KR102185580B1 - 전기수력학 기반 3d 프린팅 공정을 이용한 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

전기수력학 기반 3d 프린팅 공정을 이용한 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기수력학 기반 3D 프린팅 공정을 이용한 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 섬유구조체를 포함하는 조직이식용 주사제에 관한 것으로, 본 발명을 통해 기존 2차원으로 제작되어온 섬유 구조체를 3차원 구조체로 제작 할 수 있으며 상기 3차원 제작된 구조체는 공극구조를 갖기 때문에 세포를 3차원적으로 배양이 가능하며, 이를 통해 조직의 분화를 촉진 시킬 수 있다. 또한, 제작된 3차원 섬유구조체는 높은 탄성을 가져 주사바늘에 주입이 가능하기 때문에 보다 쉽게 손상된 조직에 이식가능하며, 마이크로/나노 섬유로 구성되므로 기존의 섬유 구조체를 제작하는 것보다 소량의 재료를 사용하여 구조체를 제작 할 수 있다. 따라서 본 발명은 조직 재생 및 이식 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

전기수력학 기반 3D 프린팅 공정을 이용한 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법 및 이의 용도{Method for the preparation of porous 3D fiber structure using electrohydrodynamic based 3D printing process and uses thereof}
본 발명은 전기수력학 기반 3D 프린팅 공정을 이용한 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 섬유구조체를 포함하는 조직이식용 주사제에 관한 것이다.
조직공학은 생명과학과 공학의 원리를 활용하여 조직의 기능을 재생, 유지, 혹은 향상시키는 생물학적 제품을 개발하려는 여러 학문이 제휴한 분야이다. 대표적인 방법으로는 재생을 원하는 조직으로부터 세포를 분리하여 배양하고 이를 적절한 생체재료에 접종하여 증폭 배양함으로써 인공적으로 조직을 형성하는 시술이다.
이러한 시술에는 세포를 필요한 부위에 전달하기 쉽고, 조직이 성장하는데 3차원 구조로 기계적인 보조역할을 할 수 있으며 기능을 할 수 있는 새로운 조직으로 만들어 나가는 적당한 세포지지체가 필요하다. 이러한 지지체는 세포가 증식하고 특유의 기질을 만들 수 있는 적절한 미세구조를 갖고 있어야 하며, 3차원으로 상호 연결된 많은 기공을 가지고 있어 세포가 이 기공을 통해 안으로 자랄 수 있어야 하고, 세포 성장에 필요한 영양분을 공급할 수 있어야 한다. 또한 독성이 없으며 지지체로서의 기능 종료 후에는 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성 재료여야 한다.
또한, 성공적인 조직 재생을 위해서 세포가 탑재되는 담체는 높은 다공성과 공극 크기 조절 가능성, 산소와 영양성분 공급, 및 혈관 신생을 위해 공극간 100% 상호연결성을 갖추어야 한다. 하지만 종래의 콜라겐을 사용하여 제작된 섬유구조체는 전기방사를 통해 제작되기 때문에 2차원 섬유로밖에 제작할 수 없을 뿐만 아니라 공극의 구조가 제공되지 않기 때문에 세포가 섬유구조체 표면에서만 성장하게 되는 문제가 있으므로 이에 대한 심도 깊은 연구가 필요한 실정이다.
대한민국공개특허공보 10-2013-0099356
본 발명자들은 생체적합성 고분자 소재를 사용하여 체내에 존재하는 세포외 기질과 유사한 3차원 섬유구조체의 제조공정을 확립하였으며, 상기 방법으로 제작된 3차원 섬유구조체는 세포의 증식 및 분화를 빠르게 유도할 뿐만 아니라 주사를 통해 간단하게 체내에 이식할 수도 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은, (a) 생체적합성 고분자, 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 및 유기용매가 혼합된 용액을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 혼합된 용액을 전기수력학(Electrohydrodynamic, EHD) 프린팅 방식을 이용하여 토출하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 토출된 용액을 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매가 채워진 배스(bath)에 착탄시켜 3차원 구조체를 형성하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체의 생체적합성 고분자를 생체적합성 가교제를 이용하여 가교하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 생체적합성 고분자가 가교된 3차원 구조체에서 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 다공성 3차원 섬유구조체를 포함하는, 조직이식용 주사제를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생체적합성 고분자, 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 및 유기용매가 혼합된 용액을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 혼합된 용액을 전기수력학(Electrohydrodynamic, EHD) 프린팅 방식을 이용하여 토출하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 토출된 용액을 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매가 채워진 배스(bath)에 착탄시켜 3차원 구조체를 형성하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체의 생체적합성 고분자를 생체적합성 가교제를 이용하여 가교하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 생체적합성 고분자가 가교된 3차원 구조체에서 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (a) 단계의 전기전도성을 갖는 수용성 고분자는 폴리비닐 알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 및 폴리에틸렌 옥사이드 (poly ethylene oxide, PEO)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌 옥사이드의 중량비는 1 : 0.7 내지 1.3일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계의 생체적합성 고분자는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 푸코이단(Fucoidan), 알지네이트(alginate), 키토산(Chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 셀룰로오스(cellulose), 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리트리메틸렌카보렌카보네이트(polytrimethylenecarbolinecarbonate), 폴리아미노산(polyaminoacid), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유기용매의 농도는 0.05M 내지 0.15M 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 (a) 단계의 생체적합성 고분자 및 전기전도성을 갖는 고분자의 중량비는 1 : 0.7 내지 1.3일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 (a) 단계의 유기용매는 아세트산(acetic acid), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 사이클로헥산(Cyclohexanone), 디아세톤 알코올(Diacetone alcohol), 디에틸렌글리콜모노에틸에더(Diethylene glycol monoethyl ether), N,N-디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide), 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), 에탄올(Ethanol), 메탄올(Methanol) 및 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 노즐팁과 기판 사이의 거리는 4mm 내지 15mm 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 인가되는 전압은 2.2KV/cm 내지 4.2KV/cm 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 공급되는 상기 혼합된 용액의 유량은 0.03ml/h 내지 0.09ml/h 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 프린팅 속도는 2mms-1 내지 10mms-1 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체는 격자 구조일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매는 에탄올, 메탄올, 및 이소프로판올으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 용매일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 상기 배스 내의 용매는 2mm 내지 8mm 높이로 채워질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (d) 단계에서 생체적합성 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드하이드로클로라이드 (1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), 염화칼슘(calcium chloride), 폴리페놀(polyphenol) 및 기니핀(genipin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (e) 단계 이후 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질이 제거된 구조체를 3차 증류수로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 다공성 3차원 섬유구조체를 포함하는, 조직이식용 주사제를 제공한다.
본 발명은 기존 2차원으로 제작되어온 섬유 구조체를 3차원 구조체로 제작할 수 있으며 상기 3차원 제작된 구조체는 공극구조를 갖기 때문에 세포를 3차원적으로 배양이 가능하며, 이를 통해 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다. 또한, 제작된 3차원 섬유구조체는 높은 탄성을 가져 주사바늘에 주입이 가능하기 때문에 보다 쉽게 손상된 조직에 이식가능하며, 세포외기질과 유사한 마이크로/나노 섬유로 구성되므로 세포의 증식 및 분화 유도를 촉진시키고, 기존의 콜라겐 구조체를 제작하는 것보다 소량의 재료를 사용하여 구조체를 제작할 수 있다. 따라서 본 발명은 조직 재생 및 이식 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 주사가능한 다공성 3차원 섬유 구조제 제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 종래의 일반적인 공정 및 본 발명의 공정을 통해 제작된 구조체를 비교하여 본 발명의 공정에 의해서만 섬유다발 구조가 형성됨을 확인한 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예로 제작된 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조제의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예로 제작된 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조제와 타 연구에서 제작된 구조체를 주사전자현미경을 통해 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예로 제작된 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조제를 주사바늘에 도입 및 토출시 형상유지 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 전기방사를 통해 제작된 콜라겐(이하 ColM), 프린팅 공정으로 제작된 콜라겐 구조체(이하 ColP), 또는 본 연구개발을 통해 제작된 다공성 콜라겐 구조체(이하 ColEHD)의 live/dead 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 ColM, ColP, 또는 ColEHD의 DAPI/Phalloidin 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 세포의 침투 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 세포배양시 여러가지 분화 마커들의 발현에 대한 real-time PCR(Polymerase Chain Reaction) 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 세포배양 후 표면 주사전자현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 골 분화 결과를 비교한 것이다.
도 6d는 상기 도 6c의 골 분화 결과물에 대한 흡광도를 비교한 결과이다.
본 발명자들은 생체적합성 고분자 소재를 사용하여 체내에 존재하는 세포외 기질과 유사한 3차원 섬유구조체의 제조공정을 확립하였으며, 상기 방법으로 제작된 3차원 콜라겐 섬유구조체는 세포를 증식 및 분화를 빠르게 유도할 뿐만 아니라 주사를 통해 간단하게 체내에 이식할 수도 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구현예에서는, 본 발명에 따른 구조체의 제조방법을 통해 다공성의 3차원 콜라겐 섬유구조체를 제조할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 구현예에서는, 본 발명의 방법에 의해 제작된 3차원 콜라겐 섬유 구조체를 주사전자현미경 관찰한 결과 다공성 구조가 형성된 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 본 발명의 방법에 의해 제작된 다공성 3차원 섬유 콜라겐 구조체는 높은 탄성을 가져 주사 바늘 속에 용이하게 주입되고 또한 토출시킨 이후에도 원래의 형상을 유지함을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 구현예에서는, ColM, ColP, 또는 ColEHD의 live/dead 관찰결과 ColEHD에서 가장 많은 생존 세포가 존재함을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 구현예에서는, ColM, ColP, 또는 ColEHD의 DAPI/Phalloidin 관찰결과, ColEHD에서 세포들이 구조체에서 가장 깊고 균일하게 분포하고 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 구현예에서는, ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 세포배양시 여러가지 분화 마커들의 발현을 real-time PCR로 분석한 결과 ColEHD에서 발현 정도가 가장 뛰어난 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 구현예에서는, ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 세포배양 표면 주사전자현미경 관찰결과 ColEHD에서만 다공성이자 격자구조인 구조체가 나타남을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 구현예에서는, ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 골 분화 관찰결과 ColEHD에서 골 분화 정도가 가장 우수함을 확인하였다(실시예 8 참조).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 생체적합성 고분자, 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 및 유기용매가 혼합된 용액을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 혼합된 용액을 전기수력학(Electrohydrodynamic, EHD) 프린팅 방식을 이용하여 토출하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 토출된 용액을 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매가 채워진 배스(bath)에 착탄 시켜 3차원 구조체를 형성하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체의 생체적합성 고분자를 생체적합성 가교제를 이용하여 가교하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 생체적합성 고분자가 가교된 3차원 구조체에서 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “콜라겐”은 동물의 뼈와 피부 및 근육에 주로 존재하며 연골, 장기 막, 머리카락 등에도 분포되어 있는 경단백질이며 천연 생체적합성 재료이다
본 발명에서 사용되는 용어 “전기수력학(Electrohydrodynamic, EHD) 프린팅”은 잉크젯 인쇄방식을 기반으로 노즐과 기판 사이에 전기장을 형성시켜 노즐 헤드 팁에서 토출 되는 잉크의 액면(meniscus)에 인가된 전기적 힘이 액면을 변형시켜 액적을 형성시키는 방법이다. 본 인쇄방법은 노즐 헤드 팁 크기보다 작은 액적을 형성할 수 있고, 고점도의 잉크도 사용할 수 있는 장점을 지니고 있으며, 1 μm 이하의 나노스케일의 미세 선폭 및 3 차원 인쇄 구현이 가능하여 발전가능성이 유망한 인쇄 기술이라 할 수 있다. 본 발명에서는 전기수력학(Electrohydrodynamic, EHD) 프린팅 공정 구축을 위해 절연된 플라스틱 스테이지 (stage)와 프린트 해드(print head)를 연결하였으며 프린트 해드에 금속 어댑터 (adapter)와 노즐을 체결하였다. 상기 체결된 어댑터에 용액을 공급할 수 있는 도관을 연결시켜 콜라겐 용액을 공급할 수 있게 하였고, 고전압공급장치를 금속어댑터에 연결시켜 고전압을 공급하여 다공성 3차원 콜라겐/PEO/PVA를 제작하였다.
본 발명의 상기 (a) 단계의 전기전도성을 갖는 수용성 고분자는 폴리비닐 알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 및 폴리에틸렌 옥사이드 (poly ethylene oxide, PEO)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “폴리에틸렌 옥사이드(PEO)”는 대표적인 수용성 고분자로서 무독성 및 높은 생체친화성으로 인해 여러 생의학 분야에서 많이 연구되고 있는 물질이며, 본 발명에서 사용하는 용어 “폴리비닐알코올(PVA) 역시 수용성 고분자로 높은 생체친화성, 무독성 및 유기용매에 대한 높은 안정성을 가지며, 열저항성이 높다. 본 발명에서는 PEO는 젯 존 (jet zone)을 형성하게 하고 PVA는 휘핑 존 (whipping zone)을 형성하는 용도로 사용하였다.
본 발명에서 상기 섬유구조체를 이루고 있는 섬유는 마이크로섬유 또는 나노섬유일 수 있으며 또한, 마이크로 및 나노섬유의 혼합 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 공정은 액상에서 진행되기 때문에 하이브리드로 제작할 경우에도 제작되는 지주층(strut)이 섬유 다발의 형상으로 이루어진다(도 2 참조).
본 발명에서 상기 폴리비닐 알코올은 10 wt%이고 상기 폴리에틸렌 옥사이드 4 wt%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌 옥사이드의 중량비는 1 : 0.7 내지 1.3일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 생체적합성 고분자는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 푸코이단(Fucoidan), 알지네이트(alginate), 키토산(Chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 셀룰로오스(cellulose), 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리트리메틸렌카보렌카보네이트(polytrimethylenecarbolinecarbonate), 폴리아미노산(polyaminoacid), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 아세트산의 농도는 0.05M 내지 0.15M일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 0.1M이다. 본 발명에서 아세트산은 3차원 구조체 제작 후 구조체에 잔존하는 용매가 세포에 가하는 독성을 최소한으로 하기 위해 사용되었다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 생체적합성 고분자 및 전기전도성을 갖는 고분자의 중량비는 1 : 0.7 내지 1.3일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이는 생체적합성 고분자의 양이 더 많을 경우 EHD 프린팅이 안되는 문제가 있으며 반면, 생체적합성 고분자의 양이 적을 경우 구조체가 형상을 유지하지 못하는 문제가 있기 때문이다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 유기용매는 아세트산(acetic acid), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 사이클로헥산(Cyclohexanone), 디아세톤 알코올(Diacetone alcohol), 디에틸렌글리콜모노에틸에더(Diethylene glycol monoethyl ether), N,N-디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide), 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), 에탄올(Ethanol), 메탄올(Methanol) 및 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 노즐팁과 기판 사이의 거리는 4mm 내지 13mm 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 10mm 이다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 인가되는 전압은 2.2KV/cm 내지 4.2KV/cm 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 3.6KV/cm이다
본 발명에서 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 공급되는 상기 혼합된 용액의 유량은 0.03ml/h 내지 0.09ml/h 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 0.06ml/h 이다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 프린팅 속도는 2mms-1 내지 10mms-1인 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 5mms-1 이다.
본 발명에서 상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체는 격자 구조일 수 있다. 이는 구조체에 공극을 제공하기 위함인데 공극은 세포 생존, 증식 및 이동에 필수적인 역할을 하며 구조체의 공극 연결성이 낮으면 대량수송 및 영양물질 교환이 잘 이루어지지 않고, 이는 결국 대형 3차원 구조체에서 세포 괴사를 일으키게 된다.
상기 (c) 단계에서 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매는 에탄올, 메탄올, 및 이소프로판올으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 용매일 수 있다. 토출된 용액의 표면장력보다 작아야 하는 이유는 토출된 용액이 표면장력이 작은 용액에 침투되어야 빠르게 확산현상이 발생하게 되면서 섬유구조체가 형성되기 때문이다.
상기 (c) 단계에서 상기 배스 내의 용매는 2 내지 8mm 높이로 채워질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서 생체적합성 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드하이드로클로라이드 (1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 염화칼슘(calcium chloride), 폴리페놀(polyphenol) 및 기니핀(genipin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질의 제거는 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline)를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계 이후 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질이 제거된 구조체를 3차 증류수로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 3차 증류수를 이용하는 이유는 인산완충생리식염수 만으로도 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질의 제거는 충분하나, 3차원 구조체를 건조시킨 후 인산완충생리식염수 파우더가 남을 수 있으므로 이를 제거하기 위한 것이므로 상기 3차 증류수만을 이용해야 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 다공성 3차원 섬유구조체를 포함하는, 조직이식용 주사제를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조체 제작
본 발명인 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조체는 도 1a에 나타난 방법에 의해 제조되었다. 구체적으로, 콜라겐, PEO, PVA를 혼합하여, EHD 공정을 수행하였으며, 노즐로부터 토출된 콜라겐용액을 에탄올에 주입시켜 섬유구조로 제작하였으며 상기 제작된 구조체의 콜라겐을 가교 시키고, 고분자들을 제거하여 주사 가능한 콜라겐 구조체를 제작하였다(도 1a 참조).
구체적으로, 재료는 PEO(밀도(density) = 1.21 g/cm3, Mn = ~900,000 g mol-1), PVA (밀도 = 1.27 g/cm3, Mn = 89,000~98,000 g mol-1), 및 타입 I 콜라겐 (Matrix-PSP, 순도(purity): 타입 I 콜라겐 >98%)을 사용하였다. PVA 10 wt%(중량비)를 0.1 M 아세트산에 혼합한 후, 120℃에서 10분 동안 용해시켰으며, PEO 4 wt%는 0.1M 아세트산와 함께 상온에서 마그네틱바를 사용하여 용해시켰다. 상기 두 용액을 1:1 중량비로 혼합시켜 PEO/PVA 용액을 제조하였으며 콜라겐 타입-I 또한 0.1 M 아세트산에 4 wt%로 용해시킨 다음 PEO/PVA 용액과 1:1 중량비로 혼합하였다.
상기 혼합된 용액을 사용하여 EHD 공정을 수행하였으며, 상기 공정으로 얻어진 구조체는 에탄올에 용해시킨 1-에틸-(3-3-디메틸아미노프로필) (EDC) (Mw = 191.7)용액에서 1 시간 동안 가교 시켰다. 인산완충생리식염수(Phosphate buffer saline, PBS) 및 3차수를 사용하여 잔존된 EDC와 에탄올을 제거하였고, -76℃에서 12시간 동안 동결건조 하여 구조체를 얻었다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이 타 공정과 비교해 볼 때 본 발명의 제조방법과 같이 용매로 에탄올을 이용하여 제조된 콜라겐 구조체의 경우만 콜라겐이 섬유다발 구조를 형성하게 됨을 알 수 있었다.
실시예 2. 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조체의 주사전자현미경 관찰
본 발명의 방법으로 제조된 콜라겐 구조체와 종래의 방법으로 제조된 콜라겐 구조체의 형태를 비교하기 위해 주사전자현미경을 이용해 그 차이점을 관찰하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 제조된 콜라겐 구조체의 경우 섬유 다발 구조이면서 다수의 공극을 포함하고 있음을 확인하였다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이 본 발명에 의해 제조된 콜라겐 구조체의 경우 섬유다발 구조를 이루고 있었으나 종래 방법에 의해 제조된 콜라겐 구조체의 경우 섬유다발을 형성하지 않는 차이가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 다공성 3차원 섬유 콜라겐 구조체의 주사제로서 가능성 확인
상기 다공성 3차원 섬유 콜라겐 구조체가 주사제로서 이용 가능한지 확인하기 위해 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 다공성 3차원 섬유구조체를 주사바늘을 통해 주입 및 토출이 가능한지를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 본 발명인 다공성 3차원 섬유 콜라겐 구조체는 주사바늘을 통해 용이하게 주입 및 토출이 가능하며 나아가 토출시 원래의 형상을 회복하여 주사 전후의 구조가 일정하였는바 주사제로서 활용 가능함을 확인하였다.
실시예 4. ColM, ColP, 또는 ColEHD의 live/dead 관찰
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 다공성 3차원 콜라겐 섬유 구조체를 Live/dead 용액(0.15 mM 칼세인(calcein) AM 및 2 mM 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1))에서 45분 동안 염색 시켜 통상적으로 알려진 live/dead 방법에 의해 관찰 하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 ColM은 2차원 섬유구조체로써 세포가 단층으로만 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, ColP는 세포가 구조체 내부로 침투하였으나 본 발명을 통해 제작된 ColEHD보다 침투의 깊이가 얕았으며 침투한 세포의 수도 ColEHD보다 현저히 적음을 확인하였다.
실시예 5. ColM, ColP, 또는 ColEHD의 DAPI/Phalloidin 관찰 및 세포의 3차원 침투 분석
DAPI/Phalloidin을 수행하기 위해 배양된 세포를 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)로 10분 동안 고정시켰고, 인산완충생리식염수에 용해시킨 0.1% 트리톤(Triton)-X에 10분동안 담지 하였다. 그 후, 인산완충생리식염수로 1회 세척하고, DAPI/Phalloidin를 염색하였다. 세포의 침투 분석을 하기 위해 형광현미경의 Z축 초점은 200 um의 범위로 설정하였고, 최종적으로 3D 이미지를 통해 세포의 침투를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 ColM은 섬유로 구성되어 있기 때문에 세포가 잘 뻗는 것을 관찰할 수 있었으나 live/dead의 결과와 마찬가지로 세포담체 내부로 침투할 수 없었으며 ColP 또한 콜라겐으로 이루어져 있기 때문에 세포의 골격이 잘 형성되었지만 본 발명의 섬유 구조체에 비해 세포가 형성하는 밀도가 매우 낮았다. 반면 ColEHD는 ColM과 ColP의 각각의 단점을 극복하여 높은 세포밀도와 침투율을 보였다. 구체적으로, ColM은 세포의 크기와 유사한 12.2 ± 4.0 ㎛의 높이까지 세포가 침투한 것이 관찰되었고, ColP는 32.9 ± 7.7 ㎛까지 침투한 결과를 나타내었다. 반면에 본 발명인 ColEHD는 82.2 ± 9.6 ㎛의 깊이까지 세포가 침투한 결과를 보여 가장 깊이 세포가 침투하였음을 확인하였다.
실시예 6. ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 세포배양시 분화 마커들의 발현 분석
세포가 배양된 ColM, ColP, 또는 ColEHD 각 구조체에 TRIzol을 사용하여 세포들을 용해시켰다. 용해된 세포들은 클로로포름(chloroform) 및 아이소프로판올(isopropanol)을 통해 단백질 및 DNA를 제거하였고, 70% 에탄올을 통해 잔존되어 있는 염분을 제거하여 RNA를 얻었다. 상기 얻어진 RNA들은 분광광도계를 통해 양을 측정하였고, 각 구조체로부터 동일한 양의 RNA 및 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA는 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix와 각 유전자의 프라이머(primer)를 사용하여 StepOnePlus Real-Time PCR에서 결과 분석이 수행되었다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이 뼈 형성을 위한 생화학적 마커로 사용되는 오스테오칼신(osteocalcin, OCN)의 경우 ColEHD는 ColM 보다 2.9배, ColP보다 7.4배 높은 발현 값을 보였다. 또한, 골격을 구성하는 주요 인단백질인 오스테오폰틴(osteopontin, OPN)에 대한 유전자 발현양의 경우 ColEHD는 ColM 보다 1.5배, ColP 보다 10.2배 높은 결과를 보였다. 또한, 골아세포의 분화를 유도하는 인자인 BMP-2, 뼈를 구성하는 주요 요소인 Col1, 골조직의 무지기질화를 촉진하는 효소인 ALP는 각각의 양이 증가할수록 골아세포의 분화 및 골 형성이 촉진되는데 상기 요소 모두 ColEHD에서 가장 많이 발현됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 기술을 통해 개발된 ColEHD에서 높은 분화 및 골형성이 가능함을 의미한다.
실시예 7. ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 주사전자현미경 관찰을 통한 비교
세포 골격의 면적은 DAPI/Phalloidin 이미지를 기반으로 계산되었으며 세포의 골격 분석은 Image J 프로그램을 사용하여 phalloidin 면적을 계산하여 값을 도출하였다. 공극률은 porosity(%) = (1 - M/ρV) x 100의 식을 통해서 계산(M은 구조체의 질량, ρ는 콜라겐의 밀도, V는 구조체의 부피를 나타낸다)하였으며 수분 흡수율은 건조된 구조체의 질량을 측정하고 4시간 동안 인산완충생리식염수에 각각의 구조체를 담지 시킨 다음 하기의 식을 통해 계산하였다.
수분 흡수율 (%) =
Figure 112019016388033-pat00001
그 결과, 세포 골격의 표면에서는 ColEHD에서 ColM보다는 1.2배, ColP보다는 1.7배 높은 면적 값을 확인 하였고, 단면에서는 ColM 보다 7.5배, ColP보다 3.2배 넓은 면적의 값을 확인하였으며, ColM은 88.9 ± 0.7%, ColP는 81.5 ± 0.8%의 공극률 (porosity)을 가짐을 확인하였으나 ColEHD는 99.3 ± 0.1%의 공극률을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 수분 흡수율의 경우 ColM은 12.9 ± 0.1%, ColP는 32.2 ± 4.9% 값을 갖는 반면, ColEHD의 수분흡수율은 109.9 ± 1.5%의 값을 갖는 것을 확인 하였다.
실시예 8. ColM, ColP, 또는 ColEHD에서 골분화 관찰
세포의 골분화도를 관찰하기 위해 세포가 배양된 구조체를 3.7& 포름알데히드로 10분 동안 고정시킨 다음, 알리자린 레드 S(Alizarin Red S)로 1시간 동안 염색 시키고, 인산완충생리식염수를 통해 잔존된 알리자린 레드 S를 제거하였다. 그 다음, 동결건조기를 통해 각 구조체를 건조 시킨 후 광학사진을 촬영하였으며, 10 mM 인산나트륨버퍼(sodium phosphate buffer)에 용해시켜 분광광도계를 통해 정량적인 값을 얻었다.
그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이 ColEHD에서 가장 붉게 나타나 ColEHD에서 칼슘이 가장 많이 형성되었음을 확인하였고, 도 6d에 나타난 바와 같이 이를 정량적으로 분석한 결과도 ColEHD에서 가장 높은 수치가 나타나 ColEHD에서 골분화가 가장 잘 일어났음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. (a) 생체적합성 고분자, 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 및 유기용매가 혼합된 용액을 준비하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 혼합된 용액을 전기수력학(Electrohydrodynamic, EHD) 프린팅 방식을 이용하여 토출하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 토출된 용액을 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매가 채워진 배스(bath)에 착탄 시켜 3차원 구조체를 형성하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체의 생체적합성 고분자를 생체적합성 가교제를 이용하여 가교하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 생체적합성 고분자가 가교된 3차원 구조체에서 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 전기전도성을 갖는 수용성 고분자는 폴리비닐 알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 및 폴리에틸렌 옥사이드 (poly ethylene oxide, PEO)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌 옥사이드의 중량비는 1 : 0.7 내지 1.3 인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 생체적합성 고분자는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 푸코이단(Fucoidan), 알지네이트(alginate), 키토산(Chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 셀룰로오스(cellulose), 폴리락타이드(polylactide), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리트리메틸렌카보렌카보네이트(polytrimethylenecarbolinecarbonate), 폴리아미노산(polyaminoacid), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유기용매의 농도는 0.05M 내지 0.15M인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 생체적합성 고분자 및 전기전도성을 갖는 고분자의 중량비는 1 : 0.7 내지 1.3인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 유기용매는 아세트산(acetic acid), 아세톤(acetone), 클로로포름(Chloroform), 사이클로헥산(Cyclohexanone), 디아세톤 알코올(Diacetone alcohol), 디에틸렌글리콜모노에틸에더(Diethylene glycol monoethyl ether), N,N-디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide), 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), 에탄올(Ethanol), 메탄올(Methanol) 및 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 노즐팁과 기판 사이의 거리는 4mm 내지 15mm 인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 인가되는 전압은 2.2KV/cm 내지 4.2KV/cm인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 공급되는 상기 혼합된 용액의 유량은 0.03ml/h 내지 0.09ml/h 인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 전기수력학 프린팅시 프린팅 속도는 2mms-1 내지 10mms-1인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 형성된 3차원 구조체는 격자 구조인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 토출된 용액의 표면장력보다 작은 표면장력을 가지는 용매는 에탄올, 메탄올, 및 이소프로판올으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 용매 인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 배스 내의 용매는 2 내지 8mm 높이로 채워진 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 생체적합성 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드하이드로클로라이드 (1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), 염화칼슘(calcium chloride), 폴리페놀(polyphenol) 및 기니핀(genipin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 (e) 단계 이후 상기 전기전도성을 갖는 수용성 고분자 물질이 제거된 구조체를 3차 증류수로 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다공성 3차원 섬유구조체 제조방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 다공성 3차원 섬유구조체를 포함하는, 조직이식용 주사제.
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