CN114028622A - 一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：制备抗菌肽(KSL‑W)PLGA微球：将得到的冻干的抗菌肽(KSL‑W)PLGA微球与丝素蛋白溶液、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石，得到共混凝胶；对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，转化为3D打印模型；将3D打印模型导入低温3D打印软件中，将共混凝胶装入3D打印机的料筒中打印，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料。抗菌肽(KSL‑W)PLGA微球两步乳化操作简单制备得到抗菌肽(KSL‑W)PLGA微球用来包裹亲水性药物，最大程度地保持生物活性，并配合低温3D打印方法制备出骨修复材料，使抗菌肽(KSL‑W)PLGA微球兼具抗菌肽的生物活性，同时还具备良好的成骨生物活性。

Description

一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法。
背景技术
创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等导致的大块骨缺损，常需植骨修复来重建骨缺损。骨重建的目的是尽可能快速、完全地恢复骨的结构和功能。自体骨移植因其具有良好的骨传导性和骨诱导性是骨缺损植入的金标准。
随着材料学的快速发展，骨植入材料越来越多地应用于临床。骨科植入物感染是导致骨科手术失败的重要原因之一，如何增强植入材料的抗菌性成为了骨组织工程材料研究的重要课题。为了增强植入材料的抗菌性，学者们开始将纳米银、锌、二氧化钛、季铵盐、氟化钠、石墨烯等应用于抗菌骨修复材料的研究中。但加入上述材料制成的抗菌骨修复材料后，如纳米银在进入生物体内后主要分布于肝脏、肾脏等器官，通过抑制细胞色素P450家族中细胞色素氧化酶CYP2C、CYP2D的活性影响肝脏功能，并可诱导氧化应激引起肝脏病理学损伤，并且纳米银暴露也会对肾脏、心脏、肺部等机体重要器官造成损伤，还能进入生物体脑内并产生潜在的脑神经毒性效应。
抗菌肽可以对多种类病原体，具有广谱抗菌活性，抗菌肽通过在细菌的细胞膜积累并发生构象的变化进而破坏膜结构的完整性，导致细胞内容物外流，细菌细胞膜破裂，也可能同时存在一些胞内抗菌机制，如抑制核酸合成，干扰蛋白质和抑制细胞膜合成等。而且抗菌肽的抗菌过程迅速，在接触微生物数秒里就能发生，这是传统抗生素无法相比拟的。此外，抗菌肽多数都是带有正电荷的，而细菌的细胞膜富含磷脂酰甘油或丝氨酸磷脂之类的磷脂而使其带有负电荷，两者之间极易发生电荷作用，使抗菌肽产生杀灭细菌的生物学效应。但天然抗菌肽的抗菌活性相对较低，且容易水解，用于体内时稳定性差。其中人工合成的抗菌十肽KSL-W是根据天然抗菌肽的特性合成的具有较强抑菌性能的新型抗菌肽，其既具备天然抗菌肽广谱性和高效性的特点，还具有分子量小、成本低、组织毒性小、不易导致口腔菌群失调和不易产生耐药性的优点。
因此，如何将抗菌肽KSL-W与骨修复材料有效结合起来，并保持骨修复材料的活性是解决上述技术问题的关键，需要研发一种新型的骨修复材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构简单、有效维持抗菌肽KSL-W活性、具有良好的抗菌性能和成骨活性的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物，置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液，内水相KSL-W溶液的浓度为10mg/mL；
(1-3)将步骤(1-2)得到的KSL-W溶液注入步骤(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将步骤(1-3)得到的W/O初乳加入至PVA溶液混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，并用去离子水清洗，冷冻干燥后得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将步骤(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石在冰浴下共混，得到共混凝胶，其中，抗菌肽(KSL-W)PLGA微球、丝素蛋白、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石占最终骨修复材料的质量百分比为0.001％～3％、30％～60％、20％～40％和9.5％～30％；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将步骤(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将步骤(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中，根据设置的打印参数打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，控制接收装置的温度为-20℃～-4℃，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa。
在上述技术方案中，所述步骤(1-1)中称取的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5.0×104～30×104。
在上述技术方案中，所述步骤(1-4)中，磁力搅拌器的旋转速度为500-700rpm/s，旋转搅拌4h。
在上述技术方案中，所述步骤(1-4)中，冷冻干燥的冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa，时间为3-5h。
在上述技术方案中，所述步骤(2)中，在0℃冰浴下共混5-7h，得到共混凝胶。
在上述技术方案中，所述步骤(4)中的打印参数为：打印针头直径为260μm～600μm，针头行走间距为200μm～800μm。
在上述技术方案中，所述步骤(4)中的后处理方法具体步骤为：先使用无水乙醇浸泡固冷冻干燥后的复合凝胶，再用浓度为0.1～0.5％的氢氧化钠溶液浸泡，而后用去离子水将复合凝胶上残留的乙醇和氢氧化钠冲洗干净，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料。
本发明具有的优点和积极效果是：
1.抗菌肽(KSL-W)PLGA微球先将内部水相(W1)先分散在有机相中制备初乳，而后将初乳分散进入含亲水乳化剂的外水相(W2)中得到复乳，两步乳化操作简单制备得到抗菌肽(KSL-W)PLGA微球用来包裹亲水性药物，通过与丝素蛋白、胶原蛋白和羟基磷灰石混合形成共混凝胶，最大程度地保持生物活性，并配合低温3D打印方法制备出骨修复材料，使抗菌肽(KSL-W)PLGA微球兼具抗菌肽的生物活性，同时还具备良好的成骨生物活性。
2.本发明制备方法简单，可靠性强，成本较低，将抗菌肽缓释微球与3D打印有机结合起来，既可以制备出与缺损区形态一致的修复体，适应口内复杂的功能环境，又可以利用微球的药物缓释特点持续发挥杀菌作用，利于骨组织的愈合。
附图说明
图1是本发明中抗菌肽(KSL-W)PLGA微球的电镜照片；
图2是本发明中抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌的抑菌效果图，其中，图2A是第5天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌(E.faecalis)的抑菌效果的原始图像，图2B是去掉牛津杯后第5天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌(E.faecalis)的抑菌效果图，图2C是第10天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌(E.faecalis)的抑菌效果的原始图像，图2D是去掉牛津杯后第10天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌(E.faecalis)的抑菌效果图，图2E是第5天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌效果的原始图像，图2F是去掉牛津杯后第5天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌效果图，图2G是第10天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌效果的原始图像，图2H是去掉牛津杯后第10天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌效果图；
图3是本发明的含有抗菌肽的骨修复材料的外观图，图3A为冻干后的骨修复材料、图3B为交联后的骨修复材料；
图4是本发明的含有抗菌肽的骨修复材料被植于小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1上的增殖图(放大30倍)；
图5是本发明的含有抗菌肽的骨修复材料被植于小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1上的增殖图(放大400倍)；
图6是本发明的含有抗菌肽的骨修复材料在修复兔下颌骨缺损图，其中，图6A是未植入骨修复材料的一个月空白组的兔下颌骨缺损图；图6B是植入Bio-Oss骨粉一个月阳性对照组的兔下颌骨缺损图；图6C是植入骨修复材料的一个月实验组的兔下颌骨缺损图；图6D是未植入骨修复材料的两个月空白组的兔下颌骨缺损图；图6E是是植入Bio-Oss骨粉两个月阳性对照组的兔下颌骨缺损图；图6F是植入骨修复材料的两个月实验组的兔下颌骨缺损图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，决不限制本发明的保护范围。
下述实施例中，高速剪切机的品牌及型号广州仪卡，型号T10；抗菌肽的购买源是上海吉尔生化有限公司合成，纯度97％、PLGA的购买源是济南岱罡生物工程有限公司。
实施例1
一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球(采用复乳法制备)：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA(LA：GA(乳酸：羟基乙酸)＝75:25，分子量为5.0×104)置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液中，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液，内水相KSL-W溶液的浓度为10mg/mL；
(1-3)将(1-2)的KSL-W溶液注入(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将(1-3)的W/O初乳加入至PVA溶液(聚乙烯醇17-88，溶解在去离子水中形成PVA溶液)混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，旋转速度600rpm/s，旋转搅拌4h，并用去离子水清洗3次，冷冻干燥，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa，时间4h，制备得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液(丝素蛋白的水溶液，溶液浓度为8wt％)、胶原蛋白凝胶(凝胶浓度2wt％)、羟基磷灰石(四种组分占最终骨修复材料的质量百分比为0.01％、60％、30％和9.99％，在0℃下冰浴共混6h，得到共混凝胶；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备，对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中打印，打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，其中，设置打印参数：打印针头直径为410μm，针头行走间距为600μm，3D打印机底板的温度为-13℃，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa。
复乳法制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球，将内部水相(W1)先分散在有机相中制备初乳，而后将初乳分散进入含亲水乳化剂的外水相(W2)中得到复乳，两步乳化操作简单。
对实施例1中制备的骨修复材料进行性能测试：
通过实施例1中的方法制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球进行测试。
测试抑菌能力：
采用牛津杯法评价抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌(E.faecalis)和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌能力，具体方法如下：
(1)将-80℃条件下保存的粪肠球菌和牙龈卟啉单胞菌接种于哥伦比亚血平板中，在厌氧条件下倒置培养；
(2)挑取培养的实验菌株粪肠球菌接种于脑心浸液肉汤(BHI)，牙龈卟啉单胞菌接种于氯化血红色、维生素K的BHI液体培养基中，并在37℃下，培养16-18h；
(3)分别取(2)的两个培养基的细菌悬液200μL，涂布到哥伦比亚血板上，待培养皿中的水分彻底干燥后，在平皿上分散竖直放置3个8*6*10mm的牛津杯，而后使用移液枪向牛津杯中加入200μL 5天、10天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球缓释液，每组设立3个平行，观察抑菌环的大小。
如图2所示，在5天、10天的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球均对粪肠球菌和牙龈卟啉单胞菌有明显的抑菌效果，在牛津杯周围出现明显的抑菌环，在第5天的缓释液中，抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌的抑菌环直径为15.07mm，对牙龈卟啉单胞菌的抑菌环直径为14.87mm，在第10天的缓释液中，抗菌肽(KSL-W)PLGA微球对粪肠球菌的抑菌环直径为15.36mm，对牙龈卟啉单胞菌的抑菌环直径为15.16mm。
测试骨修复材料，具体方法如下：
将小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1细胞以2×104/mL的密度接种至支架(医用修复支架)上，2.5％戊二醛固定液(电镜专用)固定后梯度脱水(系列梯度酒精30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％)，临界点干燥(31℃、72.8个大气压的临界状态下干燥)，最后进行喷金，扫描电镜观察细胞形态。
如图4-5所示，通过扫描电镜显示出，胶原蛋白、丝素蛋白、纳米羟基磷灰石和抗菌肽(KSL-W)PLGA微球的3D支架材料具有不规则的孔径结构，孔与孔之间的交通性好，孔径在(523±42)μm。
从电镜照片中可以看出，抗菌肽(KSL-W)PLGA微球分散分布在支架材料内部或支架材料间隙及表面，MC3T3-E1细胞在支架表面黏附，细胞形态良好，可见伪足。
测试骨修复材料的修复能力，其中，所有实验程序均按照南开大学医学院动物伦理与试验委员会批准的规程进行。
实验所用的日本大耳兔购于天津裕达实验动物养植有限公司，许可证号为SCXK(津)2016-0001。
实验方法如下：
(1)使用10wt％的水合氯醛(3.5mL/kg)的腹腔注射对日本大耳白兔全身麻醉，兔子下颌骨通过电动去毛器去毛备皮，碘伏消毒术区，而后用75％的酒精脱碘；
(2)距离兔子下颌骨下缘2-3cm处做平行于下颌骨下缘2-3cm的水平切口，手术刀触及骨面，切开骨膜，而后依次钝性分离皮肤、皮下结缔组织层、肌肉及骨膜，暴露手术视野，用牙科打磨机制作5mm*5mm的正方形骨缺损，术中注意牵拉周围组织，防止肌肉或皮肤卷入涡轮机影响伤口愈合；
(3)将无菌的骨修复材料植入，对兔子的肌肉组织缝合一针，防止术后咬肌无力影响进食，而后将皮肤对位缝合，碘伏消毒，术后软食喂养一周，添加葡萄糖一周。
上述的所有日本大耳兔饲养环境相同。
其中，具体实验分组如下：
空白对照组：制备5mm*5mm的正方形骨缺损后，将20μL的粪肠球菌与牙龈卟啉单胞菌置于骨腔中，5min后吸出，而后缝合伤口。
实验组：制备5mm*5mm的正方形骨缺损后，将20μL的粪肠球菌与牙龈卟啉单胞菌置于骨腔中，5min后吸出，并将5mm*5mm的骨修复材料放置于骨腔中，并覆盖Bio-Gide膜。
阳性对照组(金标)：制备5mm*5mm的正方形骨缺损后，将20μL的粪肠球菌与牙龈卟啉单胞菌置于骨腔中，5min后吸出，将Bio-Oss骨粉填充至骨腔并覆盖Bio-Gide膜。
如图6A-F所示，两个月后对兔子下颌骨的拍摄照片。
实施例2
一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球(采用复乳法制备)：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA(LA：GA＝75:25，分子量为5.0×104)置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液中，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液，内水相KSL-W溶液的浓度为10mg/mL；
(1-3)将(1-2)的KSL-W溶液注入(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将(1-3)的W/O初乳加入至PVA溶液混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，旋转速度600rpm/s，旋转搅拌4h，并用去离子水清洗3次，冷冻干燥，冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa，时间6h，制备得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液(丝素蛋白的水溶液，溶液浓度为10wt％)、胶原蛋白凝胶(凝胶浓度3wt％)、羟基磷灰石(四种组分占最终骨修复材料的质量百分比为0.1％、55％、25％和19.9％)，在0℃下冰浴共混8h，得到共混凝胶；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备，对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中打印，打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，其中，设置打印参数：打印针头直径为260μm，针头行走间距为500μm，3D打印机底板的温度为-10℃，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa。
实施例3
一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球(采用复乳法制备)：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA(LA：GA＝75:25，分子量为5.0×104)置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液中，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液，内水相KSL-W溶液的浓度为10mg/mL；
(1-3)将(1-2)的KSL-W溶液注入(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将(1-3)的W/O初乳加入至PVA溶液混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，旋转速度600rpm/s，旋转搅拌4h，并用去离子水清洗3次，冷冻干燥，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa，后制备得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石(四种组分占最终骨修复材料的质量百分比为0.5％、60％、30％和9.5％)在0℃下冰浴共混7h，得到共混凝胶；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备，对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中打印，打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，其中，设置打印参数：打印针头直径为410μm，针头行走间距为600μm，接收装置的温度为-15℃，冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa。
实施例4
一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球(采用复乳法制备)：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA(LA：GA＝75:25，分子量为5.0×104)置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液中，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液，内水相KSL-W溶液的浓度为10mg/mL；
(1-3)将(1-2)的KSL-W溶液注入(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将(1-3)的W/O初乳加入至PVA溶液混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，旋转速度600rpm/s，旋转搅拌4h，并用去离子水清洗3次，冷冻干燥,冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa，时间4h，后制备得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石(四种组分占最终骨修复材料的质量百分比为0.1％、55％、25％和19.9％)在0℃下冰浴共混7h，得到共混凝胶；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备，对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中打印，打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，其中，设置打印参数：打印针头直径为410μm，针头行走间距为500μm，3D打印机底板的温度为-10℃，冷凝温度<-50℃，真空度<20Pa。
实施例5
一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球(采用复乳法制备)：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA(LA：GA＝75:25，分子量为5.0×104)置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液中，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液；
(1-3)将(1-2)的KSL-W溶液注入(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将(1-3)的W/O初乳加入至PVA溶液混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，旋转速度600rpm/s，旋转搅拌4h，并用去离子水清洗3次，冷冻干燥，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa，时间4h，制备得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石(四种组分占最终骨修复材料的质量百分比为0.5％、55％、25％和19.5％)在0℃下冰浴共混，得到共混凝胶；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备，对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中打印，打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，其中，设置打印参数：打印针头直径为410μm，针头行走间距为700μm，3D打印机底板的温度为-10℃，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备抗菌肽(KSL-W)PLGA微球：
(1-1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物，置于烧杯中，加入二氯甲烷溶液，得到PLGA溶液；
(1-2)将抗菌肽(KSL-W)溶解于去离子水中，得到KSL-W溶液，内水相KSL-W溶液的浓度为10mg/mL；
(1-3)将步骤(1-2)得到的KSL-W溶液注入步骤(1-1)中的PLGA溶液中得到混合溶液，将该混合溶液加入高速剪切机中乳化，得到W/O初乳；
(1-4)将步骤(1-3)得到的W/O初乳加入至PVA溶液混合，得到复乳混合液，将该复乳混合液加入高速剪切机中乳化得到W/O/W复乳，将该W/O/W复乳在室温条件下放置于磁力搅拌器中旋转蒸发去除W/O/W复乳中多余的二氯甲烷，并用去离子水清洗，冷冻干燥后得到冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球；
(2)制备共混凝胶：将步骤(1-4)得到的冻干的抗菌肽(KSL-W)PLGA微球与丝素蛋白溶液、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石在冰浴下共混，得到共混凝胶，其中，抗菌肽(KSL-W)PLGA微球、丝素蛋白、胶原蛋白凝胶、羟基磷灰石占最终骨修复材料的质量百分比为0.001％～3％、30％～60％、20％～40％和9.5％～30％；
(3)建立3D打印模型：通过CT扫描设备对人体需要进行修复的骨骼缺口部位进行三维扫描，并建立该缺口部位的骨骼组织结构的三维数据模型，将三维数据模型导入软件中转化为3D打印模型；
(4)将步骤(3)中的3D打印模型导入低温3D打印软件中，而后将步骤(2)得到的共混凝胶装入3D打印机的料筒中，根据设置的打印参数打印出冷冻复合凝胶，而后将冷冻复合凝胶再冷冻干燥进行后处理，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料，控制接收装置的温度为-20℃～-4℃，冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa。
2.根据权利要求1所述的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1-1)中称取的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5.0×104～30×104。
3.根据权利要求1所述的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1-4)中，磁力搅拌器的旋转速度为500-700rpm/s，旋转搅拌4h。
4.根据权利要求1所述的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1-4)中，冷冻干燥的冷凝温度<-50℃，真空度<10Pa，时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，在0℃冰浴下共混5-7h，得到共混凝胶。
6.根据权利要求1所述的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的打印参数为：打印针头直径为260μm～600μm，针头行走间距为200μm～800μm。
7.根据权利要求1所述的含有抗菌肽的骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的后处理方法具体步骤为：先使用无水乙醇浸泡固冷冻干燥后的复合凝胶，再用浓度为0.1～0.5％的氢氧化钠溶液浸泡，而后用去离子水将复合凝胶上残留的乙醇和氢氧化钠冲洗干净，最终得到含有抗菌肽的骨修复材料。
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