CN113774021A - 一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,将间充质干细胞与葡聚糖、光敏生物材料进行有序结合,使含间充质干细胞的葡聚糖以球状液滴形态均匀分布在光敏生物材料溶液中,通过光固化后,除去葡聚糖,从而形成球状空洞结构,促使间充质干细胞成球生长,使含间充质干细胞球生物材料支架一步成型。本发明极大的缩短了含间充质干细胞球支架材料的成型时间,避免了制备过程中对间充质干细胞活性的影响,同时使间充质干细胞球在光敏生物材料中均匀分布,从而提高间充质干细胞的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,具体涉及一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells;MSCs)不仅能持续分泌多种促再生因子和抗炎因子,还能根据损伤组织环境调整,实现因子分泌及分化功能的动态反馈调节,促进损伤组织的高效修复,为组织工程及再生医学领域提供了一种强有力的工具。但是,直接将MSCs的单细胞悬液注射到损伤组织部位,会使MSCs随着血液或组织间隙快速迁移至其他部位,导致MSCs在损伤部位的滞留时间较短。并且,在没有保护的情况下,MSCs在递送至体内后的存活率低。同时,离散且相对独立的MSCs由于缺乏细胞间的相互作用和细胞外基质,其分泌、调节再生微环境的能力受到限制。因此,将MSCs球载入生物材料中构建含MSCs球的生物支架可进一步促进损伤组织/器官修复及组织重建;一方面,支架可使MSCs固定在局部位置,维持有效细胞浓度,并阻挡免疫细胞的攻击,提高植入后细胞的存活;另一方面,MSCs球可通过强化细胞间的相互作用显著性提高MSCs促再生能力。
目前,MSCs球与生物材料结合的方式主要有两种:一种是先通过悬滴或旋转等方法制备MSCs球,再与生物材料溶液混合,最后固化生物材料,得到含MSCs球的生物材料支架,然而这种方法操作过程复杂,会影响MSCs的活性;另一种方法是先将生物材料支架制备完成后,再将MSCs单细胞悬液滴加到支架材料表面,通过支架表面特殊的拓扑结构,使MSCs成球生长,但MSCs球主要存在支架的表面,很难使其均匀分布在生物材料支架内部。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足,本发明的目的在于提供一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,以解决现有技术中操作过程繁杂、影响MSCs球活性、且MSCs球无法均匀分布在生物材料内部的问题。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,所述生物材料支架通过以下方法获得:
1)配置浓度为0.1%~20%葡聚糖溶液,将间充质干细胞重悬于葡聚糖溶液中;
2)配置浓度为5%~30%光敏生物材料溶液,并在其中加入0.5%~5%光引发剂;
3)将所述葡聚糖溶液与步骤2)得到的光敏生物材料溶液按照一定的体积比例进行混合,采用365~405nm波长的光源对混合后的溶液进行照射固化;
4)将步骤3)固化后的产品进行培养,得到含间充质干细胞球的生物材料支架。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明利用将MSCs与葡聚糖(Dex)和光敏生物材料进行有序结合,使含MSCs的葡聚糖以球状液滴形态均匀分布在光敏生物材料溶液中,再通过光照使光敏生物材料固化,由于葡聚糖不会发生固化,对其中的干细胞起到保护作用,避免光敏生物材料在固化过程中对干细胞的活性造成影响,同时,通过葡聚糖的球状液滴使干细胞能够均匀分布在光敏生物材料中,进而提高干细胞的疗效。
2、本发明制备的生物材料支架在固化后,通过细胞培养基对光敏生物材料进行洗涤,将其中的葡聚糖和光引发剂从光敏生物材料中洗脱出来,给予干细胞足够的生存空间,也使得干细胞在生长过程中能够获得足够的氧气和营养物质;同时,由于葡聚糖是以球状液体的形态存在于光敏生物材料中,使得光敏生物材料的内部在固化并洗去葡聚糖之后形成多个球状空间,干细胞在球状空间中生长发育,最终获得干细胞球。
3、本发明制备的生物材料支架能够促进干细胞干性维持,提高再生基因及蛋白的表达,便于干细胞的运输和保存,提高了载干细胞生物材料组织修复及重建的能力,并且所述生物材料支架可通过生物3D打印技术进行生物制造和器官重建,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中干细胞球形成示意图。
图2中a)为GelMA溶液与Dex溶液混合固化后的图像;b)为不同浓度GelMA溶液与Dex溶液的成孔图像:Control组为标准GelMA,其中,标准GelMA是将浓度为15%GelMA与0.5%LAP通过光固化获得,其后依次为不同浓度GelMA与Dex按比例混合固化后的孔径荧光图像。
图3中a)为RDPSCs在材料中的成球生长;b)为RDPSCs在材料中的增殖活性;c)为相关基因检测,包括相关生长因子基因:VEGF、FGF和BDNF;干性基因:SOX-2。。
图4中a)为BMSCs在材料中的成球生长;b)为BMSCs在材料中的增殖活性;c)为相关干性基因检测(Nanog、SOX-2和OCT-4)。
图5中a)为GelMA与Dex混合液用于3D打印:车轮结构与心脏;b)为细胞在材料中的沉降系数统计。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
一、一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法
目前,间充质干细胞球与生物材料结合的方式主要有两种:一种方法是先将生物材料支架制备完成后,再将MSCs单细胞悬液滴加到支架材料表面,通过支架表面特殊的拓扑结构,使MSCs成球生长,但这种方法使MSCs球主要存在支架的表面,很难均匀分布在生物材料支架内部。另一种方法是先通过悬滴或旋转等方法制备间充质干细胞球,再与生物材料溶液混合,最后固化生物材料,得到含间充质干细胞球的生物材料支架。然而在实际使用中发现,这种方法的操作过程非常复杂,整个制备过程需要耗费大量时间,这严重影响了间充质干细胞球的使用寿命。而且,在光敏生物材料由液态转化为固态这一过程中,材料内部会产生强大的应力,这些应力会挤压或拉扯间充质干细胞球,使间充质干细胞球的形态发生变化,难以维持球状形态,并且,这些应力并不会消失,应力作用会贯穿间充质干细胞的整个生长过程,导致间充质干细胞不得不在这些应力的作用下生长,而最终无法维持球状形态。除此之外,固化后的生物材料也无法为间充质干细胞提供良好的生长环境,由于固化后的生物材料具有非常致密的网络结构,这种结构会严重限制生物材料内外氧气以及各种营养物质的交换,导致身处生物材料中的间充质干细胞在生长过程中难以获得足够的氧气和营养物质,这些情况不仅严重影响间充质干细胞的存活率和其最终形态,还会影响存活的间充质干细胞的活性和功能,导致在使用时生物材料支架中的间充质干细胞球活性出现了大幅度降低。在实际使用中发现,即便这些间充质干细胞能够存活,存活的间充质干细胞难以维持球状形态,并且,干细胞的干性受到严重影响,大部分存活的干细胞干性难以维持。
针对这些缺陷,本发明经过研究后意外发现,将间充质干细胞与葡聚糖、光敏生物材料进行有序结合,利用葡聚糖的球状液滴形态既能对间充质干细胞进行保护,其留下的球状空间又能对间充质干细胞的生长起到塑形作用,促进间充质干细胞成球生长,还能通过葡聚糖的球状液滴使间充质干细胞在光敏生物材料中均匀分布,从而提高间充质干细胞的疗效。通过深入研究还发现,控制葡聚糖溶液与光敏生物材料溶液之间的体积比、以及光明生物材料溶液的浓度,能够对光敏生物材料溶液中葡聚糖液滴的直径进行控制,进而对生物材料支架的孔隙大小进行调整,使多孔支架的孔隙大小能够满足不同应用需要。
本发明中间充质干细胞成球过程如图1所示,所述生物材料支架通过以下方法获得:
1)配置浓度为0.1%~20%葡聚糖溶液,将间充质干细胞重悬于葡聚糖溶液中;
2)配置浓度为5%~30%光敏生物材料溶液,并在其中加入0.5%-5%光引发剂LAP;
3)将所述葡聚糖溶液与步骤2)得到的光敏生物材料溶液按照一定的体积比例进行混合,采用365~405nm波长的光源对混合后的溶液进行照射固化;
4)将步骤3)固化后的产品进行培养,得到含间充质干细胞球的生物材料支架。
在具体实施时,所述光敏生物材料包括甲基丙烯化明胶、甲基丙烯化丝素蛋白、甲基丙烯化羊毛角蛋白、7-羧基甲氧基-4-甲基香豆素化明胶中的一种。所述光敏生物材料溶液与葡聚糖水溶液的体积比为(1:1)~(5:1)。其中,步骤1)中,在光敏生物材料溶液中加入光引发剂,能够加快光敏生物材料固化过程,而光引发剂的加入需要根据光敏生物材料中光敏基团的种类进行调整,当光敏基团为7-羧基甲氧基-4-甲基香豆素、7-羟基香豆素-3-羧酸时,可不使用光引发剂;当光敏基团为甲基丙烯酸酯时,则需要光引发剂,光引发剂可选用LAP(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂)、I2959(2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮,化学式为C12H16O4)、I819(酰基膦氧化物类光引发剂,化学名为苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦)中的一种,每1mL的溶剂中加入5mg~50mg光引发剂。
以下实施例中,GelMA(甲基丙烯酸酐化明胶)由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得,是一种光敏性的生物水凝胶材料。PBS为磷酸缓冲盐溶液,1*PBS表示1倍浓度的PBS缓冲液,即0.01M浓度,磷酸缓冲盐溶液的配方为8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶解到1L的去离子水中。
二、性能试验
1、含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法
1)配制原料溶液:在每1mL的1*PBS溶液中分别加入150mg、100mg和75mg的GelMA生物材料,得到浓度为15%、10%及7.5%的GelMA溶液,在GelMA溶液中加入光引发剂LAP,每1mL的1*PBS溶液中加入5mg光引发剂LAP;同样,在每1mL的1*PBS溶液中加入100mg的葡聚糖,得到浓度为10%的葡聚糖溶液,将干细胞与葡聚糖溶液混合。其中,浓度15%代表每1mL溶剂中有150 mg生物材料,1mL溶剂的质量为1000mg,150mg/1000mg×100%=15%。
2)GelMA溶液和含有干细胞的葡聚糖溶液按照体积比1:1、2:1和5:1进行混合,得到含有葡聚糖液滴的乳浊液。
3)用405nm波长的蓝光光源进行照射,使光敏生物材料固化。
4)将步骤3)得到的光敏生物材料浸泡在1*PBS溶液中,以去除光引发剂和葡聚糖,得到含间充质干细胞球的生物材料支架实施例1~5。
表1
实施例1~5通过本发明所述方法进行培养后,均能够得到含间充质干细胞球的生物材料支架。
2、不同浓度GelMA与Dex混合后形成的孔径大小
将不同浓度的GelMA-罗丹明与Dex-Fitc混合均匀,经过可见光照射固化,通过共聚焦拍摄Dex在GelMA中形成的孔径大小。从图2b中可以看出,浓度为15%GelMA与Dex混合后形成的孔径更大,且以浓度梯度规律孔径变小。
3、不同种类干细胞采用本发明所述方法的应用
目前发现存在干细胞的组织包括:骨髓、外周血、脑、脊髓、血管、骨胳肌、肝、胰、角膜、视网膜等,不同种类的干细胞通过本发明所述方法进行培养均能够获得对应的干细胞球,以大鼠乳牙间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞为例。
1)RDPSCs(大鼠乳牙间充质干细胞)在GelMA中的成球生长及相关基因检测
将RDPSCs单细胞悬液与Dex混合均匀,再以1×106cells/mL in GelMA的浓度载入GelMA中,采用本发明所述方法进行固化后洗涤,将Dex洗脱出去,最后观察RDPSCs细胞在GelMA中的增殖及相关基因表达。图3a)中结果表明RDPSCs在GelMA中(第五天)形成大小均匀的球体,且较于Control组增殖显著(图3b);生长因子基因(血管内皮生长因子:VEGF;脑源神经生长因子:BDNF和成纤维细胞生长因子:FGF)及干性基因(SOX-2)表达检测证明RDPSCs在成球生长后,基因表达显著增加(图3c)。
2)BMSCs(大鼠骨髓间充质干细胞)在材料中的成球生长及相关基因测定
将BMSCs单细胞悬液与Dex混合均匀,再以1×106cells/mL in GelMA的浓度载入GelMA中,采用本发明所述方法进行固化后洗涤,将Dex洗脱出去,最后观察BMSCs细胞在GelMA中的增殖及相关干性基因表达。图中结果表明BMSCs在GelMA中(第五天)形成均匀的球体(图4a);且与Control组相比较,Dex组增殖显著(图4b);干性基因(Nanog、SOX-2和OCT-4)表达检测证明BMSCs在成球生长后,干性基因表达显著增加(图4c)。
从以上两个实施例可以看出,大鼠乳牙间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞均能够通过本发明所述方法培养获取对应的干细胞球,这表明,不同种类的干细胞通过本发明所述方法进行培养后能够成球生长,并获得对应的干细胞球;同时,相较于常规培养,通过本发明所述方法培养的干细胞球其干性相关基因的表达出现显著上升,能够在传代过程中更好地保持干性,使得其增值能力有了显著提高。
4、GelMA与Dex混合液用于3D打印及打印精度测定
以实施例1为例,将配置好的GelMA溶液与Dex溶液混合均匀后,用生物3D打印机打印车轮结构与心脏结构;并检测细胞在不同浓度GelMA与Dex混合液中的沉降系数。实验结果表明15%GelMA与Dex混合后能用于3D打印,根据治疗需要打印不同结构的器官或者组织(图5a);且细胞在GelMA与Dex混合液中的沉降较标准GelMA有增加,当打印结构较为复杂的组织或器官时,不会影响细胞活性,可利于长时间的3D打印(图5b)。
本发明利用将MSCs与葡聚糖(Dex)和光敏生物材料进行有序结合,使含MSCs的葡聚糖以球状液滴形态均匀分布在光敏生物材料溶液中,再通过光照使光敏生物材料固化,由于葡聚糖不会发生固化,对其中的干细胞起到保护作用,避免光敏生物材料在固化过程中对干细胞的活性造成影响,同时,通过葡聚糖的球状液滴使干细胞能够均匀分布在光敏生物材料中,进而提高干细胞的疗效。本发明制备的生物材料支架在固化后,通过细胞培养基对光敏生物材料进行洗涤,将其中的葡聚糖和光引发剂从光敏生物材料中洗脱出来,给予干细胞足够的生存空间,也使得干细胞在生长过程中能够获得足够的氧气和营养物质;同时,由于葡聚糖是以球状液体的形态存在于光敏生物材料中,使得光敏生物材料的内部在固化并洗去葡聚糖之后形成多个球状空间,干细胞在球状空间中生长发育,最终获得干细胞球。本发明制备的生物材料支架能够促进干细胞干性维持,提高再生基因及蛋白的表达,便于干细胞的运输和保存,提高了载干细胞生物材料组织修复及重建的能力,并且所述生物材料支架可通过生物3D打印技术进行生物制造和器官重建,具有广阔的应用前景。
最后需要说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案,本领域的普通技术人员应当理解,那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本技术方案的宗旨和范围,均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,其特征在于,所述生物材料支架通过以下方法获得:
1)配置浓度为0.1%~20%葡聚糖溶液,将间充质干细胞重悬于葡聚糖溶液中;
2)配置浓度为5%~30%光敏生物材料溶液,并在其中加入0.5%~5%光引发剂;
3)将所述葡聚糖溶液与步骤2)得到的光敏生物材料溶液按照一定的体积比例进行混合,采用365~405nm波长的光源对混合后的溶液进行照射固化;
4)将步骤3)固化后的产品进行培养,得到含间充质干细胞球的生物材料支架。
2.根据权利要求1所述含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,其特征在于,所述光敏生物材料包括甲基丙烯化明胶、甲基丙烯化丝素蛋白、甲基丙烯化羊毛角蛋白、7-羧基甲氧基-4-甲基香豆素化明胶中的一种。
3.根据权利要求1所述含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,其特征在于,所述光敏生物材料溶液与葡聚糖水溶液的体积比为(1:1)~(5:1)。
4.根据权利要求1所述含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,其特征在于,所述光引发剂包括LAP、I2959、I819中的一种,每1mL的溶剂中加入5mg~50mg光引发剂。
5.根据权利要求1所述含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法,其特征在于,所述光敏生物材料溶液和葡聚糖溶液的溶剂包括生理盐水、1*PBS缓冲液或细胞培养基的一种。
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CN111035610A (zh) * | 2020-01-11 | 2020-04-21 | 长沙围度美容服务有限公司 | 一种含茶青素的减肥乳及其制备方法 |
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