CN112972765A - 丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用 - Google Patents

丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112972765A
CN112972765A CN202110197497.0A CN202110197497A CN112972765A CN 112972765 A CN112972765 A CN 112972765A CN 202110197497 A CN202110197497 A CN 202110197497A CN 112972765 A CN112972765 A CN 112972765A
Authority
CN
China
Prior art keywords
printing
silk fibroin
ink
solution
biological
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110197497.0A
Other languages
English (en)
Inventor
郑兆柱
陈莉
汪涛
吴佳阳
胡涛
关晋平
赵伟
李刚
王晓沁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN202110197497.0A priority Critical patent/CN112972765A/zh
Publication of CN112972765A publication Critical patent/CN112972765A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y30/00—Apparatus for additive manufacturing; Details thereof or accessories therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
    • B33Y70/10—Composites of different types of material, e.g. mixtures of ceramics and polymers or mixtures of metals and biomaterials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Civil Engineering (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及一种丝素蛋白3D打印生物墨水及其应用，本发明的3D打印生物墨水包括丝素蛋白基材料、颗粒和添加剂，添加剂用于使丝素蛋白3D打印生物墨水交联固化。基于现有3D打印支架材料孔隙问题，通过在生物墨水中添加材料，以提高3D打印过程中3D结构的自持性，同时打印后除去材料，在3D打印结构中形成20～500μm孔，且50％以上孔直径≥100μm，大大提高支架内部物质交换效率，提高细胞增殖效率和分化能力。本发明所创建的方法及其依据本发明制备的3D打印仿生结构对研究材料与细胞之间的作用机理，组织再生与生物医用材料研究具有非常重要的意义。

Description

丝素蛋白3D打印生物墨水及其应用
技术领域
本发明涉及3D打印生物墨水，尤其涉及一种丝素蛋白3D打印生物墨水及其应用。
背景技术
目前，组织工程被认为是最有希望彻底解决组织和器官修复难题的途径之一。组织工程的核心是构建由细胞与细胞支架结合的复合体。其中，组织工程支架作为种植细胞的场所和组织再生的模板，其内部孔隙大小与孔隙率对细胞的粘附与生长产生重要影响，并最终决定对待修复部位的修复效果。把3D打印与组织工程结合到一起，可以实现复杂组织精度更高的制作，实现细胞空间排列的可行性，并控制孔隙率维持营养交换和细胞存活。3D打印技术虽然解决了宏观毫米尺度的孔隙问题，但微观尺度的孔隙大小与孔隙率仍取决于生物墨水。3D打印生物墨水的制备工艺将决定支架内部微孔结构形态和性能，进而影响组织再生材料与细胞的相互作用机理，影响其在组织工程和生命科学领域中的实际应用价值。因此，生物相容性好、可制备孔径大小合适的支架的3D打印生物墨水的制备对组织工程和生命科学领域的进一步发展有着十分重要的意义。
近年来，组织工程支架的制备、微孔结构调控及应用研究吸引了各研究背景的多学科领域学者的关注。1933年，Mikos等人率先提出粒子致孔法制备聚乳酸多孔膜，通过往聚乳酸(PLA)中加入盐颗粒(如氯化钠、柠檬酸钠)真空干燥等操作后，将PLA/盐复合膜浸入蒸馏去离子水中，滤除盐颗粒。利用无机盐溶于水而不溶于有机溶剂的原理，制备出孔隙率、表面积比高的聚乳酸多孔膜，已成功地用于软骨细胞的培养和软骨组织的生成。之后，GONG等在此技术基础上加以改进，采用溶剂浇铸/真空挥发/粒子沥滤技术制备了干燥的聚乳酸三维多孔支架。此技术不仅拓展了传统溶液浇铸/粒子沥滤技术的应用，而且还可以制备出管状、梯度支架。这种方法制备的复合支架可以调节孔径和孔隙率，但是支架不能太厚，且支架制备过程中引入有机溶剂，其残留量高，这对细胞的生长有一定的危害，同时该方法的制备周期比较长。
中国专利201610569584公开一种高孔隙率高连通性生物支架制备方法，采用热压机压制出NaCl颗粒预成型体，将预成型体的上下铺设脱模布，再在上脱模布的上方铺设导流网，预成型体、脱模布和导流网放入真空袋内，密封真空袋后将预成型体切碎放入循环流动的去离子水池中沥滤除掉成孔剂，最后冷冻干燥。上述方法能制备孔隙率较大的支架，但孔径大小受NaCl颗粒直径的限制，无法实现真正的微孔结构可调性，且难以实现复杂形状的制备。
中国专利CN 108638494 A公开一种以聚己内酯(PCL)为打印模板，将磷酸四钙(TTCP)和磷酸氢钙(DCPD)的混合物混匀于聚己内酯溶液中，配制成打印浆料；通过3D打印将上述浆料打印成一定形状和结构的支架坯体，形成羟基磷灰石HA多孔支架，最后将多孔支架置于丙酮中以溶解和除去支架模板PCL。但在实际操作过程中难免引起支架尺寸、孔隙半径的收缩，且该组织工程支架生物相容性不高。
从现有的研究现状可以看出，尽管组织工程支架的制备工艺受到国内外学者的关注，但至今仍没有一种技术可以制造生物相容性好、可去除性优异、孔径优良的符合细胞增殖与生长的组织工程支架。对于粒子造孔技术来说，能够制备出高孔隙率、孔径大的支架，但其内部孔与孔之间连通性差，且造孔颗粒不易；挤出成型技术虽然能实现个性化可调控性，但仍难加工出复杂形状的三维支架。此外，相关的合成高分子材料生物支架多数存在着生物相容性差的缺点。因此，现有技术中存在的以上问题，影响着细胞在组织再生材料内的粘附与生长，以及生物支架在组织工程和生物医学领域的运用，迫切需要得到解决。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种丝素蛋白3D打印生物墨水及其应用，本发明的生物墨水具有优异生物相容性及良好打印性，生物墨水中添加的可去除颗粒可使制备的三维多孔支架具有较大孔径和良好的相互连通性，有利于细胞的增殖、生长及营养和氧气的输送。
本发明提供了一种丝素蛋白3D打印生物墨水，其包括
A液，A液包括丝素蛋白基材料、可去除颗粒和添加剂，丝素蛋白基材料包括丝素蛋白或光敏丝素蛋白，添加剂包括诱导剂、交联剂A、光敏剂或光引发剂；A液中，丝素蛋白基材料的质量分数为1～30wt％，可去除颗粒的体积分数为10～90％；添加剂用于使丝素蛋白3D打印生物墨水交联固化；
当添加剂包括交联剂A时，丝素蛋白3D打印生物墨水还包括B液，B液包括交联剂B；交联剂A和交联剂B共同作用以使丝素蛋白3D打印生物墨水发生化学交联。
进一步地，丝素蛋白或光敏丝素蛋白的分子量为50～150kDa。丝素蛋白基材料的形态可以为游离态、颗粒、纤维等。
优选地，光敏丝素蛋白和光引发剂配合使用，丝素蛋白与诱导剂、交联剂A或光敏剂配合使用。
进一步地，可去除颗粒包括无机颗粒或有机颗粒，有机颗粒的材质包括葡聚糖、藻酸盐、透明质酸、琼脂、聚苯乙烯、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)和聚氨酯中的一种或几种，无机颗粒的材质包括碳酸钙、氯化钠(NaCl)中的一种或几种。可去除颗粒作为造孔剂，可在打印成型后从支架中去除，从而在支架中形成多孔结构。可去除颗粒的添加不影响基材的可打印性，相反使用可去除颗粒可提高墨水的粘度，与纯丝素蛋白溶液相比，黏度会提高至2000～10000Pa.s。
进一步地，当可去除颗粒中包括藻酸盐时，A液中还可以添加有能与藻酸盐交联的添加剂，如氯化钙。
进一步地，可去除颗粒的粒径大小为50μm～500μm。
进一步地，诱导剂为乙醇、甲醇和聚乙二醇中的一种或几种。诱导剂可以诱导丝素蛋白材料发生物理交联。
进一步地，交联剂A包括戊二醛、京尼平、环氧树脂和酶中的一种或几种；交联剂B包括过氧化氢、氯化钙。戊二醛、京尼平及其混合物可作为化学交联剂；环氧树脂如聚乙二醇缩水甘油醚(PEG-DE)、三缩水甘油醚(GTGE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)等，开环后可与丝素蛋白发生交联反应；酶如辣根过氧化氢酶(HRP)或酪氨酸酶可促交联丝素蛋白。
进一步地，光敏剂为核黄素，其可在紫外条件下可产生氧自由基，从而催化丝素蛋白化学交联。
进一步地，光敏丝素蛋白是利用丝素蛋白和甲基丙烯酸水甘油脂(GMA)反应后得到，其在光引发剂后的作用下，在紫外光照射下可发生光交联。
在本发明具体实施方式中，丝素蛋白3D打印生物墨水的制备方法如下：
S1：丝素蛋白溶液制备
利用丝源脱胶后溶丝，溶丝完毕后透析，得到丝素蛋白溶液。
优选地，丝源可选用生丝或者蚕茧；脱胶方法可选用碳酸钠脱胶
优选地，碳酸钠脱胶时间为15～120小时。
优选地，溶丝采用的溶剂包括溴化锂、三原混合液、氯化钙。
优选地，溶丝时间1～24小时，溶丝温度45～200摄氏度。
优选地，透析时间36～60小时。
S2：可去除颗粒溶液制备
将可去除颗粒与溶剂混合，得到可去除颗粒溶液。
优选地，可去除颗粒为葡聚糖、藻酸盐、透明质酸、碳酸钙、聚苯乙烯等。
优选地，可去除颗粒溶液的终浓度为1～50wt％。
优选地，可去除颗粒与溶剂体积之比为1:10～2:1。
S3：将可去除颗粒溶液与丝素蛋白溶液混合，制成丝素蛋白3D打印生物墨水。
优选地，丝素蛋白3D打印生物墨水中，丝素蛋白的质量分数为1～30％，可去除颗粒占丝素蛋白3D打印生物墨水总体积的体积分数的10～90％。
进一步地，在步骤S3中，还添加有添加剂。
本发明还公开了一种生物支架的3D打印方法，采用本发明的上述丝素蛋白3D打印生物墨水进行3D打印，包括以下步骤：
当添加剂包括诱导剂时：
将A液在物理作用下使丝素蛋白发生物理交联，然后按照预设的形状，将交联后的生物墨水进行挤出式3D打印成型，打印结束后，去除可去除颗粒，得到具有多孔结构的生物支架；
当添加剂包括交联剂A时：
按照预设的形状，将A液进行挤出式3D打印成型，打印结束后，利用B液处理3D打印产物，使得打印产物发生化学交联固化，然后去除可去除颗粒，得到具有多孔结构的生物支架；
当添加剂包括光敏剂或光引发剂时：
按照预设的形状，将A液进行光固化3D打印成型，打印结束后，光照3D打印产物，使得打印产物发生光交联固化，然后去除可去除颗粒，得到具有多孔结构的生物支架。
进一步地，物理作用包括超声、电刺激和涡流振荡条件中的一种或几种。
进一步地，挤出式3D打印成型时，打印机的喷头移动速度为220～260mm/min，出料速度为0.1600～170mL/min。
进一步地，光固化3D打印成型时，打印机的喷头移动速度为150～200m/min，选用21G针头为打印机喷嘴。
进一步地，光固化3D打印成型时，光交联固化在紫外灯照射下进行。
优选地，3D打印过程中，室内温度为37℃。
进一步地，去除可去除颗粒时，将支架浸渍于去离子水或无毒的有机溶剂中。
进一步地，本发明中的可去除颗粒可在生物无毒害的溶剂中洗出或快速降解，颗粒洗出后可形成较大孔径，为营养和氧气交换提供了更多通道，促进细胞的粘附生长与增殖，是体内组织再生和功能重建的理想材料，且洗出过程或降解中生物安全性高。
通过改变丝素蛋白3D打印生物墨水中丝素蛋白与可去除颗粒的体积配比，或改变可去除颗粒的直径大小，实现生物支架的孔隙率、孔径大小可个性化调控性。
本发明还要求保护采用上述生物支架的3D打印方法所制备的生物支架。
采用本发明的丝素蛋白3D打印生物墨水进行3D打印得到的生物支架为多孔支架，该多孔支架的孔洞直径约为20～500μm，且50％以上数量的孔的直径≥100μm，微孔之间互通。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
基于现有3D打印支架材料孔隙问题，本发明利用丝素蛋白作为生物墨水的基础材料，丝素蛋白富含多种氨基酸，具有很好的生物相容性和力学性能，同时通过在生物墨水中添加生物可去除材料，以提高3D打印过程中3D结构的自持性。本发明的可去除颗粒与添加剂的选择条件广，可去除颗粒的加入不会影响生物墨水的可交联性。同时打印后降解除去可去除材料，在3D打印结构中形成20～500μm的微孔，且50％以上孔直径≥100μm，大大提高支架内部物质交换效率，提高细胞增殖效率和分化能力。
利用本发明的方法所制备的三维多孔支架具有较大孔径和良好的相互连通性，有利于细胞的增殖、生长及营养和氧气的输送。另外，采用3D打印技术制备生物支架，可实现支架形状个性化调控，扩大组织工程支架的使用范围。依据本发明制备的3D打印仿生结构对研究材料与细胞之间的作用机理，组织再生与生物医用材料研究具有非常重要的意义。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是利用本发明的丝素蛋白3D打印生物墨水进行生物支架的3D打印方法的流程示意图；
图2是利用实施例7中方法制备出不同丝素蛋白浓度与葡聚糖颗粒添加量的生物材料的应力应变曲线以及应力应变直方图；
图3是利用实施例7中方法制备的不同生物支架的的储能模量和损耗模量图；
图4是本发明一种实施方式制备的生物支架体内的细胞增殖情况；
图5是本发明另一种实施方式制备的生物支架体内的细胞增殖情况；
图6是利用各种方法制备的生物支架的扫描电镜表征图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1丝素蛋白溶液的制备
(1)蚕丝脱胶方法：量取12L纯水倒入脱胶锅中，将纯水加热，称取25.44g无水Na2CO3，待水即将沸腾时加入。称取30g生丝，待无水Na2CO3在沸水中充分溶解后加入，一共煮30min。煮好后取出，用2L纯水反复搓洗3次，置于通风橱中干燥；
(2)蚕丝溶解方法：称取80.75g溴化锂(99.9％)于500mL烧杯中，定容至100mL容量瓶中(9.3M)，称取步骤(1)中的5份脱胶蚕丝，每份5g分装于50mL烧杯中，每个烧杯中倒入20mL溴化锂溶液，置于60℃烘箱中，每隔1小时摇晃一次烧杯，4小时后取出；
(3)丝素溶液透析方法：剪取5段透析袋，透析袋截留分子量为3500kDa。将透析袋浸泡在纯水中约5～10min后，取出的5份溶液通过透析袋另一端倒入，装好溶液后，用透析夹将另一端夹好。5个透析袋均放入含有4L纯水的烧杯中开始透析，每6小时换水一次，共换水8次；
(4)丝素蛋白溶液离心方法：将透析袋内的丝素蛋白溶液取出倒入离心管内，在高速离心机中离心，离心机参数为：9000r/min，每次离心20min，共离心两次。
(5)保存方式：将制好的丝素蛋白溶液放入烧杯中，在烧杯上盖上锡箔纸，置于4℃冰箱中保存，保存时间为7～10天。
实施例2：光敏丝素蛋白的制备
(1)将实施例1中步骤(2)得到的丝素蛋白溶液，加入424mM的GMA溶液混合均匀，以30rpm的速度在60℃下反应3h，使之产生高产率反应。
(2)过滤后，使用截留分子量为12～14kDa的透析袋中透析4天，每天更换6次去离子水，然后置于-80℃冰箱中过夜，冷冻干燥后置于-4℃下以备使用。
实施例3：细胞培养
(1)BMSCs(骨髓间充质干细胞)的原代获取
将乙醚倒入棉花上麻醉SD大鼠，引颈处死之后将老鼠的尸体浸泡到75％的乙醇中消毒；浸泡30分钟后拿出放入超净工作台中开始实验，剪开小鼠腿部的皮肤和肌肉，取下完整的胫骨和股骨，泡入含有10％双抗的PBS溶液中5～10分钟，拿出后再泡入含有5％双抗的PBS溶液中5～10min，最后再泡入含有1％双抗的PBS溶液中5～10min；剪掉胫骨和股骨的两端露出骨髓腔，用充满完全培养基的1mL插入骨髓腔一端的端处，缓慢的推动注射器。将离心管放在骨另一端下方收集冲刷出来的液体。全部冲刷完成后，将离心管内的的骨髓悬液转移至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
(2)BMSCs的传代培养
首先，倒掉培养瓶中的培养基，使用1～2mL的PBS缓冲溶液轻轻冲洗贴壁的细胞洗涤2次；之后，加入1.5mL的胰蛋白酶，朝一个方向垂直摇晃培养瓶使的胰蛋白酶充分作用于细胞进行消化，摇晃约2min，细胞脱离培养瓶壁面时，向培养瓶中加入3mL的完全培养基来停止消化。终止完成后使用枪头对培养瓶的壁面进行冲刷吹打，防止细胞仍停留在壁面上，吹打完成后将其转移至离心管中，用封口膜将离心管管口密封，放于离心机中在1000rpm离心3min；离心过后，倒掉上层清液，加入1～2mL培养基重新悬浮细胞，吹打均匀后将悬液吸取出来转移到灭菌过的新的培养瓶中，视细胞量继续补加培养基。最后置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。当细胞铺满培养瓶瓶底后，重复上述方法进行下一次传代。
实施例4：一种丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水(化学交联)
打印墨水由A液和B液组成，其中A液由6wt％的丝素蛋白溶液、300U/mL辣根过氧化氢酶溶液、0.1％过氧化氢溶液、终浓度为15wt％葡聚糖凝胶颗粒G50和水组成，B液为0.1wt％过氧化氢溶液。打印墨水制备步骤为：
(1)配制辣根过氧化氢酶溶液：取300U/mg辣根过氧化氢酶固体5mg于10mL离心管中，加入PH值为7.4的PBS溶液5mL，摇晃离心管，使辣根过氧化氢酶与PBS溶液混合均匀，即可得到300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液5mL。辣根过氧化氢酶固体放置于-20℃冰箱内避光保存；配制的辣根过氧化氢酶溶液为了方便即取即用，放置于4℃冰箱内避光保存，保质期为三天；
(2)取浓度为6wt％的丝素蛋白溶液2mL于5mL离心管内，再从配制好的300U/mL辣根过氧化氢酶溶液中取30U辣根过氧化氢酶，即从300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液中取100μL与2mL的丝素蛋白溶液在5mL离心管中混合均匀；
(3)取0.5g葡聚糖凝胶颗粒G50于35mm小培养皿中，加入300μL纯水将G50浸润，将G50颗粒与纯水搅拌均匀，得到浸润好的G50；
(4)将步骤(2)中配制的丝素蛋白溶液和辣根过氧化氢酶溶液混合液倒入步骤(3)中浸润后的G50中，将G50与混合液搅拌均匀，即可得到交联前的生物墨水；
(5)将步骤(4)中得到的交联前生物墨水加到3D生物打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上即可。3D打印结束后，在托盘内注入浓度为0.1wt％的过氧化氢溶液，利用过氧化氢溶液将3D打印产物交联，然后将支架浸入水中以去除G50，最终得到去除凝胶颗粒的支架样品。
(6)为了研究不同丝素蛋白和G50颗粒用量对多孔支架孔径的影响，本发明还按照上述方法调节了墨水中两种物质的用量。各物质的应力应变测试结果详见附图2，流变力学测试结果详见附图3。其中SF表示丝素蛋白溶液，0.25g G-50表示葡聚糖的添加量为0.25g，图2中其他含义依次类推，图3中，G'表示储存模量、G"表示损失模量。从图2可以看出8wt％丝素蛋白浓度和添加0.25克葡聚糖的生物墨水力学性能最优。图3结果表明，6wt％丝素蛋白生物墨水的最终储存模量最高，10wt％生物墨水的最终储存模量最低，这表明6wt％丝素蛋白生物墨水的流变性更好，更适合于3D生物打印。
(7)下表1为丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水的试验数据表，表1中，SF浓度指的是丝素蛋白(SF)占墨水总重的质量分数。其中，丝素蛋白/藻酸盐颗粒3D打印墨水、丝素蛋白/透明质酸颗粒3D打印墨水、丝素蛋白/碳酸钙颗粒3D打印墨水等此类墨水的结果与表1相似，因此在这里不一一列举。经数据处理结果表明丝素浓度范围在1～30wt％，颗粒体积占总体积比为33～40％时，支架样品的孔径较大，可达到20～500μm，且孔与孔之间联系紧密、相互贯通。
表1 丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水实验结果
Figure BDA0002947599160000081
Figure BDA0002947599160000091
实施例5：载有BMSCs的丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水
打印墨水为实施例4中方法制备，BMSCs由实施例3中细胞培养所得，主要测定多孔丝素生物墨水打印细胞载体的细胞粘附与增殖。同时以空白细胞爬片和纯的丝素蛋白打印支架作为对照，设置三个平行样。实验步骤为：
(1)配制辣根过氧化氢酶溶液：取300U/mg辣根过氧化氢酶固体5mg于10mL离心管中，加入PH值为7.4的PBS溶液5mL，摇晃离心管，使辣根过氧化氢酶与PBS溶液混合均匀，即可得到300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液5mL。辣根过氧化氢酶固体放置于-20℃冰箱内避光保存；配制的辣根过氧化氢酶溶液为了方便即取即用，放置于4℃冰箱内避光保存，保质期为三天；
(2)选取实施例3中活力较好的第3-5代细胞，消化后配制成浓度为3×104个/mL的细胞悬浮液。取一定量的BMSCs细胞与丝素按体积比混合，体积比为1:2，轻轻摇晃使细胞均匀分散在丝素溶液中。混合液中丝素浓度分别为6wt％，细胞浓度为2.5×103cells mL-1。得到丝素/细胞混合物，然后将其放置在37℃，5％CO2恒温培养箱中。
(3)取浓度为6wt％的丝素/细胞混合溶液2mL于5mL离心管内，再从配制好的300U/mL辣根过氧化氢酶溶液中取30U辣根过氧化氢酶，即从300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液中取100μL与2mL的丝素蛋白溶液在5mL离心管中混合均匀。
(4)取0.5g葡聚糖凝胶颗粒G50于35mm小培养皿中，加入300μL纯水将G50浸润，将G50颗粒与纯水搅拌均匀，得到浸润好的G50。将步骤(2)中配制的丝素蛋白/细胞混合物和辣根过氧化氢酶溶液混合液倒入浸润后的G50中，将G50与混合液搅拌均匀，即可得到交联前的载有BMSCs的生物墨水。
(5)将步骤(4)中得到的交联前生物墨水加到3D生物打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的6孔板上即可。3D打印结束后，在孔板内滴入浓度为0.1wt％的过氧化氢溶液，利用过氧化氢溶液将3D打印产物交联，然后将支架浸入培养液中以去除G50，最终得到去除凝胶颗粒的支架样品。去除后，将孔板用PH7.4的PBS缓冲液清洗3次，然后用无胎牛血清的DMEM培养基清洗1次，然后放在37℃，5％CO2恒温培养箱中，每两天更换一次培养基。
(6)将步骤(5)中得到的载有细胞的生物支架培养。在1，2，3和4周时，使用live/dead细胞活性试剂分析生物支架内的细胞活力。将EthD-1和Calcein AM在PBS缓冲液中混合均匀制备染料，然后在37℃环境下，将载有细胞的支架放染料溶液中孵育30分钟，取出后用共聚焦激光扫描显微镜和荧光显微镜进行观察。最后进行DNA定量测定，在60℃无菌环境下，将所有生物支架浸泡在1mL的木瓜蛋白酶溶液中消化16小时。取出后，放在离心机中离心60s，去除丝与细胞碎片，收集上清液。采用荧光分光光度计测定DNA含量。
实施例6：载有BMSCs的丝素蛋白/纤维素颗粒3D打印墨水
打印墨水由A液和B液组成，其中A液由6wt％的丝素蛋白溶液、300U/mL辣根过氧化氢酶溶液、0.1％过氧化氢溶液、纤维素颗粒(MC)和水组成，B液为0.1wt％过氧化氢溶液。这里提到的纤维素颗粒是不含在可去除颗粒范围的一种颗粒物质，做对照组进行实验。打印墨水制备步骤为：
(1)配制辣根过氧化氢酶溶液：取300U/mg辣根过氧化氢酶固体5mg于10mL离心管中，加入PH值为7.4的PBS溶液5mL，摇晃离心管，使辣根过氧化氢酶与PBS溶液混合均匀，即可得到300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液5mL。辣根过氧化氢酶固体放置于-20℃冰箱内避光保存；配制的辣根过氧化氢酶溶液为了方便即取即用，放置于4℃冰箱内避光保存，保质期为三天；
(2)选取实施例3中活力较好的第3-5代细胞，消化后配制成浓度为3×104个/mL的细胞悬浮液。取一定量的BMSCs细胞与丝素按体积比混合，体积比为1:2，轻轻摇晃使细胞均匀分散在丝素溶液中。混合液中丝素浓度分别为6wt％，细胞浓度为2.5×103cells mL-1。得到丝素/细胞混合物，然后将其放置在37℃，5％CO2恒温培养箱中。
(3)取浓度为6wt％的丝素/细胞混合溶液2mL于5mL离心管内，再从配制好的300U/mL辣根过氧化氢酶溶液中取30U辣根过氧化氢酶，即从300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液中取100μL与2mL的丝素蛋白溶液在5mL离心管中混合均匀。
(4)取0.45g纤维素颗粒MC于35mm小培养皿中，加入300μL纯水将MC浸润，将MC颗粒与纯水搅拌均匀，得到浸润好的MC。将步骤(2)中配制的丝素蛋白/细胞混合物和辣根过氧化氢酶溶液混合液倒入浸润后的MC中，将MC与混合液搅拌均匀，即可得到交联前的载有BMSCs的生物墨水。
(5)将步骤(4)中得到的交联前生物墨水加到3D生物打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的6孔板上即可。3D打印结束后，在孔板内滴入浓度为0.1wt％的过氧化氢溶液，利用过氧化氢溶液将3D打印产物交联，最终得到支架样品。将孔板用PH7.4的PBS缓冲液清洗3次，然后用无胎牛血清的DMEM培养基清洗1次，然后放在37℃，5％CO2恒温培养箱中，每两天更换一次培养基。
(7)将步骤(5)中得到的载有细胞的生物支架培养。在1，2，3和4周时，使用live/dead细胞活性试剂分析生物支架内的细胞活力。将EthD-1和Calcein AM在PBS缓冲液中混合均匀制备染料，然后在37℃环境下，将载有细胞的支架放染料溶液中孵育30分钟，取出后用共聚焦激光扫描显微镜和荧光显微镜进行观察。最后进行DNA定量测定，在60℃无菌环境下，将所有生物支架浸泡在1mL的木瓜蛋白酶溶液中消化16小时。取出后，放在离心机中离心60s，去除丝与细胞碎片，收集上清液。采用荧光分光光度计测定DNA含量。
(8)为了比较不同方法制备的支架孔径差异，本发明还将上述方法制备的纯丝素凝胶支架、丝素蛋白/纤维素生物支架、丝素蛋白多孔生物支架(本发明方法制备的支架)进行扫描电镜处理，各支架表面形貌特征详见附图6。其中图6a-c依次表示纯丝素蛋白生物凝胶支架、丝素无造孔生物墨水打印的支架、丝素造孔生物墨水打印的生物支架表面放大100倍的电镜图。结果表明造孔生物材料内部的孔隙具有一定的连通性，有利于细胞向材料内部生长。同时，仔细观察发现，丝素蛋白多孔支架表面孔直径大小远远超过纯丝素凝胶支架，比丝素未造孔生物支架还要好一些，其表面结构有利于细胞的粘附和生长。
附图4-5是实施例5与实施例6方法测得的大鼠骨髓间充质干细胞在不同生物墨水中的增殖情况。图4和5分别是通过DNA含量测定确定在丝素造孔生物支架、丝素未造孔生物支架中的细胞生长。通过观察细胞生长在1-6周内不同时间点的DNA含量，发现随着时间的增长在未造孔生物墨水凝胶中的DNA含量不断减少，只有第6周有小幅度的增长。相比之下，在造孔生物墨水凝胶中的DNA含量在不断增长，第6周时细胞数量可达到第一天的3倍以上。这可能是由于生物支架孔径大，可显著提高支架内部物质交换效率，提高细胞增殖效率和分化能力。结果表明，丝素蛋白造孔支架适合细胞增殖与生长。
实施例7：一种丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水(物理交联)
打印墨水由A液组成，其中A液由10wt％的丝素蛋白溶液、分子量为400的聚乙二醇(PEG)、终浓度为15wt％葡聚糖凝胶颗粒G50和水组成，制备步骤为：
(1)取0.5g葡聚糖凝胶颗粒G50于35mm小培养皿中，加入300μL纯水将G50浸润，将G50颗粒与纯水搅拌均匀，得到浸润好的G50；
(2)取浓度为10wt％的丝素蛋白溶液2mL倒入步骤(1)中浸润后的G50中，将G50与丝素蛋白液搅拌均匀，即可得到丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒溶液；
(3)往2mL步骤(2)所得的丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒溶液中加入2mL聚乙二醇400等体积混合并混合均匀，放在37摄氏度恒温箱中放置10～30分钟取出，得到交联后的生物墨水；
(4)将步骤(3)中得到的交联后生物墨水加到挤出式3D打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上。打印温度为37℃，3D打印结束后，凝胶化时间为10～30min，将样品浸泡在蒸馏水中反复洗净，得到支架样品；
由以上方法制得的支架样品具有多个孔洞，丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水孔洞直径为100μm～340μm，支架的压缩模量为15kPa，储能模量为110kPa，损耗模量为10kPa。
此外，对步骤(4)得到的支架样品进行扫描电镜处理，观察孔径大小，孔与孔相互贯通情况；
为了研究不同丝素蛋白和G50颗粒用量对多孔支架孔径的影响，本发明还按照上述方法调节了墨水中两种物质的用量。下表2为采用物理交联的方法制备的丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水的试验数据表，表2中，SF浓度指的是丝素蛋白(SF)占墨水总重的质量分数。使用乙醇、甲醇等试剂物理交联制备的生物墨水结果与表2相似，因此在这里不一一列举。
表2 丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水实验结果
Figure BDA0002947599160000121
Figure BDA0002947599160000131
实施例8：一种丝素蛋白/明胶/藻酸盐凝胶颗粒复合3D打印墨水
打印墨水由A液和B液组成，其中A液由浓度为5wt％的丝素蛋白溶液、酶活性为300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液、5wt％的明胶、10％氯化钙溶液、5.9％海藻酸钠溶液以及1.62wt％柠檬酸钠水溶液和水组成，B液为0.1wt％过氧化氢溶液，此处柠檬酸钠水溶液是为了去除藻酸盐颗粒。打印墨水制备步骤为:
(1)配制辣根过氧化氢酶溶液：取300U/mg辣根过氧化氢酶固体5mg于10mL离心管中，加入PH值为7.4的PBS溶液5mL，摇晃离心管，使辣根过氧化氢酶与PBS溶液混合均匀，即可得到300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液5mL。辣根过氧化氢酶固体放置于-20℃冰箱内避光保存；配制的辣根过氧化氢酶溶液为了方便即取即用，放置于4℃冰箱内避光保存，保质期为三天；
(2)将浓度为5wt％的丝素蛋白溶液和明胶等质量比混合于5mL离心管内，得到丝素蛋白/明胶混合溶液。再从配制好的300U/mL辣根过氧化氢酶溶液中取30U辣根过氧化氢酶，即从300U/mL的辣根过氧化氢酶溶液中取100μL与2mL的丝素蛋白/明胶溶液在5mL离心管中混合均匀，得到混合溶液；
(3)取1g海藻酸钠(SA)于35mm小培养皿中，加入1.7mL纯水，将海藻酸钠与纯水搅拌均匀，即得浓度为5.9wt％的海藻酸钠溶液，将步骤(2)中配制的混合溶液倒入配制好的海藻酸钠溶液中，将海藻酸钠与混合液搅拌均匀；取50g氯化钙于烧杯中，加入500mL纯水，在搅拌器上将其搅拌均匀，取1mL配制好的氯化钙溶液滴入得到的混合液中，搅拌均匀，让海藻酸钠与氯化钙在混合液中均匀快速且充分凝胶，形成藻酸盐微球颗粒，即可得到交联前的生物墨水；
(4)将步骤(3)中得到的交联前生物墨水加到3D生物打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上即可。打印温度为37℃，凝胶化时间为30min，3D打印结束后，在托盘内注入浓度为0.1％的过氧化氢溶液，过氧化氢溶液将打印样品包裹即可，放入37℃烘箱内30分钟，诱导丝素蛋白进行交联；
(6)取1.62g柠檬酸钠于烧杯中，加入50mL的纯水稀释，再将其于100mL容量瓶中定容至100mL，即得浓度为1.62％的柠檬酸钠水溶液。将交联好的样品从烘箱内拿出，将托盘内的过氧化氢溶液倒掉，往托盘内缓慢倒入配制好的柠檬酸钠水溶液，室温放置30分钟，为了除去藻酸盐，再倒掉托盘内的柠檬酸钠水溶液，往托盘内缓慢倒入纯水，再倒掉纯水，反复三次，为了将样品表面残余的柠檬酸钠水溶液和过氧化氢溶液洗掉，从而得到生物支架。
制得的生物支架具有多个孔洞，孔洞直径为100μm～400μm，压缩模量为13kPa，储能模量为130kPa，损耗模量为13kPa。
为了研究不同丝素蛋白、SA颗粒用量对多孔支架孔径的影响，本发明还按照上述方法调节了墨水中两种物质的用量。由于丝素蛋白与明胶的质量比为5:5时，复合水凝胶的凝胶时间、生物性能最优，本发明采用丝素蛋白与明胶的质量比5：5为固定变量，SF与SA浓度为自变量，观察实验结果。下表3为丝素蛋白/明胶/藻酸盐凝胶颗粒3D打印墨水的试验数据表，表3中，SF浓度指的是丝素蛋白(SF)占墨水总重的质量分数。丝素/聚乙烯醇复合水凝胶、丝素/胶原蛋白复合水凝胶、丝素/PCL复合水凝胶、丝素/壳聚糖复合水凝胶与可去除颗粒混合后制备的生物墨水得出的结果与表3相似，且不论采取何种凝胶交联方式、打印方式试验数据规律都大致不变，因此，此处不一一列举。
表3 丝素蛋白/明胶/藻酸盐凝胶颗粒复合3D打印墨水实验结果
Figure BDA0002947599160000151
Figure BDA0002947599160000161
经数据处理以上结果表明，打印墨水中丝素浓度范围在1～30wt％，可去除颗粒体积占总体积比为20～40％时，支架样品的孔径较大，可达到32～452μm，且孔与孔之间联系紧密、相互贯通。
实施例9：一种光交联丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水
(1)制备SiMA光敏丝素蛋白：将脱胶和溶解后的丝素蛋白溶液，加入424mM的GMA溶液混合均匀，以30rpm的速度在60℃下反应3h,使之产生高产率反应。过滤后，使用分子量为12～14kDa的透析袋中透析4天，每天跟换6次去离子水，然后置于-80℃冰箱中过夜，冷冻干燥后置于-4℃下以备使用。将SiMA溶于不同体积的去离子水中制备不同溶度的溶液；
(2)取0.8g葡聚糖凝胶颗粒G50于35mm小培养皿中，加入480μL纯水将G50浸润，将G50颗粒与纯水搅拌均匀，得到浸润好的G50；
(3)将步骤(1)中配制的丝素蛋白溶液倒入步骤(2)中浸润后的G50中，将G50与混合液搅拌均匀；
(4)在避光条件下准确称取0.4w/v％的光引发剂(LAP)，然后加入步骤(3)中的混合丝素蛋白溶液中，即可得到交联前的生物墨水；
(5)在4℃避光条件下，将步骤(4)中得到的交联前生物墨水加到3D生物打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上即可。3D打印结束后将上述材料转移至模具内，置于强度为3.5mJ/cm2强度的紫外光下交联5分钟，即得到一定形状的支架。
(6)将交联好的样品拿出，并将在步骤(4)中交联前墨水中起支撑作用的葡聚糖凝胶颗粒G50去除。
为了研究不同丝素蛋白、G50颗粒用量对多孔支架孔径的影响，本发明还按照上述方法调节了墨水中两种物质的用量。下表4为光交联丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水的试验数据表，表4中，SF浓度指的是丝素蛋白(SF)占墨水总重的质量分数。值得说明的是，不论采用何种方式将丝素蛋白修饰为光敏丝素蛋白，修饰后的光敏丝素蛋白与可去除颗粒混合成的生物墨水试验结果与表4基本相似。
表4 丝素蛋白/葡聚糖凝胶颗粒3D打印墨水实验结果
Figure BDA0002947599160000171
以上结果表明，生物墨水中丝素浓度范围在1～30wt％，可去除颗粒体积占总体积比为25～35％时，支架样品的孔径较大，可达到53～340μm，且孔与孔之间联系紧密、相互贯通。
实施例10：物理交联方法的3D打印生物墨水及应用
(1)将丝素蛋白溶液与可去除颗粒按一定体积比混合，制得混合溶液。
(2)往步骤1所得的混合溶液中加入乙醇、甲醇、聚乙二醇等其中一种试剂，在超声等作用下加快交联。
(3)将步骤(2)中得到的交联后生物墨水加到挤出式3D打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上即可。3D打印结束后，得到支架样品。
实施例11：化学交联方法的3D打印生物墨水及应用(适用于挤出式)
方法一：(1)将丝素蛋白溶液与可去除颗粒按一定体积比混合，制得混合溶液。
(2)往步骤(1)所得的混合溶液中加入京尼平和戊二醛等其中一种试剂，进行充分混合。
(3)将步骤(2)中得到的交联前的3D打印生物墨水加到挤出式3D打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上即可。3D打印结束后将样品放透风口在小于30分钟内凝胶，得到支架样品1。打印机的喷头移动速度为220～260mm/min，出料速度为0.160～0.170mL/min。
(4)将样品浸渍于去离子水或无毒的有机溶剂去除可去除颗粒。
方法二：(1)将丝素蛋白溶液与可去除颗粒按一定体积比混合，制得混合溶液。
(2)往步骤(1)所得的混合溶液中加入再加入核黄素等物质混合均匀后。
(3)将步骤(2)中得到的交联前生物墨水加到挤出式3D打印机的注射器中，即可开机打印，打印到3D打印机配置的托盘上即可。3D打印结束后，放在模具中，置于3.5mJ/cm2强度的紫外线照射下交联5分钟，得到支架样品2。
(4)将样品浸渍于去离子水或无毒的有机溶剂去除可去除颗粒。
实施例12：化学交联方法的3D打印生物墨水及应用(适用于光固化式)
方法一：(1)将丝素蛋白溶液与可去除颗粒按一定体积比混合，制得混合溶液。
(2)往步骤(1)所得的混合溶液中加入核黄素等物质混合均匀后。
(3)将步骤(2)中得到的交联前生物墨水加到光固化3D打印机配置的托盘上。相关参数设置为喷头直径0.2mm，打印平台温度40～45摄氏度，打印速度30mm/s，打印完成后在以及365nm的紫外光源照射下在5秒内快速成型。
(4)将样品浸渍于去离子水或无毒的有机溶剂去除可去除颗粒。
方法二：(1)将实施例2制备的光敏丝素蛋白配制成浓度为1～30wt％的光敏丝素蛋白溶液，然后将得到的溶液与可去除颗粒按一定体积比混合，制得混合溶液。
(2)往步骤(1)所得的混合溶液中加入再加入光引发剂(LAP)如Irgacure 2959、VA086和I2959，混合均匀。
(3)将步骤(2)中得到的交联前生物墨水加到光固化3D打印机配置的托盘上。相关参数设置为喷头直径0.2mm，打印平台温度40～45摄氏度，打印速度30mm/s，打印完成后在以及365nm的紫外光源照射下在5秒内快速成型。
(5)将样品浸渍于去离子水或无毒的有机溶剂去除可去除颗粒。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种丝素蛋白3D打印生物墨水，其特征在于：包括
A液，所述A液包括丝素蛋白基材料、颗粒和添加剂，所述丝素蛋白基材料包括丝素蛋白或光敏丝素蛋白，所述添加剂包括诱导剂、交联剂A、光敏剂或光引发剂；所述A液中，丝素蛋白基材料的质量分数为1～30wt％，所述可去除颗粒占A液的总体积分数为10～90％；所述添加剂用于使丝素蛋白3D打印生物墨水交联固化；
当所述添加剂包括交联剂A时，丝素蛋白3D打印生物墨水还包括B液，所述B液包括交联剂B；所述交联剂A和交联剂B共同作用以使丝素蛋白3D打印生物墨水发生化学交联。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白3D打印生物墨水，其特征在于：所述丝素蛋白或光敏丝素蛋白的分子量为50～150kDa。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白3D打印生物墨水，其特征在于：所述可去除颗粒包括无机颗粒和/或有机颗粒，所述有机颗粒的材质包括葡聚糖、藻酸盐、透明质酸、琼脂、聚苯乙烯、聚己内酯、聚乳酸和聚氨酯中的一种或几种，所述无机颗粒的材质包括碳酸钙或氯化钠。
4.根据权利要求1所述的丝素蛋白3D打印生物墨水，其特征在于：所述可去除颗粒的粒径大小为50μm～500μm。
5.根据权利要求1所述的丝素蛋白3D打印生物墨水，其特征在于：所述诱导剂为乙醇、甲醇和聚乙二醇和甘油中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的丝素蛋白3D打印生物墨水，其特征在于：所述交联剂A包括戊二醛、京尼平、环氧树脂和酶中的一种或几种；所述交联剂B包括过氧化氢。
7.一种生物支架的3D打印方法，其特征在于，采用权利要求1～6中任一项所述的丝素蛋白3D打印生物墨水进行3D打印，包括以下步骤：
当所述添加剂包括诱导剂时：
将所述A液在物理作用下使丝素蛋白发生物理交联，然后按照预设的形状，将交联后的生物墨水进行挤出式3D打印成型，打印结束后，去除颗粒，得到具有多孔结构的生物支架；
当所述添加剂包括交联剂A时：
按照预设的形状，将所述A液进行挤出式3D打印成型，打印结束后，利用B液处理3D打印产物，使得打印产物发生化学交联固化，然后去除颗粒，得到具有多孔结构的生物支架；
当所述添加剂包括光敏剂或光引发剂时：
按照预设的形状，将所述A液进行光固化3D打印成型，打印结束后，光照3D打印产物，使得打印产物发生光交联固化，然后去除可去除颗粒，得到具有多孔结构的生物支架。
8.根据权利要求7所述的生物支架的3D打印方法，其特征在于：所述物理作用包括超声、电刺激和涡流振荡条件中的一种或几种。
9.根据权利要求7所述的生物支架的3D打印方法，其特征在于：挤出式3D打印成型时，打印机的喷头移动速度为220～260mm/min，出料速度为0.1600～170mL/min；光固化3D打印成型时，打印机的喷头移动速度为150～200m/min。
10.权利要求7所述的生物支架的3D打印方法所制备的生物支架。
CN202110197497.0A 2021-02-22 2021-02-22 丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用 Pending CN112972765A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110197497.0A CN112972765A (zh) 2021-02-22 2021-02-22 丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110197497.0A CN112972765A (zh) 2021-02-22 2021-02-22 丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112972765A true CN112972765A (zh) 2021-06-18

Family

ID=76349372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110197497.0A Pending CN112972765A (zh) 2021-02-22 2021-02-22 丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112972765A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774021A (zh) * 2021-08-25 2021-12-10 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法
CN113817326A (zh) * 2021-07-01 2021-12-21 广东省科学院健康医学研究所 一种多功能儿茶酚水凝胶敷料及其制备方法和应用
CN114480269A (zh) * 2022-01-30 2022-05-13 上海交通大学 重组蛋白质水凝胶培养支架及其制备方法
CN115227871A (zh) * 2022-08-10 2022-10-25 北京积水潭医院 一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用
CN116041735A (zh) * 2022-12-07 2023-05-02 武汉纺织大学 一种高弹性丝素蛋白水凝胶及其光固化制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107998449A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 一种3d打印高强度生物墨水材料
CN110201225A (zh) * 2019-05-06 2019-09-06 华南理工大学 用于软骨修复的3d打印丝素/明胶支架及其制备方法
US20200016295A1 (en) * 2018-07-12 2020-01-16 Lifebond, Ltd. Injectable scaffolds for soft tissue repair
KR20200029656A (ko) * 2018-09-05 2020-03-19 서울대학교산학협력단 3d 프린팅을 위한 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물 및 이의 제조방법
CN111995793A (zh) * 2019-08-09 2020-11-27 四川大学华西医院 一种用于低温3d打印多孔聚己内酯支架的材料及打印方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107998449A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 一种3d打印高强度生物墨水材料
US20200016295A1 (en) * 2018-07-12 2020-01-16 Lifebond, Ltd. Injectable scaffolds for soft tissue repair
KR20200029656A (ko) * 2018-09-05 2020-03-19 서울대학교산학협력단 3d 프린팅을 위한 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물 및 이의 제조방법
CN110201225A (zh) * 2019-05-06 2019-09-06 华南理工大学 用于软骨修复的3d打印丝素/明胶支架及其制备方法
CN111995793A (zh) * 2019-08-09 2020-11-27 四川大学华西医院 一种用于低温3d打印多孔聚己内酯支架的材料及打印方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOON HEE KIM等: ""Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing"", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817326A (zh) * 2021-07-01 2021-12-21 广东省科学院健康医学研究所 一种多功能儿茶酚水凝胶敷料及其制备方法和应用
CN113774021A (zh) * 2021-08-25 2021-12-10 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法
CN113774021B (zh) * 2021-08-25 2024-06-04 中国人民解放军陆军特色医学中心 一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法
CN114480269A (zh) * 2022-01-30 2022-05-13 上海交通大学 重组蛋白质水凝胶培养支架及其制备方法
CN115227871A (zh) * 2022-08-10 2022-10-25 北京积水潭医院 一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用
CN116041735A (zh) * 2022-12-07 2023-05-02 武汉纺织大学 一种高弹性丝素蛋白水凝胶及其光固化制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112972765A (zh) 丝素蛋白3d打印生物墨水及其应用
Chen et al. Three-dimensional printed electrospun fiber-based scaffold for cartilage regeneration
Shapira et al. Stabilization strategies in extrusion-based 3D bioprinting for tissue engineering
ES2408554T3 (es) Método para preparar armazón poroso para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro de células
CN111097068B (zh) 一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3d打印支架及其制备方法
Li et al. Recent progress in tissue engineering and regenerative medicine
CN107007883B (zh) 一种软骨修复支架及其制备方法
CN207785546U (zh) 一种组织工程软骨复合支架
CN104958785A (zh) 一种具有二级三维结构的复合骨修复材料及其制备方法
CN112972760B (zh) 一种负载内皮细胞外基质的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法
Liu et al. 3D bioprinting of cell-laden nano-attapulgite/gelatin methacrylate composite hydrogel scaffolds for bone tissue repair
Li et al. Electrospun blends of natural and synthetic polymers as scaffolds for tissue engineering
CN114588312A (zh) 功能化纤维大分子交联体键合3d打印弹性植入体及其制备方法与应用
CN111166937A (zh) 脱细胞细胞外基质及其制备方法和生物墨水
JP6240997B2 (ja) ガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体および細胞シート
CN108310463B (zh) 一种3d打印生物墨水及其制备方法
CN114887116B (zh) 一种负载间充质干细胞外基质的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法
CN114796617A (zh) 一种复合3d打印墨水及其应用
CN103861145A (zh) 一种即刻交联技术用于制备大孔三维纳米纤维支架
CN108452378B (zh) 一种3d生物打印成型方法
CN114042191A (zh) 一种细胞打印的成骨功能化支架及其制备方法和应用
CN111135344A (zh) 复合白蛋白的碳纳米管/胶原基软骨修复用支架及其制备方法
CN115212353B (zh) 一种生物支架及其制备方法与应用
CN113577393B (zh) 一种骨修复材料及其制备方法和应用
Sun et al. Cell-Incorporated Bioactive Tissue Engineering Scaffolds made by Concurrent Cell Electrospinning and Emulsion Electrospinning

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210618