KR101694625B1

KR101694625B1 - 조직 재생용 인공구조체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101694625B1
Application number: KR1020150096774A
Authority: KR
Inventors: 김근형; 안승현; 장철호
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 전남대학교산학협력단
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2017-01-09

Abstract

본 발명은 조직 재생용 인공구조체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 증가된 강도, 생분해성, 및 높은 세포생존율을 갖는 용융 고분자 섬유층, 콜라겐 코팅층, 및 삼차원 세포담체로 이루어진 인공구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 인공구조체는 공극의 크기가 크고 공극간 상호연결성이 100%이므로 세포의 생존과 성장에 필요한 산소와 영양분의 공급이 원활히 이루어져 세포생존율이 매우 우수하다. 또한, 상기 인공구조체의 고분자 섬유층은 인공구조체의 강도를 증가시키고 외부에서 유입될 수 있는 오염물질을 차단하는 효과를 가지며, 상기 인공구조체의 세포와 콜라겐을 통해 다양한 조직의 재건이 가능하고 세포에 일정 시간 경과 후 생체에 남아있던 인공구조체는 자연적으로 분해되어 재생된 조직만 존재하게 되므로 본 발명의 상기 인공구조체는 다양한 조직의 재생을 위한 인공구조체로서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

조직 재생용 인공구조체 및 이의 제조방법{3D SCAFFOLD FOR TISSUE REGENERATION AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 조직 재생용 인공구조체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 증가된 강도, 생분해성, 및 높은 세포생존율을 갖는 용융 고분자 섬유층, 콜라겐 코팅층, 및 삼차원 세포담체로 이루어진 인공구조체, 이의 제조방법, 및 용도에 관한 것이다.

최근 조직공학 분야에서는 인공구조체를 만들어 체내에 이식함으로써 우리 몸의 결손 된 조직 및 기능을 향상 또는 복원하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 조직 이식용 인공구조체의 개발은 생체 조직공학의 발전에 따라 세포들이 3차원적으로 부착하고 배양될 수 있는 기능화 된 조직을 제공하고 있고 신체 내 조직과 공존할 수 있는 생체적합성 물질로 이루어지며, 세포의 성장과 함께 구조체가 세포로 교체될 수 있도록 생분해적 성질과 적당한 기계적 강도를 보유하고 있어야 한다. 최근 생체조직 공학의 발달과 더불어 인체 조직의 재생을 위하여 더욱 정교하고 조직적으로 인공 구조체를 제작하기 위한 여러 가지 기계 공학적 기술들이 사용되고 있다.

인공구조체의 성능 향상을 위해 최근의 인공구조체는 성장인자와 세포를 원하는 위치에 보유할 수 있고 세포를 균일하게 분포시킬 수 있으며, 성장인자를 효과적으로 운반할 수 있다는 점으로 인해 세포 프린팅 기술(cell printing techniques)이 다양한 조직 재생 분야에 널리 응용되고 있다. 성공적인 조직 재생을 위해서 세포가 탑재되는 담체는 높은 다공성과 공극 크기 조절 가능성, 산소와 영양성분 공급, 및 혈관 신생을 위해 공극 간 100% 상호연결성을 갖추어야 한다.

세포를 탑재한 담체를 제조하기 위한 세포 프린팅 기술로서, 잉크젯에 기초한 프린팅 방법, 직접 자유형 직조방법(direct freeform fabrication), 및 레이저-유도 전 방향 전달(laser-induced forward transfer)과 같은 여러 가지 방법들이 도입된바 있다. 최근 레이저 보조 바이오프린팅 방법을 이용하여 디자인된 다공 구조 담체가 제조되었는데, 이 방법으로 콜라겐 용액을 이용하여 섬유아세포 및 각질세포가 프린트되었다. 또한, 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 응용을 위하여 심장 전위(cardiogenic potential)를 가진 구조체를 얻기 위해 인간 심장 유래 심근세포 선구세포(human cardiac-derived cardiomyocyte progenitor cells; hCMPCs)를 알지네이트 담체에 끼워 넣어 세포담체를 제조하였으며, 상기 세포들이 담체 내에 잘 분포되었고 최대 92%의 높은 세포 생존율을 나타냄을 확인한 연구결과가 보고된 바 있다.

그러나 세포가 포매된 담체의 생존율이 새로 개발된 기술들에 의해 개선되고 있지만, 담체 제조기술은 낮은 세포 밀도와 불균일한 세포 분포, 약한 기계적 특성, 및 불충분한 3차원 공극 형상과 같은 문제점들이 있으며, 이를 극복하기 위해 더욱 많은 연구가 필요한 실정이다. 특히, 적층구조 하이드로겔의 낮은 구조 형성능은 주요 문제점으로 지적되고 있는데, 이는 3차원 구조 크기를 한정시키고 프린팅 된 담체의 변형을 일으킬 수 있다. 따라서 종래 인공구조체의 단점을 보완한 생분해성을 갖춘 조직 재생용 인공구조체의 개발이 필요하다.

본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여, 조밀한 고분자 섬유층을 생체고분자물질인 콜라겐으로 코팅하고 세포가 함유된 삼차원 격자구조의 하이드로겔 세포담체를 결합하여 구조가 안정적이고 세포 생존율이 매우 우수하며 상기 세포와 콜라겐을 이용하여 다양한 조직의 재건이 가능한 인공구조체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 조밀한 섬유층, 콜라겐 코팅층, 및 세포가 포매된 하이드로겔층으로 구성된 조직 재생용 인공구조체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 조직 재생용 인공구조체의 제조방법을 제공한다.

(a) 고분자를 열용융하여 섬유형태로 가공하는 단계;

(b) 상기 고분자 섬유 표면을 콜라겐으로 도포하여 콜라겐 코팅층을 형성하는 단계; 및

(c) 세포가 혼합된 하이드로겔 용액을 쾌속조형 방법으로 상기 콜라겐 코팅층 위로 분배하여 지주층을 형성하고 격자구조로 적층하여 세포가 포매된 삼차원 인공구조체를 형성하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조직은 고막(tympanic membrane), 기도(trachea), 또는 뼈(bone)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 고분자는 후코이단(fucoidan), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리언하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester); POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}, 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트 {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 콜라겐은 0.1-1.0 ㎜의 두께로 도포될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 하이드로겔은 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginic acid), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate), 피브린(fibrin), 덱스트란(dextran), 카르복실화 키틴(carboxylated chitin), 아가로스(agarose), 및 풀루란(fluran)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포가 혼합된 하이드로겔 용액은 36℃ 내지 37℃로 유지되며 분배될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 인공구조체를 가교용액을 이용하여 경화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 가교용액은 석고; 또는 수산 아파타이트, 탄산 아파타이트, 불소 아파타이트, 염소 아파타이트, α-TCP, β-TCP, 메타인산칼슘, 인산4칼슘, 인산수소칼슘, 인산2수소칼슘, 피로인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, EDC {1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride}, 또는 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 혼합물의 용액일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 조직 재생용 인공구조체를 제공한다.

본 발명의 인공구조체는 공극의 크기가 크고 공극간 상호연결성이 100%이므로 세포의 생존과 성장에 필요한 산소와 영양분의 공급이 원활히 이루어져 세포생존율이 매우 우수하다. 또한, 상기 인공구조체의 고분자 섬유층은 인공구조체의 강도를 증가시키고 외부에서 유입될 수 있는 오염물질을 차단하는 효과를 가지며, 상기 인공구조체의 세포와 콜라겐을 통해 다양한 생체 조직의 재건이 가능하고 세포에 일정 시간 경과 후 생체에 남아있던 인공구조체는 자연적으로 분해되어 재생된 조직만 존재하게 되므로 본 발명의 상기 인공구조체는 다양한 조직의 재생을 위한 인공구조체로서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은, 본 발명의 조직 재생용 인공구조체의 제작 공정에 관한 모식도를 도시한 것이다.
도 2는, 본 발명의 인공구조체의 PCL 고분자 섬유층, 콜라겐 코팅층, 및 세포가 함유된 알지네이트 담체층을 공정 순서에 따라 동결건조하여 주사전자현미경으로 각 구조를 촬영한 사진이다.
도 3은, PCL을 이용하여 지주형태로 제작 된 세포담체(a), 세포가 포매되지 않은 PCL, 콜라겐, 알지네이트 각각을 이용하여 제작한 인공구조체(b), 및 세포가 포매된 본 발명의 인공구조체(c)의 기계적 강도 특성을 측정한 응력-변형 곡선 결과이다.
도 4는, 고막 천공에 사용되는 기존 패치(patch scaffold), 세포가 포매되지 않은 PCA 인공구조체(PCA scaffold), 또는 세포가 포매된 본 발명의 인공구조체(PCAMSC scaffold)의 in vivo 고막 재생 검증실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 인공구조체의 in vivo 기도 재생검증 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 세포가 포매되지 않은 PCA 인공구조체(PCL/alginate), 또는 세포가 포매된 본 발명의 인공구조체(PCL/alginate/MSC)의 in vivo 뼈 재생 검증실험 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 조밀한 고분자 섬유층을 생체고분자물질인 콜라겐으로 코팅하고 세포가 함유된 삼차원의 고분자 세포담체를 결합하여 구조가 안정적이고 세포 생존율이 매우 우수하며 상기 세포와 콜라겐을 이용하여 다양한 조직의 재건이 가능한 인공구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

이에, 본 발명은 고분자를 열용융하여 섬유형태로 가공하는 단계; 상기 고분자 섬유 표면을 콜라겐으로 도포하여 콜라겐 코팅층을 형성하는 단계; 및 세포가 혼합된 하이드로겔 용액을 쾌속조형 방법으로 상기 콜라겐 코팅층 위로 분배하여 지주층을 형성하고 격자구조로 적층하여 세포가 포매된 삼차원 인공구조체를 형성하는 단계를 포함하는 조직 재생용 인공구조체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 상기 조직은 연골조직, 골조직, 또는 결합조직일 수 있으며, 바람직하게는 고막, 기도, 또는 뼈 조직일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 고분자는 열 용융시킨 후 원심력을 이용하여 섬유형태로 가공할 수 있으며, 상기 방법으로 형성된 고분자 섬유층은 인공구조체의 강도를 증가시키고 외부로부터 오염물질이 유입되는 것을 차단하는 역할을 할 수 있으며, 조직에 이식된 후 자연적으로 분해되는 특성을 갖는다.

상기 고분자는 후코이단(fucoidan), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트 }(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리언하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester); POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}, 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 콜라겐은 상기 고분자 섬유층 표면에 0.1 내지 1.0 ㎜ 두께로 도포될 수 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 0.5 ㎜ 두께로 도포될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 콜라겐을 도포한 후 동결건조와 가교공정을 차례로 수행하고 다시 동결건조를 수행하여 상기 고분자 섬유층에 거친 표면을 구현할 수 있으나, 상기 방법으로 제한되는 것은 아니다. 상기 고분자 섬유층의 거친 표면은 상기 세포가 포함된 하이드로겔 용액의 적층시 섬유층과의 결합력을 높일 수 있다.

본 발명의 상기 세포가 혼합된 하이드로겔 용액은 컴퓨터로 제어되는 3축 로봇 시스템을 이용하여 쾌속조형 방법으로 외경 250-350 ㎛, 내경 100-200 ㎛의 노즐을 통해 온도 36-37℃, 노즐의 분출 압력 150-200 kPa, 및 노즐 이동속도 5-20 ㎜/s 의 분배조건하에서 상기 콜라겐 코팅층 위로 분배될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 하이드로겔은 높은 수분함량, 뛰어난 생체적합성뿐만 아니라 기계적 특성을 조절할 수 있고, 생분해성이 우수하며 세포가 탑재된 구조의 제조에 매우 적합하여 세포가 포매된 담체의 제조에 널리 이용되고 있는 물질을 의미한다. 또한, 다양한 타입의 조직재생 골격을 얻기 위해 직접 프린트할 수 있는 장점이 있다.

상기 하이드로겔은 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginic acid), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate), 피브린(fibrin), 덱스트란(dextran), 카르복실화 키틴(carboxylated chitin), 아가로스(agarose), 및 풀루란(fluran)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

상기 세포는 줄기세포일 수 있고, 인공구조체를 이용하여 재생시키고자 하는 조직으로 분화 가능한 줄기세포라면 그 종류가 제한되지 않으며, 바람직하게는 골수, 제대혈, 지방조직, 또는 혈액 등에서 분리한 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 형성된 인공구조체를 가교용액을 이용하여 경화시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 가교용액은 석고; 또는 수산화 아파타이트, 탄산 아파타이트, 불소 아파타이트, 염소 아파타이트, α-TCP, β-TCP, 메타인산칼슘, 인산4칼슘, 인산수소칼슘, 인산2수소칼슘, 피로인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, EDC {1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride}, 또는 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 혼합물의 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는, 주사전자현미경 관찰을 통해 상기 방법으로 제조된 삼차원의 인공구조체의 구조가 잘 형성되었음을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 인공구조체의 기계적 강도를 측정함으로써 PCL 천연고분자를 이용한 지지체와 유사한 강도를 가지며, PCL 섬유층으로 인하여 조직이 재생되기까지 구조적 특성을 유지할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 동물실험을 통하여 본 발명에 따른 인공구조체를 이식하였을 때 정상적으로 고막, 기도, 및 뼈 조직이 재생됨을 확인하였다(실시예 5 내지 7 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 세포를 함유한 알지네이트 용액 제조

세포가 함유된 알지네이트 담체 제조에 사용된 줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cell)로서, 서울대학교 병원 이은주 교수님으로부터 제공받아 사용하였다. 세포 분배용 하이드로겔은 알지네이트(alginate)를 이용하였으며, 종래에 알려진 기술에 따라 하기와 같이 제조하였다.

G-함량이 높은 저점도의 비의료용 등급의 LF10/60 알지네이트(FMC BioPolymer, Drammen, Norway)를 4℃에서 인산완충액(phosphate buffered saline; PBS)과 혼합하여 3 중량%의 알지네이트 용액을 제조하였다. 상기 줄기세포를 3방향 스톱 콕(3 way stopcock) 툴을 이용하여 1 × 10⁶ ㎖^-1의 밀도로 알지네이트 용액과 혼합한 후 세포와 알지네이트 혼합물을 주사기 용기에 담아 준비하였다.

실시예 2. 인공구조체의 제조

생체 고분자 물질인 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 콜라겐(collagen), 및 상기 실시예 1에서 제조한 세포를 포함하는 알지네이트 용액을 이용하여 조직 재생용 인공구조체를 제조하였으며, 제조과정을 도 1에 단계별로 도시하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, PCL을 열 용융시켜 원심력을 이용하여 섬유형태로 가공한 후 상기 섬유매트 위에 천연고분자 물질인 콜라겐(collagen)을 2 중량%로 하여 0.2-0.5 ㎜ 두께로 고르게 도포하였다. 이후 콜라겐을 도포한 섬유매트를 동결건조하고 가교 공정을 거친 후 재차 동결건조 하여 섬유매트 표면에 거친 형상을 구현하였다. 상기 섬유 매트의 거친 표면은 세포가 함유된 알지네이트가 매트와 결합이 가능하도록 하기 위함이다. 다음으로, 상기 콜라겐이 코팅된 섬유매트 위에 분배 시스템 즉, 컴퓨터로 제어되는 3축 로봇 시스템(DTR2-2210T, Dongbu Robot, Bucheon, South Korea)을 이용한 쾌속조형(rapid prototyping) 공정을 통해 실시예 1의 방법으로 제조한 세포를 포함하는 알지네이트 용액을 노즐(외경 = 310 ㎛, 내경 = 150 ㎛)을 통하여 170 kPa의 노즐 분출 압력, 10 ㎜/s의 노즐 이동속도의 고정된 조건하에서 균일하게 분배하였다. 세포를 포함하는 알지네이트 용액을 바닥으로부터 시작하여 각 층은 바로 아래층과 직각이 되도록 배열함으로써 0°/90°지주 구조를 형성하도록 하여 3차원 정방형 담체를 층층이 쌓았다. 또한, 세포가 함유 된 알지네이트의 온도 유지를 위하여 36.7℃의 온도로 지속적으로 보온을 유지하였다. 이후 알지네이트 담체를 완전히 경화시키기 위해 2 중량% CaCl₂ 용액에 담갔다가 인산완충액으로 세척하였으며, 상기 방법으로 제조한 인공구조체의 구조적 상태가 잘 유지되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 인공구조체의 구조적 특성 분석

실시예 1 및 2의 방법을 통해 제조된 인공구조체의 구조적 특성을 분석하기 위하여 인공구조체의 PCL 고분자 섬유층, 콜라겐 코팅층, 및 세포가 함유된 알지네이트 담체층을 각각의 공정 순서에 따라 동결건조한 후 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 2(a) 및 도 2(b)에 나타낸 바와 같이, PCL을 열 용융시켜 원심력을 이용하여 섬유형태로 가공한 결과 섬유층이 형성되었으며, 콜라겐이 섬유층에 잘 도포된 것을 확인하였다. 또한, 도 2(c)에 나타낸 바와 같이, 알지네이트 담체 층에서 세포가 함유되어있음을 확인하였고 구조적 상태가 잘 유지되는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 인공구조체의 기계적 강도 및 특성 분석

조직재생용 인공구조체가 이식된 부위는 시간경과에 따라 인체 조직으로써 자연 치환되어야 하므로 이식된 인공구조체는 인체 조직으로 치환되기까지 구조적 특성을 유지해야 하며, 오랜 시간 인체에 머물러 있지 않고 자연적으로 소멸되어야 한다. 따라서 실시예 1 및 2의 방법을 통해 제조된 인공구조체의 기계적 강도 및 특성을 분석하여 응력-변형 곡선(stress-strain curve)으로 나타내었다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, PCL을 이용하여 지주형태로 제작된 인공구조체(a)의 경우, 기계적 강도가 매우 높음을 확인하였으나 인체 내에서 분해되기까지 수년의 시간이 필요로 한다는 단점을 가지고 있다. 세포가 포매되지 않은 PCL, 콜라겐, 알지네이트 각각을 이용하여 제작한 인공구조체(b)의 경우 면역학적 반응은 매우 미비하나 강도가 약하고 빠른 분해성을 갖고 있어 체내 조직으로 치환되기까지 그 구조적 특성을 유지하지 못하는 단점이 있음을 확인하였다. 반면에 상기 실시예 1 및 2의 방법에 따라 제조한 세포가 포매된 인공구조체(c)의 경우에는 PCL을 이용한 상기 지지체(a)의 강도와 유사하고 PCL 섬유층으로 인하여 체내 조직으로 재생되기까지 구조적 특성을 유지할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 인공구조체의 고막 재생 검증

실시예 1 및 2의 방법에 따라 제작된 인공구조체가 고막 천공에 이식되어 고막 재생에 효과적으로 이용될 수 있는지 검증하기 위하여 in vivo 실험을 진행하였다. 흰쥐(Sprague-Dawley rat)의 고막 천공에 기존에 사용되는 패치(a), 세포를 포함하지 않고 PCL, 콜라겐, 알지네이트 만을 사용하여 제작한 PCA 인공구조체(b), 또는 중간엽 줄기세포가 포매된 본 발명의 인공구조체(PCAMSC)(c)를 이식한 후 고막 조직의 재생을 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 기존 패치(a)의 경우 고막의 재생이 완벽히 이루어지지 않은 반면에 (b)와 (c)의 경우에는 고막 조직의 재생이 성공적으로 이루어진 것을 관찰하였다. 도 4(d)에 나타낸 이미지와 같이 정상적인 고막의 단면은 0.1 mm 정도이며, 인공고막의 경우 시간이 경과함에 따라 외피층(outer epithelial layer), 섬유층(fibrous layer), 및 내점막층(inner mucosal layer)구조를 온전히 재건시킬 수 있어야 한다. PCA 인공구조체(b)의 경우 도4(e) 이미지에 나타낸 바와 같이 콜라겐층이 얇아 추후 고막에 다시 천공이 생성될 수 있으나, 중간엽 줄기세포를 포매시켜 제작한 PCAMSC 인공구조체(c)의 경우 도 4(f)에 나타낸 이미지와 같이 두터운 콜라겐층을 형성하여 시간이 경과함에 따라 조금씩 얇아지며 정상적인 고막 구조로 재건됨을 확인하였다.

실시예 6. 인공구조체의 기도 재생 검증

실시예 1 및 2의 방법에 따라 제작된 인공구조체가 기도의 재생에 효과적으로 이용될 수 있는지 검증하기 위하여 in vivo 실험을 진행하였다. 도 5(a)에 나타낸 바와 같이, 흰쥐(Sprague-Dawley rat) 기도의 일부분을 제거한 후 상기 인공구조체를 제거된 기도부위를 충분히 덮을 수 있는 크기로 잘라 배치시킨 후 기도를 감싸고 있는 근육과 피부를 덮고 봉합하였다.

그 결과, 도 5(b)의 이미지와 같이 이식부위에 상기 인공구조체가 잘 자리잡힌 것을 관찰하였으며, 도 5(c)의 기도 단면 사진을 통해 기도조직이 온전하게 재생된 것을 확인하였다.

실시예 7. 인공구조체의 뼈 재생 검증

상기 결과들을 통하여 실시예 1 및 2의 방법에 따라 제작된 인공구조체의 고막 및 기도 조직 재생효과를 확인한 것에 더하여, 뼈 재생능을 검증하고자 하였다. 기니픽의 측두골에 있는 외부뼈를 제거하여 불라(bulla) 부분에 점막 제거하고 상기 인공구조체를 삽입한 후 micro-CT 촬영 및 조직검사를 통해 뼈 재생 효과를 관찰하였다.

Micro-CT 촬영 결과, 도 6(a) 및 6(b)에 나타낸 바와 같이, 대조군인 세포를 포함하지 않고 PCL, 콜라겐, 알지네이트 만을 사용하여 제작한 PCA 인공구조체(a)의 경우 일정 부분에서 덩어리가 형성되어있는 것이 관찰된 반면, 본 발명의 상기 인공구조체(b)를 이식한 경우 넓은 범위로 균일하게 뼈 재생이 이루어진 것을 알 수 있었다. 또한, 조직검사를 통하여 관찰한 결과, 도 6(c) 및 6(d)에 나타낸 바와 같이, 대조군(c)에 비하여 상기 인공구조체(d)의 경우 조직이 고르게 재생되어있는 것을 확인하였다. 도 6(e)의 조직 형태 계측(histomorphometry) 결과를 통해서도 본 발명의 인공구조체(PCL/alg/MSC)의 뼈 조직의 분포비율이 훨씬 높은 것을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기의 단계를 포함하는, 조직 재생용 인공구조체의 제조방법:
(a) 고분자를 열 용융시켜 원심력을 이용해 섬유형태로 가공하여 섬유매트를 제조하는 단계;
(b) 상기 섬유매트 위에 콜라겐을 도포하여 콜라겐 코팅층을 형성하는 단계; 및
(c) 세포가 혼합된 하이드로겔 용액을 쾌속조형 방법으로 상기 콜라겐 코팅층이 형성된 섬유매트 위로 분배하여 지주층을 형성하고 격자구조로 적층하여 세포가 포매된 삼차원 인공구조체를 형성하는 단계.
제 1 항에 있어서,
상기 조직은 고막(tympanic membrane), 기도(trachea), 또는 뼈(bone)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자는 후코이단(fucoidan), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트 }(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리언하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester); POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}, 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트 {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1 항의 (b) 단계에 있어서,
상기 콜라겐은 0.1-1.0 ㎜의 두께로 도포되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 하이드로겔은 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginic acid), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate), 피브린(fibrin), 덱스트란(dextran), 카르복실화 키틴(carboxylated chitin), 아가로스(agarose), 및 풀루란(fluran)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1 항의 (c) 단계에 있어서,
상기 세포가 혼합된 하이드로겔 용액은 36℃ 내지 37℃로 유지되며 분배되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1 항에 있어서,
(d) 상기 인공구조체를 가교 용액을 이용하여 경화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 가교 용액은 석고; 또는 수산 아파타이트, 탄산 아파타이트, 불소 아파타이트, 염소 아파타이트, α-TCP, β-TCP, 메타인산칼슘, 인산4칼슘, 인산수소칼슘, 인산2수소칼슘, 피로인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, EDC{1-ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride}, 또는 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 혼합물의 용액임을 특징으로 하는, 제조방법.
청구항 제 1 항의 제조방법에 의해 제조된, 조직 재생용 인공구조체.
제 10 항에 있어서,
상기 조직은 고막(tympanic membrane), 기도(trachea), 또는 뼈(bone)인 것을 특징으로 하는, 인공구조체.