CN104888277A - 一种细胞-生物支架复合体及其3d打印成形方法 - Google Patents

Abstract

一种细胞-生物支架复合体及其3D打印成形方法，包括具有与患者的组织器官的实际缺损状况相似的生物支架，打印在生物支架上的可模拟天然细胞外基质的有利于细胞黏附繁殖和生长的纳米纤维层和打印在纳米纤维层上的细胞悬液。利用本发明的生物打印成形方法，可根据患者的组织、器官的实际缺损状况，精确打印出患者所需的细胞-生物支架的复合体。

Description

一种细胞-生物支架复合体及其3D打印成形方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种细胞-生物支架复合体及其3D打印成形方法。

背景技术

组织缺损修复及器官移植是20世纪医学史上最伟大的突破之一。目前，全世界有将近100万曾经被死亡阴影笼罩的患者通过器官移植获得了新生，但由于得不到供体器官无法进行器官移植而死去的患者却高达几千万，需要组织缺损修复的病人更是高达上亿人，所以有人说21世纪是组织修复和器官移植的世纪。 3D打印技术的出现使千百万需要组织修复和器官移植的患者获得了治愈重生的希望。

现有的 3D 打印技术已经实现了支架外形的可控制造，在工艺原理上满足制备梯度支架的要求，但是该技术构建的孔隙尺寸较大，无法成形100μm 以下的孔隙，不能提供细胞生长的微环境，存在细胞不容易粘附的问题。3D 打印技术的成形材料一般是单一材料或者提前人为混合的复合材料，而在成形具有材料梯度特征的支架方面还存在较大的局限性。因此，基于电纺丝的骨支架成形技术成了近两年国外发展最为迅速的生物制造技术。电纺丝技术是利用强电场的作用使得聚合物溶液或熔体形成喷射流来进行纺丝加工，是一种制备纳米纤维的新型加工方法之一，其应用已涉及到生命科学、组织工程、光电器件、航天器材等领域。利用电纺丝技术可以喷射出亚微米级甚至纳米级的纤维，从而构成三维相互贯通的微孔结构，适用于细胞的粘附和生长。但利用电纺丝技术喷出的纤维所构成的支架，其外形结构类似于无序状的无纺布，很难实现支架外形的精确控制。不难看出，目前单项工艺方法都无法实现多尺度的成形，因而无法同时满足骨支架的宏观轮廓成形要求和微观孔隙成形要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种细胞-生物支架复合体及其3D打印成形方法，将3D打印技术与静电纺丝技术相结合。本发明将进一步推动3D生物打印技术在组织工程领域的应用前景，使需要组织修复和器官移植的患者获得了治愈重生的希望。

本发明的一种细胞-生物支架复合体，包括生物支架，在所述生物支架表面设置纳米纤维层，在所述纳米纤维层上设置生物细胞悬液。

进一步的，所述生物支架的孔隙率为50%-90%，所述生物支架的孔径为50-500μm，所述纳米纤维层的孔径为0.1-10μm。

进一步的，所述生物支架的使用材料为生物高分子材料、天然生物材料和无机材料中的至少一种，其中所述生物高分子材料为左旋聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物或聚己内酯中的至少一种；所述天然生物材料为如明胶、壳聚糖或海藻酸钠中的至少一种；所述无机材料为磷酸三钙或纳米羟基磷灰石中的至少一种。

进一步的，所述纳米纤维层的使用材料为壳聚糖、胶原或聚乙烯醇中的一种或几种组合。

进一步的，所述胶原与壳聚糖的质量比为1-5:1。

进一步的，所述聚乙烯醇与壳聚糖的质量比为1-5:1。

进一步的，所述细胞悬液包括细胞培养液、血清和来源于患者自体的细胞，所述细胞培养液与血清的质量比为2-6:1，细胞浓度10⁴/ml-10⁶/ml；其中所述细胞为成骨细胞、角膜基质细胞或脂肪干细胞。

本发明的细胞-生物支架复合体的3D打印成形方法，包括如下步骤：

1）生物支架成型步骤，将生物支架的原料混合均匀，使用生物打印机的支架打印喷头将混合均匀的原料逐层加工为与组织器官的实际缺损状况相似的多孔生物支架；

2）纳米纤维层成型步骤，将纳米纤维层材料按比例溶于水中制成电纺液，将上述电纺液通过静电纺丝喷头喷射在所述生物支架的每一层或几层之间形成纳米纤维层，使纳米纤维层逐层成形在生物支架上；

3）细胞打印步骤，将细胞悬液通过细胞打印喷头喷射在所述纳米纤维层上，层层累加后制得细胞-生物支架复合体。

进一步的，所述多孔生物支架中相邻的孔相互连通。

进一步的，所述电纺液的质量浓度为6%-10%，所述壳聚糖在电纺液中的比例为0%~5%，所述胶原在电纺液中的比例为0%~8%，所述聚乙烯醇在电纺液中的比例为0%-10%。

    与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明的细胞-生物支架复合体中的细胞由患者自体提取，加入到含有血清的细胞营养液中，经压电打印技术打印在由另外的打印喷头打印的生物支架上的纳米纤维层表面。利用本发明的生物打印成形方法，可根据患者的组织、器官的实际缺损状况，精确打印出患者所需的细胞-生物支架的复合体。其中所承载的细胞来源于患者自体，避免了免疫排斥等问题，并且细胞打印内部具有能有效模拟细胞外基质环境的纳米纤维网结构，并且细胞在生物支架内部位置和数量可控。

本发明的细胞-生物支架复合体的3D打印成形方法，首先打印生物支架，实现支架外形的精确控制，然后采用静电纺丝技术，在精确的生物支架上逐层或每几层制备与细胞相容性良好的纳米纤维层，并在此纳米纤维层上定量喷射细胞悬液的方法，可以制备出外形轮廓可控、宏观孔隙可控、力学性能良好，内部具有能有效模拟细胞外基质环境的纳米纤维网结构，并且细胞在生物支架内部位置和数量可控的细胞-生物支架复合体。上述制备工艺有效的改善了细胞在打印的生物支架材料上难以附着生长和细胞悬液流失的缺陷。

附图说明

图1为PCL/HA复合支架的扫描电镜观察（×20）照片；

图2为PCL/HA复合支架的扫描电镜观察（×50）照片；

图3为胶原-壳聚糖电纺的纳米纤维层的扫描电镜观察（×500）照片；

图4为胶原-壳聚糖电纺的纳米纤维层的扫描电镜观察（×2000）照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明提供一种细胞-生物支架复合体及其生物打印成形方法，所述细胞-生物支架复合体可以替代组织或器官缺损部位，促进缺损部位的细胞和打印在生物支架上的细胞繁殖生长。

本发明的一种细胞-生物支架复合体，包括生物支架，所述生物支架由生物打印机按照患者组织器官的实际缺损状况打印成型。在所述生物支架表面设置纳米纤维层，所述纳米纤维层是由静电纺丝技术加工成型，所述纳米纤维层可模拟天然细胞外基质，有利于细胞黏附繁殖和生长。在所述纳米纤维层上打印含有生长因子的生物细胞悬液。所述的生物支架的孔隙率为50%-90%，所述的生物支架的孔径为50-500μm，所述静电纺丝喷头喷射在生物支架上的纳米纤维层的孔径为0.1-10μm。

所述生物支架的使用材料为生物高分子材料、天然生物材料和无机材料中的至少一种，其中所述生物高分子材料为左旋聚乳酸PLLA、乳酸-羟基乙酸共聚物或聚己内酯PCL中的至少一种；所述天然生物材料为如明胶、壳聚糖或海藻酸钠中的至少一种；所述无机材料为磷酸三钙TCP或纳米羟基磷灰石HA中的至少一种。

优选的生物支架使用材料为PCL-nHA，质量比为2-5:1，优选为4:1。羟基磷灰石HA是人体和动物体骨骼、牙齿中主要的无机成分，具有良好的生物活性、相容性和骨传导性，但是其脆性大，负载强度低，力学性能差等缺点不能满足骨组织工程支架材料的要求。聚己内酯PCL是一种可生物降解、易于被生物消化代谢、具良好安全性和力学性能的脂肪族聚酯。PCL与-nHA的复合材料适合于骨组织工程支架。

优选的生物支架使用材料为PLLA-TCP，质量比为3-6:1，优选为5:1。磷酸三钙TCP具有非常高的生物相容性，但磷酸三钙的缺点足在体内降解过快。左旋聚乳酸PLLA是一种低降解的聚合物，好的抗拉强度、低的延展性、高的分子量、高的模数(约为4.8GPa)和强疏水性。PLLA与TCP的复合材料有用做组织工程软骨材料的潜能。

所述纳米纤维层的使用材料为壳聚糖、胶原或聚乙烯醇中的一种或几种组合；本发明的纳米纤维层材料与细胞相容性良好。

优选的纳米纤维层的使用材料为胶原-壳聚糖，质量比为1-5:1，优选为3:1，将纳米纤维层材料溶于水中制成质量浓度为10%的电纺液。所述胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，也是细胞外基质的重要成分，具有很好的仿生性，具有免疫原性低、组织相容性及亲和性好、能促进细胞增殖等优点。所述壳聚糖作为一种天然生物材料，具有良好的生物相容性及引导成骨细胞爬行的能力，亲水性较好，促进伤口愈合和吸收效应，然而其机械性能和溶解性能差，且细胞粘附性低，这些都限制了它的应用。胶原与壳聚糖复合电纺膜能够模拟细胞外基质环境促进细胞黏附增殖。

优选的纳米纤维层的使用材料为聚乙烯醇-壳聚糖，质量比为1-5:1，优选为4:1，将纳米纤维层材料溶于水中制成质量浓度为8%的电纺液。所述壳聚糖具有抗菌活性，并且兼具促进创面愈合功能，但壳聚糖很难单独电纺制备，所以将其与无毒、纤维成型性良好、生物相容性好、可降解的高分子材料—聚乙烯醇(PVA)作为复合材料共电纺制备生物膜支架结构。

所述细胞悬液包括细胞培养液、血清和来源于患者自体的细胞，所述细胞培养液与血清的质量比为2-6:1，细胞浓度10⁴/ml-10⁶/ml；其中所述细胞为成骨细胞、角膜基质细胞或脂肪干细胞。

本发明的细胞-生物支架复合体的3D打印成形方法，包括如下步骤：

1）生物支架成型步骤，将生物支架的原料混合均匀，使用生物打印机的支架打印喷头将混合均匀的原料逐层加工为与组织器官的实际缺损状况相似的多孔生物支架，在3D打印时，使相邻的孔相互连通；所述生物支架喷嘴直径为100-500μm，生物支架的正向孔径和侧向孔径尺寸均为50×50μm到500×500μm，优选的，正向孔径200μm×200μm；侧向孔径200μm×100μm。

2）纳米纤维层成型步骤，将纳米纤维层材料按比例溶于去离子水中制成电纺液，将上述电纺液通过静电纺丝喷头喷射在所述生物支架的每一层或几层之间形成纳米纤维层，孔径为0.1-1μm，使纳米纤维层逐层成形在生物支架上；所述电纺液的质量浓度为6%-10%；所述壳聚糖在电纺液中的比例为0%~5%，所述胶原在电纺液中的比例为0%~8%，所述聚乙烯醇在电纺液中的比例为0%-10%。

3）细胞打印步骤，将细胞悬液通过压电式细胞打印喷头喷射在所述纳米纤维层上，层层累加后制得细胞-生物支架复合体。由于一般人体细胞的直径大约20-30μm，细胞打印喷头直径太小会造成细胞打印时喷头堵塞，太大会造成细胞打印位置的不准确，本发明选用细胞打印喷头直径为100-150μm。

     所述细胞悬液的配制方法具体为：将含细胞的培养瓶转至超净工作台内，去掉旧培养液，加入胰蛋白酶消化1分钟，去掉胰蛋白酶，加入含20%血清的DMEM/F12培养液终止消化，用移液管将细胞从培养瓶底面轻轻吹打下来并反复吹打3-5次细胞悬液，从而完成细胞悬液的制备。

实施例1

1、PCL-nHA复合材料的配制，所述PCL与nHA的质量比为4:1：

称取4g 聚已内酯PCL加入36 g二氯甲烷溶液中，于磁力搅拌器上搅拌至充分溶解，加入1g nHA羟基磷灰石粉末，于磁力搅拌器上搅拌至溶液均一，抽真空脱泡，置于通风橱中待有机溶剂彻底挥发，备用。

2胶原-壳聚糖电纺液配制：

将壳聚糖和胶原按质量比1:2，先后溶于去离子水中，制得质量分数为8%的电纺液。

3骨细胞悬液制备：

将含成骨细胞的培养瓶转至超净工作台内，去掉旧培养液，加入胰蛋白酶消化1分钟，去掉胰蛋白酶，加入含20%血清的DMEM/F12细胞培养液终止消化，即所述细胞培养液与血清的质量比为4:1，细胞浓度10⁴/ml-10⁶/ml；用移液管将细胞从培养瓶底面轻轻吹打下来并反复吹打3-5次细胞悬液，从而完成细胞悬液的制备。

4、3D打印制备骨细胞-生物支架复合体

将PCL/HA复合支架材料加入生物打印机的支架打印料筒中，纳米纤维层的胶原-壳聚糖电纺液加入到静电纺丝喷头中，骨细胞悬液加入到压电式细胞打印喷头中。设置生物支架喷嘴直径为300μm，细胞打印喷头直径为120μm，生物支架正向孔径300μm×300μm（如图1和图2所示）；侧向孔径300μm×100μm。在GCODE文件（一种控制3D打印机运行的文件格式）的控制下，生物打印机的支架打印喷头在打印品台上打印出PCL/HA复合支架材料的一层网格，然后静电纺丝喷头将电纺材料喷射在共打印成形的PCL/HA复合生物支架上，形成纳米纤维层（如图3和图4所示）；接下来细胞打印喷头将骨细胞悬液按需求将骨细胞喷射在纳米纤维层上。    

采用压汞仪测定打印成型的PCL/HA复合支架的孔隙率为83.4%，从图2可以看出打印成型的PCL/HA复合支架的孔径约为300μm。从图4中可以看出胶原-壳聚糖电纺的纳米纤维层的孔径为1-10μm，小于细胞的直径，与天然的细胞外基质的结构和功能相似，为细胞提供了黏附、增值及生长用的理想模板；接下来细胞打印喷头将骨细胞悬液按需求将骨细胞喷射在纳米纤维层上。将上述过程反复进行，层层累加后制得骨细胞-生物支架复合体。

以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的一种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，包括生物支架，在所述生物支架表面设置纳米纤维层，在所述纳米纤维层上设置生物细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，所述生物支架的孔隙率为50%-90%，所述生物支架的孔径为50-500μm，所述纳米纤维层的孔径为0.1-10μm。

3.根据权利要求1所述的一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，所述生物支架的使用材料为生物高分子材料、天然生物材料和无机材料中的至少一种，其中所述生物高分子材料为左旋聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物或聚己内酯中的至少一种；所述天然生物材料为如明胶、壳聚糖或海藻酸钠中的至少一种；所述无机材料为磷酸三钙或纳米羟基磷灰石中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，所述纳米纤维层的使用材料为壳聚糖、胶原或聚乙烯醇中的一种或几种组合。

5.根据权利要求4所述的一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，所述胶原与壳聚糖的质量比为1-5:1。

6.根据权利要求4所述的一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，所述聚乙烯醇与壳聚糖的质量比为1-5:1。

7.根据权利要求1所述的一种细胞-生物支架复合体，其特征在于，所述细胞悬液包括细胞培养液、血清和来源于患者自体的细胞，所述细胞培养液与血清的质量比为2-6:1，细胞浓度10⁴/ml-10⁶/ml；其中所述细胞为成骨细胞、角膜基质细胞或脂肪干细胞。

8.根据权利要求1所述的细胞-生物支架复合体的3D打印成形方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）生物支架成型步骤，将生物支架的原料混合均匀，使用生物打印机的支架打印喷头将混合均匀的原料逐层加工为与组织器官的实际缺损状况相似的多孔生物支架；

2）纳米纤维层成型步骤，将纳米纤维层材料按比例溶于水中制成电纺液，将上述电纺液通过静电纺丝喷头喷射在所述生物支架的每一层或几层之间形成纳米纤维层，使纳米纤维层逐层成形在生物支架上； 

3）细胞打印步骤，将细胞悬液通过细胞打印喷头喷射在所述纳米纤维层上，层层累加后制得细胞-生物支架复合体。

9.根据权利要求8所述的细胞-生物支架复合体的3D打印成形方法，其特征在于，所述多孔生物支架中相邻的孔相互连通。

10.根据权利要求8所述的细胞-生物支架复合体的3D打印成形方法，其特征在于，所述电纺液的质量浓度为6%-10%，所述壳聚糖在电纺液中的比例为0%~5%，所述胶原在电纺液中的比例为0%~8%，所述聚乙烯醇在电纺液中的比例为0%-10%。