过调整丝素和胶原的比例控制复合材料的降解时间，使其具有良好的骨传导性、力学性能和生物降解性，利于成骨细胞的粘附和增殖，大大提高骨缺损的愈合速度和效果，是一种理想的三维打印骨修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及骨组织修复材料领域，具体说是一种具有二级三维结构的羟基磷灰石/丝素/胶原复合骨修复材料及其低温快速成型制备方法。
背景技术
随着材料科学、生命科学、机械电子等学科的发展，骨修复材料的研究已发展到有目的地设计材料组分和结构，以达到与骨组织的有机结合，实现活性修复的目的。骨支架材料的构建除了宏观外形结构外，内部微细结构的构建也是非常重要的。目前制造具有一定生物活性的骨支架材料，多是利用材料本身的多孔性或采用发泡剂来模拟骨骼内部组织的微孔，但这些微孔的大小、形状及分布都不能很好的再现骨组织微细结构的特点，且微孔之间的连通率难以保证，严重影响到骨支架材料中血液的循环和营养的代谢。具有互通的孔隙结构是骨修复支架材料所必需具有的特性。研究显示不同组织细胞生长所需要的孔径不同，骨支架材料孔径的大小应满足骨单位和骨细胞生长所需的空间：当支架材料内部连通孔隙和孔径为5～40μm时允许纤维组织长入；孔径为40～100μm时允许非矿化的骨样组织长入；孔径大于150μm时能为骨组织的长入提供理想场所；孔径大于200μm是骨传导的基本要求；孔径为200～400μm最有利于新骨生长。另外，研究表明具有多尺寸孔径(既有大孔径又有小孔径)支架的修复效果优于只有大孔径的支架材料。因此，骨支架材料的构建不仅要考虑宏观结构，还应考虑内部微观结构，而传统的制备方法很难甚至不可能达到这一要求。
基于快速成形原理的成形方法有望实现大孔、微孔共存的多级结构，其中立体光固化工艺、熔融沉积工艺等方法可以很好地加工出数百微米的孔隙结构，但难以成形更小的孔隙，另外成形过程由于存在热相变等过程，对生物材料的性能尤其是生物活性有不可避免的影响。
发明内容
为了克服骨组织工程支架材料传统制备方法孔隙连通性差、单一羟基磷灰石在生理环境下的脆性及低疲劳强度以及丝素蛋白降解速度慢、胶原蛋白降解速度快等缺点，本发明提供一种制备羟基磷灰石/丝素/胶原复合支架材料的方法。
为此，本发明采用如下的技术方案：
一种具有二级三维结构的复合骨修复材料，其特征是，由重量配比在1～3:1～5:1～5的纳米羟基磷灰石、丝素溶液、胶原凝胶组成，所述丝素溶液为质量百分比浓度为5～18％，所述胶原凝胶是将胶原溶胀于醋酸溶液中制备成质量百分比为2～5％凝胶。
一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法，包括下列步骤：
a.以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析、浓缩制备质量百分比浓度为5～18％的丝素溶液；
b.以牛腱为原料，通过脱脂、粉碎、溶解、盐析、透析制备胶原，将胶原溶胀于醋酸溶液中制备成质量百分比为2～5％胶原凝胶；
c.将重量配比在1～3:1～5:1～5的纳米羟基磷灰石、丝素溶液、胶原凝胶进行混合，搅拌至均匀得到复合凝胶；
d.设计三维打印的参数(打印针头直径60～400μm，打印速度2～10mm/s，针头行走间距100～400μm，接收装置的温度为-30～0℃)，将复合凝胶挤出进行低温快速成型；
e.复合凝胶的丝条遇低温固化，将固化后的复合凝胶进行冷冻干燥及后期处理(用无水乙醇浸泡，再用0.1～0.5％的NaOH溶液浸泡，最后用水将残留的乙醇和NaOH等冲洗干净)，得到具有二级三维结构的复合骨修复材料。
所述复合骨修复材料的孔隙具有大孔结构及微米二级孔隙结构，其中的大孔结构范围100～500μm，而根据骨组织工程支架的最佳孔隙范围，大孔结构设计在200～400μm为佳，孔隙由复合溶液通过针头挤出形成的扫描路径孔隙形成，而微米级孔隙结构由打印后的凝胶通过冷冻干燥形成。
所述复合骨修复材料的力学性能为：最大应变10％时压缩应力在33～47kPa范围内，弹性模量在290～430kPa范围内。所述复合骨修复材料的孔隙率在85～97％范围内。
本发明的有益效果是：为了解决骨支架材料孔隙连通性差的问题，本发明采用低温快速成型法制备具有二级三维结构的复合支架；为了提高支架材料的力学性能及生物相容性，本发明采用纳米羟基磷灰石、丝素、胶原为原料通过共混提高复合材料的综合性能。采用本发明的方法制备的复合支架的具有良好的力学性能，最大应变10％时压缩应力在33～47kPa范围内，弹性模量在290～430kPa范围内。将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的羟基磷灰石/丝素/胶原复合骨修复材料上进行培养，结果表明本发明的材料具有良好的细胞相容性。
附图说明
图1a是本发明复合骨修复材料二级三维结构的电镜图；
图1b是图1a的局部放大图；
图2是本发明复合骨修复材料的压缩应力-应变图；
图3是成骨前体细胞MC3T3-E1在本发明复合骨修复材料上培养时在倒置显微镜下的观察图；
图4a是成骨前体细胞MC3T3-E1在本发明复合骨修复材料上培养的电镜图；
图4b是图4a的局部放大图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。
基于离散/堆积成形原理的低温快速成形技术，是将溶解于溶剂内的材料均匀混合之后，通过低温成型技术制备成多孔结构，冷冻干燥后有机溶剂升华，留下大量更为微细的孔洞，在可控孔隙结构和用户化植入物的制造方面有传统成形工艺不可比拟的优势。另外，由于在低于0℃的低温环境中堆积成形，它比熔融挤出快速成形工艺更有利于保持成形材料的生物活性。
羟基磷灰石是骨中无机物的主要组成成分，具有良好的生物相容性，在骨移植材料和骨组织工程支架材料中，因能与骨形成很强的化学结合具有骨传导作用而被广泛应用。丝素蛋白是一种可降解的生物大分子，其化学结构和力学性能可调，骨再生能力良好，广泛用于骨组织工程支架材料的研究中，对无机晶体的生长起着模板和调控的作用，丝素是具有生物活性的天然高分子材料，可作为新型仿生材料的制备原料。胶原在细胞外基质中含量最高，以其优越的生物相容性和生物可降解性而被广泛应用于骨组织工程支架材料中，骨组织中以I型胶原为主，它能与成骨细胞表面的特异性受体β1整合素亚单位紧密结合，促进成骨细胞的粘附、增殖、分化，并增强其成骨能力；因表面含有沉积矿物的位点，对矿物沉积具有诱导作用。
通过综合分析骨组织工程支架对孔隙结构的要求，本发明采用羟基磷灰石、胶原、丝素三者为原料通过低温快速成型制备具有二级三维结构的复合支架材料。
本发明中丝素溶液是以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析、浓缩制备而成，脱胶的方法为将桑蚕丝浸入一定温度、浓度的碳酸钠溶液中进行，溶解方法为将脱胶后的丝素纤维溶解于CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)，透析、浓缩方法为采用透析袋或超滤方法进行。胶原蛋白的制备是以牛腱为原料，通过脱脂、粉碎、溶解、盐析、透析制备胶原，将胶原溶胀于醋酸溶液中制备成胶原凝胶。将纳米羟基磷灰石、丝素溶液、胶原凝胶进行混合，搅拌至均匀得到复合凝胶，再采用低温快速成型方法、冷冻干燥制备本发明材料。
本发明复合骨修复材料的制备方法采用纳米羟基磷灰石、丝素、胶原共混后低温快速成型制备而成。纳米羟基磷灰石、丝素、胶原的比例(重量比)为1～3:1～5:1～5。所述的复合骨修复材料的压缩力学性能为：最大应变10％时压缩应力在33～47kPa范围内，弹性模量在290～430kPa范围内。
将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞在所述的复合骨修复材料上进行培养，结果表明所述复合骨修复材料具有良好的细胞相容性。
实施例一
市售桑蚕丝，浸入90℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，Na2CO3水溶液的为质量百分比浓度0.5％，每次30min，共3次，水洗后70℃干燥；溶解于60℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)，溶解时间为3h，装入透析袋，在流水冲洗下透析；将透析好的丝素溶液在聚乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至质量百分比浓度为10％。胶原蛋白凝胶的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基海绵及其制备方法)。纳米羟基磷灰石、丝素、胶原凝胶按照1:1:1(重量比)的比例进行充分搅拌共混，共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中，设定打印参数(打印针头直径120μm，打印速度4mm/秒，针头行走间距400μm，接收装置的温度为-20℃)，打印好的复合凝胶材料大孔为400μm，打印出的冷冻复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa)，制备成所需的复合骨支架材料。
将上述得到的复合骨支架材料进行电镜观察，电镜图如图1a和图1b所示，表明本发明材料不仅具有设计的大孔结构，还有冷冻干燥成型的微米级孔隙结构，利于细胞的长入和营养物质、代谢产物的交换。
图2是上述复合骨修复材料的压缩应力-应变图，表明本发明材料压缩后具有良好的回弹性，利于在今后的临床应用中用于不规则骨缺损部位的填充。
图3是成骨前体细胞MC3T3-E1在上述复合骨修复材料上培养时在倒置显微镜下的观察图，表明本发明材料具有良好的细胞相容性，利于成骨细胞的粘附、增殖。
图4a和图4b是成骨前体细胞MC3T3-E1在上述复合骨修复材料上培养的电镜图，表明本发明材料具有良好的细胞相容性，细胞在复合骨支架材料上伸展良好、形态正常。
实施例二
市售桑蚕丝，浸入95℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，Na2CO3水溶液的浓度为0.5％，每次30min，共3次，水洗后60℃干燥。溶解于70℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)，溶解时间为4h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在聚乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为15％。胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基海绵及其制备方法)。纳米羟基磷灰石、丝素、胶原凝胶按照1:2:1(重量比)的比例进行充分搅拌共混，共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中，设定打印参数(打印针头直径240μm，打印速度7mm/秒，针头行走间距300μm，接收装置的温度为-15℃)，打印好的复合凝胶材料大孔为300μm，冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa)，制备成所需的复合骨支架材料。
实施例三
市售桑蚕丝，浸入100℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，Na2CO3水溶液的浓度为0.3％，每次30min，共3次，水洗后50℃干燥。溶解于65℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)，溶解时间为4h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在聚乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为15％。胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基海绵及其制备方法)。纳米羟基磷灰石、丝素、胶原凝胶按照1:2:2(重量比)的比例进行充分搅拌共混，共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中，设定打印参数(打印针头直径240μm，打印速度7mm/秒，针头行走间距300μm，接收装置的温度为-15℃)，调节接收装置的温度为-15℃，打印好的复合凝胶材料大孔为400μm，冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa)，制备成所需的复合骨支架材料。
实施例四
市售桑蚕丝，浸入100℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，Na2CO3水溶液的浓度为0.3％，每次30min，共3次，水洗后60℃干燥。溶解于70℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)，溶解时间为4h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在聚乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为5％。胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基海绵及其制备方法)。纳米羟基磷灰石、丝素、胶原凝胶按照1:3:2(重量比)的比例进行充分搅拌共混，共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中，设定打印参数(打印针头直径360μm，打印速度9mm/秒，针头行走间距300μm，接收装置的温度为-30℃)，调节接收装置的温度为-20℃，打印好的复合凝胶材料大孔为300μm，冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa)，制备成所需的复合骨支架材料。
实施例五
市售桑蚕丝，浸入100℃Na2CO3水溶液中进行脱胶，Na2CO3水溶液的浓度为0.5％，每次30min，共3次，水洗后40℃干燥。溶解于70℃的CaCl2、乙醇、水的三元溶液中(摩尔比1:2:8)，溶解时间为2.5h，装入透析袋，在流水冲洗下透析。将透析好的丝素溶液在聚乙二醇(PEG)水溶液中进行浓缩至浓度为8％。胶原蛋白的制备方法参见CN1234424C(胶原蛋白基海绵及其制备方法)。纳米羟基磷灰石、丝素、胶原凝胶按照3:3:2(重量比)的比例进行充分搅拌共混，共混凝胶装入低温快速成型设备配备的针筒中，设定打印参数(打印针头直径410μm，打印速度8mm/秒，针头行走间距250μm，接收装置的温度为-30℃)，调节接收装置的温度为-10℃，打印好的复合凝胶材料大孔为250μm，冷冻的复合凝胶再进行冷冻干燥(冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa)，制备成所需的复合骨支架材料。
尽管结合附图对本发明进行了上述描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明的宗旨下做出的许多变形，均属于本发明的保护之列。
Claims (5)
1.一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法，包括下列步骤：
a.以桑蚕丝为原料，通过脱胶、溶解、透析、浓缩制备质量百分比浓度为5～18％的丝素溶液；
b.以牛腱为原料，通过脱脂、粉碎、溶解、盐析、透析制备胶原，将胶原溶胀于醋酸溶液中制备成质量百分比为2～5％胶原凝胶；
c.将重量配比在1～3:1～5:1～5的纳米羟基磷灰石、丝素溶液、胶原凝胶进行混合，搅拌至均匀得到复合凝胶；
d.设计三维打印的参数，将打印机的接收装置的温度控制在-20℃～-4℃，将复合凝胶挤出进行低温快速成型；
e.复合凝胶的丝条遇低温固化，将固化后的复合凝胶进行冷冻干燥及后期处理，所述后期处理是先用无水乙醇浸泡，再用质量百分比为0.1～0.5％的NaOH溶液浸泡，最后用水将残留的乙醇和NaOH冲洗干净，得到具有二级三维结构的复合骨修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法，其特征是，所述复合骨修复材料的孔隙具有大孔结构及微米二级孔隙结构，其中的大孔结构范围100～500μm，孔隙由复合凝胶通过针头挤出形成的扫描路径孔隙形成，而微米级孔隙结构由打印后的凝胶通过冷冻干燥形成。
3.根据权利要求2所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法，其特征是，所述复合骨修复材料的大孔结构在200～400μm。
4.根据权利要求1或2所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述复合骨修复材料的力学性能为：最大应变10％时压缩应力在33～47kPa范围内，弹性模量在290～430kPa范围内。
5.根据权利要求1或2所述的一种具有二级三维结构的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述复合骨修复材料的孔隙率在85～97％范围内。
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