CN114425101B - 一种微纳米双层结构抗菌支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微纳米双层结构抗菌支架及其制备方法和应用,属于口腔医用制品技术领域。本发明提供的微纳米双层结构抗菌支架的制备方法,包括如下步骤:(1)将聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物混合,加入有机溶剂溶解,得到聚羟基脂肪酸酯溶液;(2)将聚羟基脂肪酸酯溶液倒入模具中,将装有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具浸入所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂中,进行溶液置换,得到半固体支架;(3)所述半固体支架经冷冻干燥后,得到微纳米双层结构抗菌支架。本发明提供的微纳米双层结构抗菌支架具有良好的细胞相容性和抗菌性,能有效促进牙龈成纤维细胞的粘附增殖并减少伤口的细菌感染。
Description
技术领域
本发明涉及口腔医用制品技术领域,尤其涉及一种微纳米双层结构抗菌支架及其制备方法和应用。
背景技术
软组织增量是种植手术和义齿修复前的标准步骤,由Friedman在1957年提出的膜龈手术中实现。该手术可维持足量的角化龈或附着龈组织,防止牙龈附着的进一步丧失。自体组织在牙龈宽度、厚度、美学和长期稳定性方面是传统软组织增量手术的金标准。但使用自体组织需要开辟第二术区,供区可用软组织量较为有限,移植瓣易收缩与受区不匹配、并发症(如疼痛、出血、肿胀等)发生率高,因此软组织增量技术最大的挑战之一仍是开发牙龈组织替代物。
理想的牙龈组织替代物应具有良好的生物相容性、抗菌性、机械稳定性、操作简便性、生物降解同步性等特点,以实现组织再生。遗憾的是,目前还没有商品化的软组织工程产品能够完美地应用于口腔软组织。
生物膜制品如胶原蛋白基质虽然具有很高的生物相容性,但机械强度低,降解速率难以控制,结构易崩塌,具有引起严重免疫原性和炎症的风险,其成分作为口腔细菌的营养物质也可能引发伤口感染。而合成聚合物膜力学性能更为优异,但生物相容性较低,膜体常引起机体排异反应,影响软组织再生的速度,修复效果也不理想。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是由微生物合成的一种生物材料,在生物体内主要是作为碳源和能源的储存物质而存在,具有类似合成高分子材料的物化特性及合成高分子材料所不具备的生物可降解性、生物相容性等优秀性能。与聚乳酸(Polylactic acid,PLA)或聚乳酸-羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)相比,PHA的主要降解产物3HB(3-羟基丁酸酯),其pH值更接近7,更中性,在长期植入方面表现更好。已有大量研究发现PHA制备的组织工程支架在骨、软骨、心脏瓣膜、血管、神经等组织或器官修复方面取得了良好的效果。但聚羟基脂肪酸酯作为一种微生物合成的生物材料,易掺杂产PHA革兰阴性菌的细胞壁特殊结构内毒素,对人体细胞具有毒性作用。传统抗菌药物的使用也存在许多问题:如耐药性、低稳定性、低口服生物利用度和较差的药物靶向性等等。因此,制备一种功能理想、结构独特的支架材料用于牙龈组织再生仍然是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明提供了一种微纳米双层结构抗菌支架及其制备方法和应用,解决了现有软组织再生技术中生物制品膜易发生细菌感染、机械强度低,聚合物膜生物相容性低、易引发机体排异反应,传统抗菌药物稳定性差、口服生物利用度低、药物靶向性较差的技术问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种微纳米双层结构抗菌支架的制备方法,包括如下步骤:
(1)将聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物混合,加入有机溶剂溶解,得到聚羟基脂肪酸酯溶液;
(2)将聚羟基脂肪酸酯溶液倒入模具中,将装有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具浸入所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂中,进行溶液置换,得到半固体支架;
(3)所述半固体支架经冷冻干燥后,得到微纳米双层结构抗菌支架。
优选的,所述聚羟基脂肪酸酯材料是经过脱毒和提纯后的材料;所述聚羟基脂肪酸酯材料包括聚-β-羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸)、聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸己酸共聚酯、聚羟基丁酸十一酸共聚酯和聚羟基癸酸十二酸共聚酯中的一种或几种。
优选的,所述纳米抗菌药物包括纳米银、纳米二氧化硅、纳米氧化锌、纳米钴、纳米硒和纳米镉中的一种或几种。
优选的,所述有机溶剂包括氯仿、二氯甲烷和四氢呋喃中的一种或几种;所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂包括无水乙醇、无水甲醇和丙酮中的一种或几种。
优选的,所述聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物的质量比为10:0.25~2。
优选的,步骤(2)中所述溶液置换的时间为5~8h。
本发明还提供了一种由上述制备方法得到的微纳米双层结构抗菌支架。
优选的,所述微纳米双层结构抗菌支架包括微米孔结构层和纳米孔结构层;所述纳米抗菌药物被修饰在微米孔结构层中。
优选的,所述微米孔结构层中微米孔的孔径为1~10μm;所述纳米孔结构层中纳米孔的孔径为200~800nm;所述微米孔结构层与纳米孔结构层的厚度比为6~8:1~3。
本发明还提供了一种所述的微纳米双层结构抗菌支架作为制备口腔软组织修复材料或药物中的应用。
本发明提供的微纳米双层结构抗菌支架,由修饰有纳米抗菌药物的微米孔结构层和纳米孔结构层构成。其中,微米孔结构层为三维贯通“大”孔结构,孔径在1~10μm之间,孔隙率为60%~90%,其上修饰有抗菌药物的纳米颗粒,并在其表面均匀分布,用于引导软组织再生并在复杂口腔环境中抵抗多种细菌对伤口的侵袭。纳米孔结构层为相对致密的“小”孔结构,孔径在200~800nm之间,起机械屏障作用避免软组织长入硬组织(骨组织),同时允许营养物质的交换流通。本发明提供的微纳米双层结构抗菌支架具有良好的细胞相容性和抗菌性,能有效促进牙龈成纤维细胞的粘附增殖并减少伤口的细菌感染,显示出其在口腔软组织再生工程中的巨大潜力。
本发明提供的微纳米双层结构抗菌支架能用于软组织大面积缺损的快速修补,同时保护软组织缺损面,并允许暴露使用,大大增加了使用范围。适合作为增加天然牙、修复体或种植牙周围的角化龈或附着龈组织时的填充材料。例如,在延期种植的拔牙窝封闭时使用(拔除符合拔牙指征并有种植需求的牙齿后,拔牙窝内充填骨粉,使用本发明的抗菌支架封闭拔牙窝)、在复杂修复术前进行附着龈增宽(长期牙列缺损易导致肌肉纤维及韧带牵拉长入,附着龈变窄,移除肌肉、瘢痕纤维韧带后,修剪并放置本发明的抗菌支架,固定,待血管、软组织长入)等等。
附图说明
图1为实施例1的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架的微米孔结构层的扫描电镜结构图,比例尺5μm,放大倍数5000倍;
图2为实施例1的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架的纳米孔结构层的扫描电镜结构图,比例尺5μm,放大倍数5000倍;
图3a~d为实施例1的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架的X射线能谱分析图,比例尺为2.5μm,其中,图3a为抗菌支架上碳、氧、锌三种元素的微观分布图,图3b为碳元素在抗菌材料上的微观分布图,图3c为氧元素在抗菌材料上的微观分布图,图3d为锌元素在抗菌材料上的微观分布图;
图4为实施例2中人牙龈成纤维细胞在不同抗菌支架上培养1、4、7d的细胞增殖情况;
图5为实施例2中人牙龈成纤维细胞在不同抗菌支架上培养24小时的细胞形貌图,其中,细胞核被DAPI染成蓝色,细胞骨架被罗丹明-鬼笔环肽染成红色;
图6为实施例3中抗菌支架植入大鼠上腭软组织缺损处1周的形态学观察。
具体实施方式
本发明提供了一种微纳米双层结构抗菌支架的制备方法,包括如下步骤:
(1)将聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物混合,加入有机溶剂溶解,得到聚羟基脂肪酸酯溶液;
(2)将聚羟基脂肪酸酯溶液倒入模具中,将装有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具浸入所述有机溶剂的不良溶剂中,进行溶液置换,得到半固体支架;
(3)所述半固体支架经冷冻干燥后,得到微纳米双层结构抗菌支架。
本发明在制备微纳米双层结构抗菌支架之前,先对聚羟基脂肪酸酯材料进行了脱毒和提纯。
在本发明中,所述脱毒优选采用索氏提取仪抽提去除聚羟基脂肪酸酯原料中的内毒素。在此过程中,聚羟基脂肪酸酯材料的损耗率为40%。即脱毒100份的聚羟基脂肪酸酯材料能够得到60份脱毒后的聚羟基脂肪酸酯材料。
在本发明中,所述提纯优选采用如下方法进行:
(1)将脱毒后的聚羟基脂肪酸酯材料加入氯仿溶解,用双层纱布过滤掉不溶杂质,得到滤液;
(2)在滤液中加入无水乙醇进行提纯,分离析出的固体,即得到纯化的聚羟基脂肪酸酯材料。
在本发明中,所述脱毒后的聚羟基脂肪酸酯材料与氯仿的质量体积比优选为1g:5~15ml,进一步优选为1g:8~12ml,再进一步优选为1g:10ml。
在本发明中,所述加入的无水乙醇的量,优选按照氯仿与无水乙醇的体积比1:6~10加入,进一步优选为按照体积比1:8加入。
在本发明中,所述提纯的时间优选为20~40min,进一步优选为30min。
在本发明中,所述分离析出的固体的方法优选采用离心分离。
在本发明中,所述离心分离的转速优选为5000~10000rpm,进一步优选为6000~9000rpm,再进一步优选为8000rpm。
在本发明中,所述离心分离的时间优选为10~15min,进一步优选为12min。
制备得到聚羟基脂肪酸酯材料后,本发明将聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物混合,用有机溶剂溶解,得到聚羟基脂肪酸酯溶液。
在本发明中,所述聚羟基脂肪酸酯材料优选包括聚-β-羟基丁酸酯(PHB)、聚(3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸)(P34HB)、聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)、聚羟基丁酸己酸共聚酯(PHBHHx)、聚羟基丁酸十一酸共聚酯和聚羟基癸酸十二酸共聚酯中的一种或几种,进一步优选为聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P34HB)。
在本发明中,所述纳米抗菌药物优选包括纳米银、纳米二氧化硅、纳米氧化锌、纳米钴、纳米硒和纳米镉中的一种或几种,进一步优选为纳米氧化锌。
在本发明中,所述聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物的质量比优选为10:0.25~2,进一步优选为10:0.5~1.5,再进一步优选为10:1。
在本发明中,所述有机溶剂优选包氯仿、二氯甲烷和四氢呋喃中的一种或几种,进一步优选为氯仿。
在本发明中,将聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物加入有机溶剂中后,优选将其放入超声清洗仪中进行超声混匀。使纳米抗菌药物能够均匀的分布到有机溶剂中。
在本发明中,所述超声清洗仪的功率为30~50kHz,进一步优选为40kHz。
在本发明中,所述超声的时间优选为5~15min,进一步优选为10min。
制备得到聚羟基脂肪酸酯溶液后,将聚羟基脂肪酸酯溶液倒入模具中,将装有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具浸入所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂中,进行溶液置换,得到半固体支架。
在本发明中,将聚羟基脂肪酸酯溶液倒入模具时,使聚羟基脂肪酸酯溶液充满模具。
在本发明中,所述模具优选为Corning小玻璃皿。
在本发明中,所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂优选包括无水乙醇、无水甲醇和丙酮中的一种或几种,进一步优选为无水乙醇。
本发明所述的不良溶剂是相对于良性溶剂而言的,所谓良性溶剂是指对某一物质溶解性好的溶剂。因此,本发明中的不良溶剂是指对聚羟基脂肪酸酯材料溶解性较差的溶剂。
在本发明中,在用不良溶剂浸润聚羟基脂肪酸酯溶液时,需要将不良溶剂倒入一个较大的容器中,优选为500ml的玻璃皿(125mm×65mm),使盛有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具完全被不良溶剂没过。需要注意的是,浸润时必须使不良溶剂完全浸没盛有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具,且在放入模具时,需要缓慢放入,避免对模具中的聚羟基脂肪酸酯溶液产生扰动,破坏其溶液组成和结构。放入后即开始进行溶液置换。氯仿溶液会慢慢被乙醇置换,留下聚羟基脂肪酸酯材料,从而形成多孔结构。并且由于聚羟基脂肪酸酯溶液是盛装在模具中,模具是Corning小玻璃皿的形状,下部密封、上部开口,因此在溶液置换的过程中,会形成微孔结构不同的微纳米双层结构,微米孔结构层形成于模具的上部开口处,纳米孔结构层形成为下部密封处。又因为,微米孔结构层在溶液置换时位于上部的开口处,因为氯仿置换的速度快、置换量大,导致置换后的微孔较大,就形成了微米孔结构层,微孔的孔径为1~10μm,孔隙度能够达到60~90%。
在本发明中,所述溶液置换的时间优选为5~8h,进一步优选为6h。随着溶液置换的进行,能够用肉眼观察到澄清透明的聚羟基脂肪酸酯溶液逐渐变成白色的半固体支架。
在本发明中,在进行溶液置换时,优选在不良溶剂器皿的表面盖上一层铝箔纸,避免溶液被污染和过度蒸发。
溶液置换结束后,将所述半固体支架经冷冻干燥后,得到微纳米双层结构抗菌支架。
在本发明中,在冷冻干燥之前,先进行预冻。
在本发明中,所述预冻的温度优选为-120~-60℃,进一步优选为-100℃~-70℃,再进一步优选为-80℃。
在本发明中,所述预冻的时间优选为15~45min,进一步优选为20~40min,再进一步优选为30min。
在本发明中,所述冷冻干燥优选在冷冻干燥机中进行。
在本发明中,所述冷冻干燥时,设定样品的温度为20~25℃,优选为23℃;冷肼温度优选为-60℃~-40℃,进一步优选为-50℃;真空度优选为50~1000pa,进一步优选为200~800pa,再进一步优选为600pa;冷冻干燥的时间优选为8~16h,进一步优选为10~14h,再进一步优选为12h。
在本发明中,预冷和冷冻干燥处理一方面通过升华能够除去支架中的乙醇,消除乙醇对软组织细胞的毒害作用,另一方面有利于稳定微米孔和纳米孔的结构。
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的微纳米双层结构抗菌支架。
在本发明中,所述微纳米双层结构抗菌支架优选包括微米孔结构层和纳米孔结构层。
在本发明中,所述纳米抗菌药物优选被修饰在微米孔结构层中。所述微米孔结构层上的多孔结构增加了释放表面,并对纳米抗菌药物的释放速度起调控作用,同时随着膜体的降解纳米抗菌药物会不断释放,有利于在复杂口腔环境中抵抗细菌对伤口的侵袭。
在本发明中,所述微米孔结构层中微米孔的孔径范围优选在1~10μm之间;所述纳米孔结构层中的纳米孔的孔径范围优选在200~800nm之间。
在本发明中,所述微米孔结构层与纳米孔结构层的厚度比优选为6~8:1~3,进一步优选为7:3。
本发明还提供了一种所述的微纳米双层结构抗菌支架作为制备口腔软组织修复材料或药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例所用PHA材料为聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P34HB),购自北京微构工场生物技术有限公司。所用纳米抗菌药物为纳米氧化锌颗粒(直径在40nm~100nm之间),购自北京中金研新材料科技有限公司。
将50g P34HB原材料经索氏提取仪抽提去除内毒素。提取过程如下:(1)打开循环水开关;(2)设定程序:使用氯仿浸提、淋洗的温度均为140℃,时间分别是3h和2h,淋洗后氯仿挥发时间1h,等待材料温度降至40℃,取出提取筒,完全挥发溶剂得到P34HB粗提材料30g,损耗率为40%。在30gP34HB粗提材料中加入300ml氯仿,旋转溶解,将溶解液经双层纱布过滤,过滤掉不溶杂质。在滤液中再加入2400ml无水乙醇,旋转半小时至P34HB材料完全析出,然后在10,000rpm下离心10min,分离得到P34HB材料,将P34HB材料置于室温(25℃)下干燥24h,备用。
称取P34HB材料0.5g与0.05g纳米氧化锌颗粒混合溶于10ml氯仿(氧化锌在氯仿中的质量体积比例为0.5%),震荡溶解15min,然后置于超声清洗仪中超声混匀10min,频率为40kHz,使氧化锌粉末均匀分布在氯仿中,得到P34HB溶液。将P34HB溶液倒入底部超平的Corning小玻璃皿(底部直径为100mm),高度约1.0mm,在室温(25℃)下静置5min。以无水乙醇作为P34HB的不良溶剂,取500ml倒入玻璃皿(125mm×65mm)中。将静置完毕的盛有P34HB溶液的Corning小玻璃皿整体浸入无水乙醇中,使无水乙醇完全没过皿体,开始进行溶液置换。需要注意的是,放入时需要缓慢放入,避免对模具中的P34HB溶液产生扰动,破坏其溶液组成和结构。溶液置换时,在大玻璃皿上覆盖上一层铝箔纸,避免溶剂被污染和乙醇的过度蒸发。溶液置换6h后,可以通过肉眼观察到澄清透明的P34HB溶液逐渐转变为白色完整的柔软半固体。此时取出Corning小玻璃皿,盖上盖子,放入-80℃冰箱中预冻30min,后放入冷冻干燥机中干燥,设定样品温度为室温(25℃),冷阱温度为-50℃,真空度为100Pa,时间为12h。即制备得到本发明的微纳米双层结构抗菌支架(P34HB+0.5%ZnO)。
利用扫描电镜对本实施例制备的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架进行扫描,扫描结果如图1、图2所示。其中图1展示的是微米孔结构层,图2展示的是纳米孔结构层。从图1、图2中能够看出,本实施例制备得到的抗菌支架,具有双层结构,且双层结构上的孔径大小、结构不同,纳米孔结构层的孔径结构更为致密,孔径在200~800nm之间,而微米孔结构层的孔径在1~10μm之间,孔隙度能够达到60~90%。
对本实施例制备的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架进行X射线能谱分析,结果如图3a、图3b、图3c、图3d所示。能谱分析图中显示了碳(红)、氧(绿)、锌(蓝)三种元素在材料上的微观分布,其中氧(绿)和锌(蓝)的元素分布基本重合成青色,说明纳米氧化锌颗粒被成功修饰到了P34HB支架上。
实施例2
人牙龈成纤维细胞在不同支架上的细胞增殖实验
在无菌环境中将实施例1制备的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架按照96孔板的孔径大小,裁剪成合适的圆形并置于96孔板中,放置抗菌支架时微米孔结构层朝上与细胞接触,然后接种人牙龈成纤维细胞,5000个/孔,在含有10%胎牛血清(Gibco,美国)和1%青霉素/链霉素(Gibco,美国)的DMEM培养基、37℃和5%CO2孵箱中孵育1、4、7天。并以实施例1提纯的P34HB材料作为空白,以HealAll胶原膜(正海生物,中国)和按照实施例1的方法制备的纳米氧化锌浓度为1%的抗菌支架(P34HB+1%ZnO)为对照,进行实验。每个处理设置3个复孔,并重复三次。
在培养到第1、4、7天时,将4个处理组的支架用PBS轻轻冲洗3次,然后在100μL的DMEM培养基中加入10μL的CCK-8溶液(Dojindo,日本),37℃黑暗条件下孵育2小时。将共培养液转移到新96孔板中,每孔100μL。然后使用酶标仪(Multiskan FC,Thermofisher,美国)在450nm波长处读取混合溶液的吸光度值,结果如图4所示。
从图4可以看出,培养至第4天时,P34HB+0.5%ZnO抗菌支架和P34HB支架、胶原膜的吸光度值均显著高于P34HB+1%ZnO抗菌支架,表明这三种支架的细胞相比于P34HB+1%ZnO抗菌支架更有利于人牙龈成纤维细胞的增殖;到第7天时,P34HB+0.5%ZnO抗菌支架的吸光度值达到最高,并显著高于P34HB支架、胶原膜和P34HB+1%ZnO抗菌支架,表明在增殖后期,P34HB+0.5%ZnO抗菌支架具有最佳的人牙龈成纤维细胞的细胞相容性,有利于细胞的增殖,其中P34HB+0.5%ZnO抗菌支架的细胞增殖率高于P34HB支架,主要原因在于适量浓度的ZnO纳米颗粒除具有杀菌作用外,还具有促成纤维细胞生长的作用,与支架的多孔结构一起对细胞生长起协同促进作用。
人牙龈成纤维细胞在不同支架上的粘附形态实验
在无菌环境中将实施例1制备的P34HB+0.5%ZnO抗菌支架按照48孔板的孔径大小,裁剪成合适的圆形并置于48孔板中,放置抗菌支架时微米孔结构层朝上与细胞接触,然后接种人牙龈成纤维细胞,1×104个/孔,在含有10%胎牛血清(Gibco,美国)和1%青霉素/链霉素(Gibco,美国)的DMEM培养基、37℃和5%CO2孵箱中培养24h。并以实施例1提纯的P34HB材料作为空白,以HealAll胶原膜(正海生物,中国)和按照实施例1的方法制备的纳米氧化锌浓度为1%的抗菌支架(P34HB+1%ZnO)为对照,进行实验。每个处理设置3个复孔,并重复三次。
培养24h结束后,将4个处理组的支架用PBS轻轻冲洗3次,然后用4%多聚甲醛在4℃下固定30min。荧光染色时,细胞先用0.3%Triton X-100渗透5min,用PBS洗涤三次后,与罗丹明-鬼笔环肽(Yeason,中国)室温共孵育30min,对细胞骨架进行染色(红色)。最后,再用DAPI(Invitrogen,美国)染色5min,对细胞核进行染色(蓝色),然后在激光共聚焦显微镜下观察,观察结果如图5所示。
从图5中可以看出,在P34HB+0.5%ZnO抗菌支架和胶原膜上培养的人牙龈成纤维细胞的细胞骨架染色明显,肌动蛋白丝充分伸展,细胞间有伪足接触,人牙龈成纤维细胞生长状态良好,表明P34HB+0.5%ZnO抗菌支架具有较好的生物相容性,有利于细胞的粘附。而在P34HB支架上培养的部分人牙龈成纤维细胞肌动蛋白丝伸展欠佳,细胞间伪足减少,P34HB+1%ZnO抗菌支架上培养的人牙龈成纤维细胞多为短梭形,未能形成胞质饱满的长梭形,表明P34HB支架、P34HB+1%ZnO抗菌支架对细胞的粘附力低于P34HB+0.5%ZnO抗菌支架,而P34HB+1%ZnO抗菌支架细胞生长状态不良的原因主要是纳米氧化锌的添加量过多,释放的活性氧超过了细胞的抗氧化能力,破坏了细胞的细胞膜、线粒体及DNA,致使细胞活性受损影响粘附甚至死亡。
本实施例所用人牙龈成纤维细胞取自接受第三磨牙拔除术的健康患者术中产生的多余牙龈,细胞提取的实验方案经北京大学口腔医院生物医学伦理委员会批准(伦理批准号:PKUSSIRB-202058148)。
实施例3
选择25只健康雄性Wistar大鼠(250~300g,9~11周)进行植入实验,口内黏膜无炎症及其他病理表现,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
将25只大鼠随机平均分为5组,分别在缺损部位植入P34HB支架、P34HB+0.5%ZnO抗菌支架、HealAll胶原膜(正海生物,中国)、Mucograft胶原膜(Geistlish,瑞士),并设置空白对照(Blank)。
植入前麻醉大鼠,用11号手术刀片在每只大鼠上腭粘膜中央创建5.0×1.5mm2,1.0mm深的全厚度腭粘膜缺损伤口,暴露骨组织,然后用外科无菌剪刀将各支架材料裁剪成合适的大小和形状,植入伤口处。植入时,纳米孔结构层贴近缺损伤口底层,与伤口下方的骨组织相贴,隔离缺损的软组织和下方的骨组织,微米孔结构层与缺损的软组织相接,表面暴露于口腔中,无需拉拢缝合。植入后第一天,每处理组在口内(缺损处及其周围)涂抹变异链球菌、牙龈卟琳单胞菌和具核梭杆菌(每种细菌浓度调整至109/ml后混合),连续涂抹3天。所有大鼠在术后进食标准食物(按照美国NIH-41标准生产,粗蛋白≥18%、粗脂肪≥5%、粗纤维≤5%、粗灰分≤8%),并将棒状饲料用破壁机打碎后让大鼠自由进食,并自由饮水。在腭部伤口形成后7天(1周)后对大鼠实施安乐死,取出植入的支架,观察伤口愈合情况。结果如图6所示。
从图6中可以看出,P34HB+0.5%ZnO抗菌支架的愈合情况最好,且没有受到细菌的感染;但Blank组、P34HB支架组、Heal All胶原膜组和Mucograft胶原膜组伤口红肿,甚至出现化脓现象,表明存在细菌感染,且伤口愈合情况较差。
本实施例在动物身上实施的方案经北京大学生物医学伦理委员会批准(伦理批准号:2020471)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种微纳米双层结构抗菌支架的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物混合,加入有机溶剂溶解,得到聚羟基脂肪酸酯溶液;
(2)将聚羟基脂肪酸酯溶液倒入模具中,将装有聚羟基脂肪酸酯溶液的模具浸入所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂中,进行溶液置换,得到半固体支架;
(3)所述半固体支架经冷冻干燥后,得到微纳米双层结构抗菌支架。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述聚羟基脂肪酸酯材料是经过脱毒和提纯后的材料;所述聚羟基脂肪酸酯材料包括聚-β-羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸)、聚羟基丁酸戊酸共聚酯、聚羟基丁酸己酸共聚酯、聚羟基丁酸十一酸共聚酯和聚羟基癸酸十二酸共聚酯中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述纳米抗菌药物包括纳米银、纳米二氧化硅、纳米氧化锌、纳米钴、纳米硒和纳米镉中的一种或几种。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂包括氯仿、二氯甲烷和四氢呋喃中的一种或几种;所述聚羟基脂肪酸酯材料的不良溶剂包括无水乙醇、无水甲醇和丙酮中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述聚羟基脂肪酸酯材料与纳米抗菌药物的质量比为10:0.25~2。
6.如权利要求1~5任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述溶液置换的时间为5~8h。
7.一种由权利要求1~6任一项所述的制备方法得到的微纳米双层结构抗菌支架。
8.如权利要求7所述的微纳米双层结构抗菌支架,其特征在于,所述微纳米双层结构抗菌支架包括微米孔结构层和纳米孔结构层;所述纳米抗菌药物被修饰在微米孔结构层中。
9.如权利要求8所述的微纳米双层结构抗菌支架,其特征在于,所述微米孔结构层中微米孔的孔径为1~10μm;所述纳米孔结构层中纳米孔的孔径为200~800nm;所述微米孔结构层与纳米孔结构层的厚度比为6~8:1~3。
10.一种权利要求7~9任一项所述的微纳米双层结构抗菌支架作为制备口腔软组织修复材料或药物中的应用。
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