JP5478885B2 - 組織の再構築のために特に有用な、生体適合性で且つ生分解性の多孔質マトリックス - Google Patents

Description

発明の背景

本発明は、物質を喪失した後の被覆組織を再構築する分野、または生体活性な包帯材の分野に関する。

本発明は特に、結合組織の足場を調製するために有用な、生体適合性で且つ生分解性の新規な多孔質マトリックス、並びに前記足場に関する。本発明は更に、内皮細胞および／または繊維が細胞に付随した、前記多孔質マトリックスまたは前記結合組織の足場を含んでなる間充織代替物、および被覆組織代替物、それらの調製方法、並びにそれらの使用に関する。

一般に、物質の喪失を伴う組織再構築の分野においては、骨、軟骨、並びに特に表皮を含む被覆組織の再構築に関連して、最も大きな進歩がなされた。

従って、表皮の再構築は、例えば、重症の火傷患者で見られるような物質の大きな喪失を治療するために、また慢性の創傷および潰瘍に見られるような物質の局部的喪失を治療するために適用される。一般に、外皮（特に皮膚外皮）の再構築はまた、生体活性な包帯材の適用をも含んでおり、その目的は治癒の促進である。

皮膚代替物に関して、第二次世界大戦の値に開発された最初の解決策は、異種組織を移植することからなっている。最初の段階では、ブタ異種移植片、次いで死体同種移植片を用いて患者は生存を維持された。しかし、顕著な数の拒否反応、並びに免疫学における知識の登場に直面して、研究者は自家組織の使用に転換し始め、その最初の技術は自家移植であった。それ以来、この技術は皮膚潰瘍、並びに第二度および第三度の火傷を治療するための修復外科サービスにおいて広く使用されている。

自家移植は、皮膚表皮の健康な皮膚断片を採取し、それらを外科医が調製した創傷（移植床）上に堆積することからなっている。この自家移植技術は、移植片取得が迅速なので、極めて興味深いものである。しかし、自家移植片の表面を一定の比率で増大させる方法が知られていたとしても、創傷の拡大に応じて充分な量の健康な皮膚が常に採取できる訳ではないので、この自家移植技術は制限される。

上皮再構築は、自家移植の後に開発された技術である。

インビトロで増殖された最初の上皮シートは、１９７５年にＲｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎによって得られた（Ｃｅｌｌ ６：３３１−３４３．ヒトケラチン細胞株の連続培養：単一細胞からのケラチン化コロニーの形成）。このタイプの自家上皮シート（Ｅｐｉｃｅｌ；登録商標）は、重症の火傷の人のための殆どのサービスにおいて使用され、重要な予後が関与する患者を治療することを可能にしている。この技術は、患者から採取した自家ケラチン細胞を、照射された繊維芽細胞の栄養層の存在下で増殖させることからなっている。

この技術の欠点は、当該シートをその培養支持体から取り外すことに集約される。実際、当該シートの収縮および変質の原因であるプロティナーゼ（特にジスパーゼ）を用いて、酵素的処理を使用することが必要である。これらの変化は、移植片採取において有害な役割を果たす。

これらの技術および利点は、特に火傷のヒトのための治療における顕著な進歩を表し、または表すであろうが、筋膜上に直接静置された上皮シートから得られる瘢痕は不完全である。実際に、上皮は萎縮性で、且つ移植された皮膚の持続的な脆弱性が認められ、従って品質が不十分である。真皮の欠損は、皮膚の再構築、およびこの新たな皮膚の機械的性質にとって極めて有害であることが示されている。

移植床上の真皮の欠損に起因する皮膚の脆弱さを克服するための解決策は、創傷の洗浄後の全血喪失容積および感染のリスクを制限しながら、表皮の機械的支持を提供するための均等な真皮を作製することであるように思える。この観点において、三つの等価な真皮が開発された［インテグラ（integra；登録商標）、ダーマグラフト（Dermagraft；登録商標）およびトランスサイト（Transcyte；登録商標）］。

・インテグラ（インテグラ・ライフサイエンス・テクノロジー社）。創傷を覆うためのこのシステムは、二つの非細胞層からなっている：即ち、表皮に似せた第一の表面層はシリコーン膜からなり、真皮に似せた第二の深い層は、ウシ腱コラーゲンおよびサメのグリコサミノグリカンからなっている。この代替真皮は、周囲組織の繊維芽細胞がコロニーを形成することを目的とした真皮多孔質マトリックスを形成する。該マトリックスのコロニー形成の後（２１日間）、前記薄いシリコン層を除去し、次いで培養された真皮で置換する。

・ダーマグラフト（スミス＆ネフュー）。これは、アロジェニックな繊維芽細胞を含有するビクリル（vicryl）再吸収性ネット（ポリグラクチン９１０）である。この代替物は凍結状態で販売され、如何なる時点でも創傷上において使用されてよい。それは、アロジェニックな繊維芽細胞の存在にもかかわらず拒絶されない。この均等な真皮は、特に皮膚潰瘍の治療に使用される。加水分解で分解可能な足場の存在は、水の存在のみがその分解のために必要とされ、従って生物の如何なる介入も意味しない。しかし、この分解は、多かれ少なかれケラチン細胞増殖に対して有害な分解生成物、特にグリコール酸の放出の起源であるかもしれない。

・トランスサイト（アドバンスト・ティッシュ・サイエンス）は、その上にアロジェニックな真皮繊維芽細胞が成長する、ナイロン（ポリアミド）ネットワークで形成された真皮代替物である。このネットワークは、ブタＩ型コラーゲン層で被覆され、次いで合成表皮の役割を果すシリコーン膜で覆われる。

これら三つの真皮代替物は、移植および治癒の結果を改善する。しかし、ダーマグラフトおよびトランスサイトに含まれるアロジェニックな繊維芽細胞の存在は、機能的な新たな真皮の再出現を促進することに留意すべきである。従って、（迅速な新合成に起因して）インビボでのそれに近似した機械的特性を再度見出すことが可能である。

従って、これらの技術は移植を促進するが、これらの均等な真皮上で培養表皮を移植することが必要である。表皮および真皮は別々に増殖するので、真皮／表皮接合がなく、治癒の間にのみ形成される。この結果は、表皮の除去に対する抵抗がより少なく、且つこの被覆組織代替物の粘着がないことである。

それに関して、アプリグラフト（Apligraft；登録商標）製品（ノバルチス社）は真皮−表皮複合体のように見え、これはアロジェニックな繊維芽細胞を含んだウシＩ型コラーゲン真皮、インビトロ成長された表皮、および真皮−表皮接合を有する。この被覆組織代替物は、真皮−表皮接合を介して結合された二つの層の組成において皮膚に同化される可能性があるが、二つの大きな欠点を有しており、これはヨーロッパでの市販を拒否するための根拠を有する。

・外来コラーゲンの存在は宿主の反応を誘起し、その目的はこれらコラーゲン繊維を破壊して、その後、皮膚の張力方向に配向した新たな繊維を合成することである。

・アロジェニック細胞（繊維芽細胞およびケラチン細胞）の存在は、特にケラチン細胞について、レシピエント器官からの拒絶反応を生じる危険がある。しかし、これらアロジェニック細胞を使用することによって、培養時間が低減され、また該皮膚代替物は調製された移植床上に移植され得る。

上記で想起された技術を検討することから、今日までに提案された材料が三つのグループに分類されることに気付く。即ち、天然起源の材料、半人工的材料、および人工的材料である。天然起源の材料には、コラーゲン、アルギン酸、グリコサミノグリカン、ヒドロキシアパタイトまたはフィブリンのような非細胞性マトリックスが含まれる。人工材料は殆ど、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、ポリホスファゼン、および多くのヒドロゲルのような、人工ポリマー由来の材料を含む。半人工材料は、天然起源および人工起源の材料の組合せである。

最後に、外皮、特に物質喪失後の皮膚外皮を再構築するために人工材料を適用する最近提案された解決策のうちで、El-Ghalbzouri A, Lamme En, van Blitteswijk C, Koopman J, Ponec M. "The use of PEGT/PBT as dermal scaffold for skin tissue engineering", Biomaterials 2004; 25(15): 2987-96に記載されているように、ポリブチレンテレフタレート−ｃｏ−ポリエチレングリコールテレフタレートの足場からなる真皮代替物が挙げられる。

大きな物質喪失を伴う組織再構築の分野と平行して、局部的な物質喪失または治癒を伴った組織再構築のための広い応用分野も存在する。更に、被覆組織のための代替物の殆どは、先に記述したように、一時的に治癒を促進するための生体活性な包帯材としても提案されてきた。これらの治癒補助材は、皮膚潰瘍のような長期に亘る創傷の治療の際に特に重要である。

従って、生命維持に重要な予後に関係する皮膚疾患の修復手術において従来使用されてきた自家移植片およびアロ移植片を代替することを目的とし、且つ上記で述べた欠点をもたない被覆組織、特に表皮のための代替物を探し出すことが必要とされており、この代替物はまた、治癒を促進することを目的とした生体活性な包帯材としての用途を見出すであろう。

更に、移植に関して増大した品質を備えた人工材料に基づくものであり、且つ良好な生分解性および低い免疫認識リスクを有する結合組織の足場を見出すための必要性が存在している。

更に詳細に言えば、本発明の目的は、生体適合性で且つ生分解性の多孔質マトリックスであって、式（Ｉ）に適合する三つのブロックが連続した共重合体を含んでなることを特徴とし、
Ｘ−Ｇ−Ｙ （Ｉ）
ここで、
Ｇは、ｐの反復ユニットを含む非ヒドロキシル化の親水性線型ブロックであり、ここでのｐは、１５０〜７００まで変化してよい数であり、
ＸおよびＹは、同一または異なり、それぞれが疎水性の線形ポリエステルブロックを表し、ＸおよびＹは各々がｎおよびｍ反復ユニットを含んでよく、ｎおよびｍの各々は、１７０〜３，５００で変化してよい数であり、
また、２０〜５００μｍで変化する直径をもった孔を含んでなることを特徴とするマトリックスである。

有利な実施形態に従えば、本発明による多孔質マトリックスは親水性を有する。

本発明は更に、上記で定義したマトリックスを調製する方法であって、先に定義した共重合体を調製するための少なくとも一つのステップと、その後に、それによって調製された共重合体内に孔を形成するためのステップとを含んでなることを特徴とする方法に関する。

更に、本発明の目的は、上記で定義した少なくとも一つのマトリクスを含んでなり、且つ内皮細胞および／または繊維芽細胞が付随した、結合組織の足場である。

それは更に、結合組織の再構築および／または治癒のために有用な間充織代替物であって、先に定義した多孔質マトリックスまたは結合組織の足場を含んでなり、内皮細胞および／または繊維芽細胞が付随した間充織代替物に関する。

その目的はまた、上記で定義した前記間充織代替物を調製する方法であって、先に記載した多孔質マトリックスまたは結合組織の足場を、内皮細胞および／または繊維芽細胞と接触させるステップと、次いで、細胞を増殖させるためのステップを含んでなる方法である。

その目的はまた、被覆組織のための代替物であって、少なくとも一つの多孔質マトリックス、一つの結合組織の足場、および／または一つの間充織代替物を含んでなり、上皮細胞が付随することを特徴とする代替物である。

本発明の目的はまた、前記被覆組織代替物を調製する方法であって、先に定義した多孔質マトリックス、結合組織の足場、および／または間充織代替物を上皮細胞に接触させるステップと、次いで細胞を増殖させるステップとを含んでなることを特徴とする方法である。

最後に、本発明は、先に定義した結合組織の足場またはその均等物を開発するための、本発明による多孔質マトリックスの使用に関する。

それはまた、先に定義した間充織代替物またはその均等物を得るための、本発明による多孔質マトリックスまたは結合組織の足場の使用にも関する。

それはまた、先に定義した被覆組織の代替物を得るための、本発明による間充織代替物の使用にも関する。

その目的はまた、外皮、特に皮膚外皮を修復すること、および／または治癒を促進することを意図した生体活性包帯材を調製することを目的とする材料を調製するための、上記で定義した多孔質マトリックス、結合組織の足場、間充織代替物、およびまたは被覆組織代替物の使用である。

本発明による多孔質マトリックス、結合組織の足場、間充織代替物、および／または被覆組織代替物はまた、診断目的のために使用されてよい。更に詳細に言えば、本発明による上記で述べた材料は、例えば皮膚のような被覆組織に投与および／または接触させることを目的とした化合物、医薬組成物、または更に治療技術の、例えば毒性、活性、耐性、および／または衝撃を評価する目的で適用されてよい。

従って、本発明の目的はまた、インビトロ診断試験を実施することを目的とした、多孔質マトリックス、結合組織の足場、間充織代替物、およびまたは被覆組織代替物の使用である。

本発明の範囲内において：
・「ブロック」は、幾つかの同一または異なる連続的ユニットであって、それがその隣接部分から識別され得るように少なくとも一つの構造的または構成的な特徴を有するユニットを含んでなるマクロ分子の一部を意味する。

・「生体適合性材料」は、それが導入される生物学的環境に対して如何なる有害な影響も伴うことなく、その機能を完全に満たすことができる材料を意味する。組織再構築の場合、その細胞支持および器官代替の機能は、生体適合性が、細胞適合性または培養支援としての材料の適性の概念をも包含することを意味している。生体適合性の第二の主軸は、生物に対する材料の無害性である。

・「生分解性材料」は、生きた細胞に接触したときに変化する結果として、その一体性が、生物学的活性に関連したプロセスによって分子レベルで変化し得るような材料を意味する。特に、生分解性の概念は、移植部位の性質の喪失、おそらくは消失を意味するが、必ずしも生物の排除を意味しない。

・「生体再吸収性材料」は、本質的に分解し、それについて、分解生成物がバイオマスの中に組込まれ、および／または代謝または腎濾過によって生物から除去されることの証拠が存在するする材料を意味する。

・「外皮」は、そのために動物の身体が連続的な壁を形成し、またそこにおいて外部媒質に関して一般的な支持的および保護的な役割が認められる周辺組織を意味する。例えば、皮膚の特別な場合に、「外皮」の用語は、実際の表皮の組織および形成を意味するだけでなく、「真皮」の曖昧な名称に含まれる下地組織をも意味する。

・「生体活性な包帯材」は、組織の上に、その再構築を刺激するために一時的または限定的に堆積または移植され得る医療用装置を意味し、一つの変形例に従う前記包帯材は、生きた生物または生きた生物の抽出物と接触するに至ったときに活性であり得るものである。

・「結合組織の足場」は、少なくとも間充織代替物を形成することを目的とした細胞培養のための構造体として使用できる充填材を伴った、非細胞性の材料を意味する。

・「間充織代替物」とは、結合組織、多孔質マトリックスまたはその均等物の足場との接触に至るときに、内皮細胞および／または繊維芽細胞の培養から得られる材料を意味する。

・「被覆組織のための代替物」は、合成の（例えばシリコーン）または生物学的（たとえば被覆上皮）なバリアと、間充織代替物または結合組織の足場とを組み合わせた材料を意味する。

・「被覆上皮」は、接合システムによって相互に一体化された並列された接合細胞で形成され、且つ身体の内部および生物の一定の体腔を覆う基底層によって隣接組織から分離された組織を意味する。特に本発明に従って関連のある生物の体腔は、解剖学的気道、消化管、尿管、および生殖器官のような外部世界の延長である。

本発明に従う関連の被覆上皮の非限定的な例として、表皮、粘膜または外分泌腺管が特に挙げられる。

被覆上皮は、単層（単一細胞層）、積層または儀積層であってよい。

「…と…の間」および「…から…まで変化する」とは、これらの限界も含まれることを意味する。

＜生体適合性および生分解性の多孔質マトリックス＞
当該マトリックスは、式（Ｉ）に適合する三つのブロックが連続した共重合体を含んでなり、
Ｘ−Ｇ−Ｙ （Ｉ）
ここで、
Ｇは、ｐの反復ユニットを含む非ヒドロキシル化の親水性線型ブロックであり、ここでのｐは、１５０〜７００まで変化してよい数であり、
ＸおよびＹは、同一または異なり、それぞれが疎水性の線形ポリエステルブロックを表し、ＸおよびＹは各々がそれぞれｎおよびｍ反復ユニットを含み、ｎおよびｍの各々は、１７０〜３，５００、特に２００〜３，０００、とりわけ３００〜２，５００で変化してよい数である。

上記で定義した共重合体に関する共重合体は、それ自体として知られている。それらは、中でも特許ＥＰ ８６３ ９３３Ｂ１に記載されたヒドロゲルの形成におけるそれらの使用について知られている。

ｐは、有利には１８０〜６５０で、更に好ましくは２００〜６００で変化する。

本発明のもう一つの好ましい変形例に従えば、（ｍ＋ｎ）／ｐの比は、０．４８〜４７の間である。

有利には、この比率は、０．６０〜３３の間であり、特に１〜２５、例えば１〜１５である。

本発明による共重合体は、有利には親水性である。

式（Ｉ）においてＸおよびＹが表すブロックは、特に脂肪族ポリエステルである。

脂肪族ポリエステルは、
（ａ）ヒドロキシ酸のそれ自身に対するポリ縮合、または幾つかのヒドロキシ酸のポリ縮合によって、
（ｂ）ラクトン環の開環を伴う重合によって、
（ｃ）または二酸およびジオールのポリ縮合によって
得られることが知られている。

本発明によるマトリックスを合成するために使用し得る脂肪族ポリエステルには、ラクチド（乳酸、Ｄ−，Ｌ−およびメソ−ラクチド）；グリコリド（グリコール酸を含む）；；ε−課プロラクトン；ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）；トリメチレンカーボネート（１，３−ジオキサン−２−オン）；トリメチレンカーボネートのアルキル誘導体；ｄ−バレロラクトン；β−ブチロラクトン；γ−ブチロラクトン；ε−デカラクトン；ヒドロキシブチレート；ヒドロキシバレレート；１，４−ジオキセパン−２−オン（その１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４−ジオン二量体を含む）；１，５−ジオキセパン−２−オン；６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オン；２，５−ジケトモルホリン；ピバロラクトン；α，α−ジエチルプロプリオラクトン；エチレンカーボネート；エチレンオキサレート；３−メチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン；３，３−ジエチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン；６，６−ジメチル−ジオキセパン−２−オン；６，８−ジオキサビシクロオクタン−７−オンのホモポリマーおよび共重合体、並びにそれらのポリマー混合物が含まれるが、これらに限定されない。

本発明において使用される脂肪族ポリマーは、（ランダムまたはブロック、櫛形または交互）ホモポリマーまたは共重合体であってよい。

更に詳細に言えば、該脂肪族ポリエステルは、特に（ｉ）乳酸、リンゴ酸のモノエステル、ラクチド、グリコリド、パラ−ジオキサノン、ε−カプロラクトンから選択されるモノマーから誘導されるホモポリマー、（ｉｉ）上記で述べたモノマーから誘導される共重合体、または（ｉｉｉ）二酸およびジオールのポリ縮合によって得られるポリマーから選択される。

ヒドロキシ酸から誘導されたポリエステルの中で、特に、乳酸、グリコール酸から選択されるモノマーから、リンゴ酸のモノエステル（例えばアルキルもしくはアラルキルモノエステル）から、またはヒドロキシル化された活性成分、特に疎水性活性成分（例えば米国特許第４，３２０，７５３号および第４，２６５，２４７号参照）、ラクチド、グリコリド、またはパラジオキサノンによるリンゴ酸のモノエステル化から生じるモノエステルから誘導されるものを挙げることが可能である。ＸおよびＹによって表されるブロックはまた、前記モノマーが一緒になって形成する共重合体であってもよい。

二酸およびジオールから誘導されたポリマーのうち、ポリ（エチレングリコールスクシネート）が例として挙げられてよい。

本発明の範囲内において、「ラクチド」の用語は、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドおよびそれらの混合物を含んでいる。

式（Ｉ）においてＧで表されるポリマーブロックは、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリンおよび類似の共重合体から選択されてよい親水性ポリマーである。

本発明の好ましい変形例に従えば、ポリマーブロックＧは、式Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐＯＨをもったポリエチレングリコールまたはＰＥＧブロックであり、ここでのｐは２，５００〜６００で変化する。

有利には、該共重合体はＧポリマーブロックにおいて小さい鎖長を有し、結合組織の足場としてのその使用に適合した、対応するマトリックスのために保持された分解を与えるようになっている。

本発明の範囲内において、式（Ｉ）の三ブロックが連続する共重合体は、３１，０００〜５５０，０００、好ましくは３７，５００〜４７５，０００、更に好ましくは４５，０００〜４００，０００、例えば６５，０００〜４００，０００の数平均分子量を有してよい。

ＸリンクおよびＹリンクの形成を導く重合は、予め形成されたＧポリマーの存在下に、また適切に感応化された末端を用いて行われてよい。例えば、ポリ（ヒドロキシ酸）およびポリエチレングリコールに基づく連続的な共重合体を得ることは既に説明した；特に、「生物医学的応用のためのＬ−ラクチドおよびポリ（エチレングリコール）のブロック共重合体」、Ｐ．Ｃｅｒｒａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ： Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１９９４）、３０８−３１３、および文献ＥＰ ２９５ ０５５を参照のこと。出発生成物は、一方ではラクチドであり、他方ではポリエチレングリコールである。好ましくは、金属、有機金属化合物またはルイス酸であってよい触媒の存在下において、バルク重合が行われる。使用される触媒の中でも、亜鉛粉末、水素化カルシウム、水素化ナトリウム、オクタン酸鈴、乳酸亜鉛等を挙げることができる。ポリ（ヒドロキシ酸）鎖の長さは、本質的に、初期混合物中の（乳酸単位）／（ＰＥＧ）のモル比に依存する。ポリ（ヒドロキシ酸）鎖の長さはまた、例えば数分から数日の範囲である反応の持続時間と共に増大する。

タイプＧポリマーブロックを、例えば末端のヒドロキシ基、カルボン酸基、アミノ基、チオール基などを有する感応化末端で使用することにより、上記の式（Ｉ）に適合する配列された共重合体を得ることが可能であり、ここでのＸとＧの間およびＹとＧの間の接合は、エステル基、アミド基、ウレタン基、チオエステル基などのような加水分解可能な基を介して形成される。

式（Ｉ）の共重合体はまた、その両端を既知の方法で適切に感応化されたタイプＧポリマー、並びにＧの感応化され他末端と反応できるように一つの感応化末端を備えたタイプＸおよびＹポリマーを使用することにより、予形成されたポリマーブロックから製造されてよい。

本発明によるマトリックスは、有利には多孔質である。この多孔性は、二重の役割を果たす。即ち、それは本発明による間充織代替物を調製する段階の間に細胞に対する適応を提供し、次いで、それが宿主組織上の場所にセットされたときには、その血管新生化を提供する。更に、それは機械的性質（即ち、可撓性）を与え、それによって周囲媒質との良好な適合性が達成される。更に、前記共重合体は、孔を形成する反応によって変化してはならず、最終的には、細胞コロニー形成および栄養液の通過を可能にするように、前記孔は連結されるべきである。

Ｈｏｎｇ−Ｒｕ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，「孔形成添加剤として混合塩を使用したマクロ多孔質生分解性ＰＬＧＡ足場の調整」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ２００２；６３（３）：２７１−９に記載された、孔を形成するための方法の変形例が使用されてよい。即ち、この方法は、６０℃を越える温度での塩化ナトリウム／炭酸水素アンモニウムの混合物を記載している。

本発明の範囲内において、孔形成剤として炭酸水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）を好ましくは単一成分として含んでなる粒子を、孔形成剤として使用することからなる、孔を形成するための少なくとも一つの工程を含む方法が有利に使用されてよい。

孔発生は、穿孔現象に類似した現象によって支配される。本発明による多孔質マトリックスを得るための既知の技術の応用は、当業者の技量の範囲内である。

本発明の有利な実施形態に従えば、このような孔形成剤の内容物は、該孔形成剤の内容物と式（Ｉ）の共重合体の内容物との間の質量比が、１／１〜５０／１、好ましくは５／１〜３０／１で変化するように使用される。

特に、孔形成剤が炭酸水素アンモニウムであり、また式（Ｉ）の共重合体が、３ブロックのポリラクチド−ポリエチレングリコール−ポリラクチド共重合体、特に実施例１に示した共重合体であるときに、この質量比は、有利には１／１〜５０／１、好ましくは５／１〜３０／１で変化する
これら粒子は、水中に浸漬することによる７０℃での二段階洗浄方法によって、ポリマーマトリクスから完全に抽出されてよい。それによって得られた孔は、２０μｍ〜５００μｍの直径を有してよい。

孔を形成するための他の標準技術が代わりに適用されてよいが、後者は、細胞の浸潤に適合した開いた孔を導くであろう。

本発明の好ましい代替方法に従えば、当該マトリックスの孔の直径は、２０〜５００μｍ、好ましくは１５０〜５００μｍで変化する。多孔性、孔の直径および相互連結の定量は、好ましくは環境的走査型電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）によって得られてよい。また、光学顕微鏡によって孔の直径および数を決定すること、或いは、少なくとも２００μＬ／分／ｃｍ^２の流速で、乾燥多孔質マトリックスに水溶液を通過させることによっても可能である。

勿論、孔の密度および直径は、使用する孔形成剤の性質および適用される実験法に関連する。

本発明による多孔質マトリックスの生体適合性は、上記で与えられた定義により強調されるように、二つの軸に沿って利用可能である。

マトリックスおよびその分解生成物の生物に対する無害性が、一方で研究されている。四つの累積的基準は、この第一の軸が観察されること、即ち、細胞障害性がなく、免疫原性がなく、血栓形成性がなく、また突然変異誘発性がないことのチェックを提供する。従って、本発明の範囲内において、多孔質マトリックスは有利かつ好的に、上記で提示した基準の全体に合致する。

他方、細胞レベルにおいて、該マトリックスは、更に有利なことに、良好な細胞適合性を有する。

特に、この細胞適合性は、外皮の構成的細胞（主に繊維芽細胞および上皮細胞）の接着の研究、増殖の研究、発現形保持の研究および血管系性の研究によって示されてよい。

この生体適合性に加えて、本発明によるマトリックスが結合組織の足場を形成する目的で使用され得るように、他の性質が探索されている。即ち、該マトリックスは、好ましくは、結合組織の機械的特徴に可能な限り近似した従順性および引っ張り強度を有する。

有利には、該マトリックスは生分解性または生体再吸収性である。

最後に、当該マトリックスは、有利には滅菌可能である性質を有し、従って、最適な無菌条件下での移植に適合する一方、該マトリクスの性質に影響しない。

本発明の目的である多孔質マトリックスは、それ自体として、生体活性な包帯として使用されてよい。

本発明の好ましい実施形態に従えば、本発明による共重合体は、６５，０００〜４００，０００の数平均分子量を有し、また１〜１５の（ｍ＋ｎ）／ｐ比を有する。

最も好ましい実施形態に従えば、本発明による共重合体は、８０，０００〜３７５，０００の平均分子量を有し、また１．８〜１０．９の（ｍ＋ｎ）／ｐ比を有する。

この特別な実施形態に従う共重合体を含んでなる多孔質マトリックスは、実際に、多くの利点を有する。

従って、このような多孔質マトリクスは、以下で詳述する応用、例えば結合組織の足場、間充織代替物、被覆組織代替物、および／または皮膚を修復するための材料を調製し、および／または治癒を促進するための生体活性包帯として調製するための、その使用に特に適した機械的性質を有する。実際に、それは適切な従順性および引っ張り強度を有し、これにより外科的処置のために最も特に適したものとなる。特に、このような多孔質マトリクスは縫合糸のために適している。

更に、それ自身として、または以下に列記する適用の形態の一つとしてのその適用に際して多孔質マトリックスが充分な一体性を保持する意味において、加水分解もまた適している。

更に、このような多孔質マトリクスは、それ自身として、または以下に列記する適用形態の一つとして用いたときに、浸出液に対する抵抗性の利点を有する。

最終的に、この好ましい実施形態は、細胞増殖に関して特に有利である。従って、このような多孔質マトリックスは、それ自身として、または以下に列記する適用形態の一つとして用いたときに、この実施形態から生じる特別な親水性−疎水性のバランスにより、最適化された細胞増殖を有する。

＜結合組織の足場＞
本発明による結合組織の足場は、それが、上記で定義した少なくとも一つの生体適合性で且つ生分解性の多孔質マトリックスを含んでなることを特徴とする。

本発明の特定の実施形態に従えば、この足場は、前記足場における細胞の固着を促進するように、生体適合性で且つ生分解性の充填剤を含浸されてよい。該充填剤は、特に、コラーゲンおよび／またはフィブリンを含有する生物学的材料、またはそれ以外から選択されてよい。

充填剤としては、疎水性化されたヒアルロン酸、凝集フィブリンに富む血漿、好ましくは自家性のコラーゲンゲルまたはアルギン酸ゲルが挙げられる。

本発明の好ましい実施形態に従えば、生体適合性および分解性の充填材、特にコラーゲンの含量は、一般には、結合組織の足場の乾燥材料で表された全重量に基づいて、乾燥重量で１０％未満、特に０．０５〜７％、または０．１〜３％である。

組織再構築、治癒、無菌化、痛みおよび炎症の抑制に関与し得る何れか他の化合物もまた、該足場に含められてよい。例としては、抗生物質、銀塩、抗真菌剤、抗炎症剤、および抗腫瘍剤が挙げられる。

結合組織の足場は、被覆組織の病変部、特に治療すべき皮膚の形状および大きさに適合するために、全ての形状を有してよい。

結合組織の足場は、更に、必要な適用に従って、５００μｍ〜５ｍｍで変化する厚さを有してよい。

最後に、結合組織の足場は、先に定義した多孔質マトリックス、および特に生分解性、生体的合成、機械的性質等の点で足場の性質がそれらによって影響されない範囲で、連続する層としてのもう一つの型のマトリックスを含んでよい。

これらの材料は、外皮を再形成するために特に興味深いものである。実際に、発明者等は、これらの材料が上皮細胞再生のプロセスにおいて能動的に関与していることを認めた。例えば、それらは損傷を受けた組織に対する治癒に対して有益な効果を有する。このように、それらは生体活性な包帯材として働く。

別の実施形態に従えば、多孔質材料、結合組織の足場、間充織代替物、および／または被覆組織代替物は、有機または無機のフィルム、特にシリコンタイプのフィルムで表面コーティングされてよい。それによってコーティングされた被覆材料は、それ自体として、または使用前に除去される除去可能なフィルムと共に使用されてよい。このような使用の場合、適用時における有機または無機フィルムの表面配置は、勿論好ましいものである。

例えば、結合組織の足場は、保護フィルムとして、シリコーン型ポリマーフィルムを含んでなるものであってよい。

＜間充織代替物＞
本発明の目的はまた、内皮細胞および／または繊維芽細胞を付随した、先に定義した多孔質マトリックスまたは本発明による結合組織の足場を含んでなることを特徴とする、間充織代替物である。

本発明の間充織代替物は、生体活性の包帯材として、または被覆組織代替物として使用されてよい。この実施形態において、被覆組織のための代替物は、以下で説明するように、インビトロでの上皮細胞の増殖に付託することなくインビボで直接得られる。即ち、宿主生物の上皮細胞はインサイチューで増殖し、それによってインサイチューで被覆組織代替物を形成する。

それは、先に定義した多孔質マトリックスまたは結合組織の足場に接触した、内皮細胞および／または繊維芽細胞を増殖させることによって得られてもよい。

特に、間充織代替物を作製することが目的であるときは、本発明によるマトリックスの孔は、有利には上記で定義した充填剤で、および／又は内皮細胞および／又は繊維芽細胞、好ましくは繊維芽細胞で充填されてよい。それによって得られた間充織代替物は、次いで直接移植され、或いは、生体活性な包帯材および／または被覆組織代替物を提供するために、事前にインビトロでの細胞増殖工程を受ける。

繊維芽細胞増殖ステップは、有利には、補充された培地を用いた培養条件下において、例えば３日〜１５日間行われる。

実施例４．１は、本発明のこの側面を示している。

＜被覆組織代替物＞
本発明による被覆組織代替物は、それが、上皮細胞を伴った少なくとも一つの間充織代替物を含んでなることを特徴とする。

上皮細胞は、特に、胃腸系（口腔、特に歯肉細胞、食道、胃、小腸、大腸、および直腸）、機関紙、胃−尿系（膀胱）および生殖系（膣）の上皮細胞、並びに表皮の上皮細胞の場合はケラチン細胞から選択される。

本発明の被覆組織のための代替物は、生分解性の被覆組織代替物および／または生体活性包帯材として使用されてよい。

それは、先に定義した間充織代替物または結合組織の足場に接触した、ケラチン細胞のような上皮細胞を成長させることによって得られてよい。それによって得られた生分解性の被覆組織代替物は直接移植されてよく、或いは、インビトロの細胞増殖工程を受けてもよい。ケラチン細胞増殖工程は、血清を含む培地または含まない培地中において、例えば３〜１５日間、培養条件下で生じてよい。

実施例５は、本発明のこの側面を例示している。

先に記載した四つの生成物は、生体活性な包帯材として使用されてよい。それらは特に、先に記載した全ての上皮、特に皮膚、更には歯茎において移植されてよい。

発明者等は、更に、これら四つの製品がインビボの血管形成促進特性を有することを示した。

従って、本発明は、最も特定すれば、多孔質マトリックス、足場、間充織代替物、被覆組織のための代替物、外皮を修復するための材料、および血管形成促進特性を備えた本発明による生体活性な包帯材に関する。

先に記載した四つの製品；即ち、本発明による多孔質材料、結合組織の足場、間充織代替物、被覆組織代替物の各々を移植することによって治療され得る被覆組織（特に皮膚）の疾患（特に損傷）は、特に、母斑、皮膚潰瘍、および火傷である。

「母斑」の用語の起源は、臨床的には良性腫瘍および対応する過誤腫の側面を有する、被覆組織、特に皮膚の形成異常を意味する。現在、この用語はより限定的であり、色素母斑またはネボ細胞性母斑の意味で使用される。

これらの腫瘍は、テク（表皮内細胞巣）で配列された母斑細胞（またはネボ細胞）からなる。外皮面、特に皮膚における母斑テクの局在化により、真皮ネボ細胞性母斑、接合部ネボ細胞性母斑、混合型もしくは複合ネボ細胞性母斑、および青色母斑の間での区別がなされる。

皮膚潰瘍は、それに関する限り、自然な治癒傾向を伴った皮膚物質の慢性的喪失として定義される。これは、それ自身が病気ではないが、基礎をなす屡々重篤な血管疾患（これは予後および治療コースを決定する）の合併症である。非常に頻繁な脚潰瘍は、廃疾性であり、非常に多くの入院の原因である
最後に、火傷は、熱源と外皮の間のエネルギー移動による、外皮被覆、特に皮膚の病巣である。最も頻繁な火傷は熱によるものである。それらはまた、電気的起源、化学的起源、またはイオン化放射線起源のものであるかもしれない。

以下、本発明を実施例により説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１： 本発明による多孔質マトリックスの調製
１．１ ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０共重合体の合成
Ｄ，Ｌ−ラクチド（シグマ−アルドリッチ社）を、再結晶化により精製した。ジヒドロキシルＰＥＧ２０００（Ｆｌｕｋａ）を、使用前に真空中で乾燥した。使用したプロモータである二酢酸亜鉛（シグマ−アルドリッチ社）もまた、真空中で乾燥した。

３ブロック共重合体（二つのＰＬＡ_５０セグメントおよび一つのＰＧＥ２０００セグメントからなる）を、ＰＥＧ２０００および二酢酸亜鉛の存在下で、以下の方法に従って、Ｄ，Ｌ−ラクチドの開環での重合によって得た。

試薬（３２．７ｇのＤ，Ｌ−ラクチド；５ｇのＰＥＧ２０００；７ｍｇの二酢酸亜鉛）を真空中で乾燥し、長首フラスコ（重合フラスコ）の中に配置し、次いでアセンブリーに接続した。

三方弁を用いて、反応混合物／真空、または反応混合物／アルゴンの流通が樹立されてよい。該混合物は、真空中で溶融される。可能な昇華／蒸留生成物を再凝結によって回収するために、フラスコの長首は冷却される。

脱ガスは、一連のアルゴン／真空パージからなっており、害混合物は交互に液体または固体（冷却により）である。この脱ガスを用いれば、重合の阻害剤である如何なる酸素痕跡も除去することが可能である。

次いで、該フラスコは、トーチを用いて動的真空下でシールされる。重合は、回転撹拌システムを設けたオーブン中で達成される。

重合の後（１５日）、共重合体はアセトン中に溶解され、次いでメタノールで沈殿される。次いで、それらは質量が一定になるまで真空中で乾燥される。

この合成された共重合体は、赤外線スペクトル分析および^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析によって特徴付けされた。プロトンＮＭＲ分析から推定された数平均分子量は、８５，０００ｇ／モルである。

この例において、ｎ＝４５１：ｍ＝４５１；ｐ＝４５４であり、また比（ｍ＋ｎ）／ｐは１．９８に等しい。

この研究の全体のための対照として使用するために、当該共重合体の合成と平行して、ＰＬＡ_５０を合成した。このＰＬＡ_５０は、立体排除クロマトグラフィーによって特徴づけされた：数平均分子量は５０，０００ｇ／モルであり、ポリ分子指数（polymolecularity index；Ｉｐ）は１．４である。

１．２ 多孔質マトリックスの形成
Ｈｏｎｇ−Ｒｕ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上記で引用したもの）により開発された塩可溶化技術が、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスを作製するために使用された。

炭酸水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３、シグマ−アルドリッチ社）の粒子を篩（＜２５０μｍ）にかけ、次いで真空中で乾燥した。次いで、実施例１．１に従って、これらの粒子をアセトン中のポリマー溶液（１ｍｇ／ｍＬ）と混合した。ＮＨ_４ＨＣＯ_３／ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０の質量比は９／１であった。この混合物は、最終的には、空気中において室温のガラス製ペトリ皿の中に堆積された。溶媒を２４時間蒸発させた後、真空中で６時間乾燥し、得られたフィルムを取り外し、７０℃に加熱された蒸留水中に配置した。この温度での水の存在は炭酸水素アンモニウムとの反応を生じ、これはアンモニアおよび二酸化炭素の形成を誘導する。二酸化炭素の泡形成および塩の消失は、ポリマーのバルクの中に孔を生じさせる。

１．３ もう一つのＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０共重合体の合成
同じ合成方法に従って、３１０，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有するもう一つの共重合体を合成した。

この例では、ｎ＝２，０２０、ｍ＝２，０２０；ｐ＝５４５、および（ｎ＋ｍ）／ｐ＝８．９である。

実施例２： 生体適合性マトリクスの加水分解の研究
２．１ 装置および方法
^＊分解緩衝液の調製
保持された分解媒質は、繊維芽細胞のための培養培地である：
下記を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）
・新生児ウシ血清（１０％）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、および
・ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
ポリマーの分解を追跡するために、溶媒蒸発によって得られたフィルム（Ｗ×Ｌ×Ｈ：５ｍｍ×５ｍｍ×０．２ｍｍ）を使用した。多孔質共重合体の分解の場合、多孔質部分は、厚さ（０．４ｍｍ）を除き、フィルムとして同じ寸法を有する。孔は、上記で提示した技術により得られた。２０〜３０ｍｇに近い質量を持ったサンプルを、１．５ｍＬの分解緩衝液中に配置した。

分解条件
・インビトロ： サンプルを、水で飽和した５％ＣＯ_２雰囲気を伴った３７℃の細胞培養インキュベータの中に配置した。

・インビボ： マウスの鼠径ひだに移植された多孔質マトリクスのサンプルが、回収後にコラーゲナーゼを用いた酵素処理を受ける。塩化カルシウム（０．１Ｍ）の存在における３７℃で２４時間のこの処理は、前記多孔質マトリックスをコロニー化した組織の分解を提供し、次いで可溶化を提供した。

２．２ ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０およびＰＬＡ_５０の比較分解
この分解を評価するために、次の二つのタイプの研究を行った：
・細胞培養インキュベータにおける２４週間のインビトロ研究
・マウスの皮下に支持体を移植した後の１９週間のインビボ研究
Ａ．インビトロ分解研究
この研究の目的は次の通りである：
・実施例１．１に従うＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０の順応性を、対照ＰＬＡ_５０の順応性に対して比較すること
・被覆組織代替物を得るために必要な時間を広くカバーする期間に亘って、ＰＬＡ_５０およびＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０の質量の喪失を評価すること
・多孔性度が分解速度論に対して影響を有するか同かを決定すること
二つの基準が維持された：巨視的側面および質量喪失。

ＰＬＡ_５０およびＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０について、膜（厚さ２００μｍ）および多孔質マトリクス（厚さ４００μｍ）の分解が試験された。

ａ）巨視的外観および順応性
分解の前に、全てのフィルムおよび多孔質マトリックスは、色（白色）および可撓性において同じであった。この白色は滅菌の間に現れた。

分解の３週後に、外観における相違が非常に明瞭に現れた。ＰＬＡ_５０フィルムは凹凸の表面を有しており、それ自身の上に巻かれた。他方、ＰＬＡ_５０多孔質マトリックス並びにフィルム、およびＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスは、無傷のままであった。可撓性に関して、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０サンプルは、常に明瞭な脆弱さを伴わずに取り扱うことができた。

分解の６週後に、ＰＬＡ_５０の膜および多孔質マトリックスは、それらの巨視的外観を保持したが、それらは特に脆かったので、取り扱いのためには非常にデリケートになった。他方、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０のフィルムおよび多孔質マトリックスは、皺の寄った、または凸凹した表面の発生を伴うことなく、それらの巨視的外観を保持した。更に、外科的操作に適合した大きな可撓性を有していた。

分解の１２週後には、ＰＬＡ_５０サンプルの脆弱さが増大するように見え、単一片でサンプルを再被覆するのは不可能であった。ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０フィルムについては、それ自体の上に巻かれ、可撓性および機械的性質を喪失した。

分解の１２週後に、全てのサンプルは、単一片で回収するのが不可能であることが示された。外科的操作の目的で充分な機械的性質を保持したサンプル（フィルムまたはマトリックス）は存在しなかった。

ｂ）質量喪失
ＰＬＡ_５０（フィルムおよび多孔質マトリックス）およびＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０（フィルムおよび多孔質マトリックス）の分解の研究は、細胞培養インキュベータの中で行われ、分解培地は繊維芽細胞のための通常の培地であった。この結果は、添付された図１に報告されている。それは、ＰＬＡ_５０（フィルムおよび多孔質マトリックス）およびＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０（フィルムおよび多孔質マトリックス）の、２４週の期間に亘るインビトロでの質量喪失を表している。

その結果は、３回の平均値および標準誤差平均（ＳＥＭ）に対応する。

図１は、６月の後の初期質量に対する相対的なサンプル質量減少が、ＰＬＡ_５０フィルムについては１９％、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０フィルムについては１６％、多孔質ＰＬＡ_５０マトリックスについては１４％、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスについては１３％であることを示している。

この分解研究は、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスが、ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスよりも遥かに順応性であることを示している。それらの機械的性質は、インビトロでの分解研究の間、約１２週間保持される。多孔質マトリックスについての質量喪失は、２４週の分解の後にも１３％を超えない。このインビトロの質量喪失の追跡調査により、多孔質マトリックスはフィルムよりも遅く分解することが示された。

Ｂ．インビボ分解研究
この研究の目的は、実施例１．２に従うＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスの、インビボ分解を評価することであった。このために、マウスの皮下に移植されたサンプルの巨視的外観および質量喪失を、１２週の期間に亘って研究した。

ａ）巨視的外観および順応性
ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスの移植されたサンプルは、最初は矩形の形状を有していた。移植されたサンプルの形状における変化は、インビボ分解の部分的な所見を提供する。

移植の２週間後に採取されたサンプルは、それらの矩形形状、並びに従順性を保持していた。

移植の６週間後、サンプルは腐食された縁部を有しており、常に、非常に順応性であった。しかし、多孔質マトリックスが周囲組織によって広範にコロニー形成されており、該マトリックスにトラップされたこれら組織は、確かに該マトリックスの機械的性質を強化しているとの事実によって、この順応性の評価は歪曲された。

移植の１２週および１９週の後、サンプルはもはやそれらの初期の矩形形状を有しておらず、楕円形であった。移植の６週間後と全く同様に、マトリックスの順応性を評価することは困難であった。しかし、マトリックスの崩壊は、特に１９週後に採取されたサンプルについて観察された。

ｂ）質量喪失
ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスの移植サンプルの分解は、図２に示すように、質量喪失を追跡することによって研究された。図２は、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスサンプルの、１９週の期間に亘るインビボ質量喪失を示している。この結果は、３回の平均値および標準誤差平均（ＳＥＭ）に対応する。多孔質マトリックスのみを秤量し、その中にコロニー形成した組織を秤量しないために、サンプルをコラーゲナーゼで処理して組織を可溶化することが必要であった。

図２に従えば、該サインプルは、移植の２週間後に初期質量の２６％を喪失し、６週間後には５２％、１２週間後には６２％、１９週間後には６６％を喪失した。

このインビボ分解研究は、多孔質マトリックスがインビボで迅速に分解し、該質量ロスは１９週後に６６％であることを示している。インビトロおよびインビボ研究の際の分解速度論において観察されたこれら差異は、細胞の存在によって説明され得るものであり、細胞はその移動および活性によってマトリックスの表面を腐食させることができる。また、インビトロ分解媒質の静止状態に対して、インビボにおける生物学的流体の永久的な流れは、多孔質マトリックスの分解を刺激すること、並びに動物の移動性に関連したダイナミクスに寄与する
実施例３： ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスの、皮膚および歯肉細胞適合性
ケラチン細胞を包皮から単離し、血清を全く含まない培地中で増殖させる。この培地は、栄養層（照射されたマウス繊維芽細胞）の不存在において、ケラチン細胞を増殖させることを可能にし、ウシ下垂体抽出物がウシ退治血清を置き換えてよい。こうして、ケラチン細胞の接着および特異的増殖を評価することが可能である。

以下の補充物を添加したある容積のＭＣＤＢ１５３培地から、血清フリーの培地を調製する：
・ウシ下垂体抽出物（７０μｇ／Ｌ）（ＧＩＬＣＯ−ＢＲＬ）
・上皮成長因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
・ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
ヒト真皮繊維芽細胞が、包皮から単離される。ヒト歯肉繊維芽細胞は、親知らず歯を除去した後に得られたバイオプシーから単離される。両タイプの繊維芽細胞は、即座に調製された特定の培地を用いて増殖される：該培地は、下記を添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）である：
・新生児ウシ血清（１０容量％）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
・ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
細胞計数は、ＭＴＴ比色試験を用いて推定された。ＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム)は、ミトコンドリア酵素であるコハク酸デヒドロゲナーゼの基質である。これら酵素は、ＭＴＴを水性媒質に不溶性のホルマザン結晶へと変換することができる。イソプロパノール中でのこれら結晶の可溶化、次いで５７０ｎｍにおける光学密度の測定（ＳＬＴスペクトル）は、ミトコンドリア活性、従って細胞生存、よって比例的に細胞数の評価を提供する。

１１日に亘る繊維芽細胞増殖の研究は、真皮および歯肉の繊維芽細胞が、ポリスチレン（ＴＣＰＳ、組織培養ポリスチレン）と比較したときに、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックス上で増殖できることを示している（図３および図４参照）。

図３は、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０フィルム上での真皮繊維芽細胞の増殖の研究を図示しているのに対して、図４は、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックス上での歯肉繊維芽細胞の増殖の研究を図示している。

１１日に亘るケラチン細胞増殖の研究は、ケラチン細胞が、ポリスチレン（ＴＣＰＳ、組織培養ポリスチレン）と比較したときに、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０支持体上で増殖できることを示している（図５参照）。

実施例４： 細胞培養における結合組織の生体適合性足場の使用
４．１ 間充織代替物を形成するために
間充織代替物は、実施例１．２に従うＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックスからなり、その孔にはＩ型コラーゲンおよびヒト真皮繊維芽細胞が充填される。Ｉ型コラーゲンは、ラット尾部の腱から抽出され、０．１％（容量／容量）酢酸溶液中に溶解される。遠心分離の後、３ｍｇ／ｍＬの溶液を得るために、該コラーゲンは希釈される。このコラーゲンの溶液に、即座に且つ経時的に下記のものが添加される：
・９／１（容量／容量）のＥＭＥＭ／新生児血清（ヒト真皮繊維芽細胞のための培養培地）、
・ＮａＯＨ ０．１Ｎ（５０μＬ／ｍＬ）
・ヒト真皮繊維芽細胞（３００，０００細胞／ｍＬ）
混合物が達成されたら、孔においてコラーゲン繊維の架橋が完成する前に、後者は直ちに多孔質マトリックス上に堆積されるべきである。間充織代替物中のコラーゲンの最終量は、前記代替物の全質量の０．０５〜７％で変化する。

間充織代替物の組織学的分析によって、結合組織の足場に接触した繊維芽細胞の存在が解明される
４．２ 血管コロニー形成
使用されたインビボ血管新生モデルは、４５日の期間に亘って、Ｃ５７／黒ー６（Ｉｆｆａｃｒｅｄｏ）マウスの鼠径部ひだに、コラーゲンフリーの多孔質マトリックスを移植することからなっている。新たな血管の形成を得るためには、インビトロでのコラーゲンの存在は必須であるのに対して、インビボでは支持体単独でも評価され得る。下記の三つの側面が特に研究された：
・新規な血管の血管細胞適合性、または多孔質マトリックスとの「親密性」、
・血管コロニー形成、またはＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質移植を血管形成する生物の能力、
・血管ネットワークの形成。

マトリックスの表面に局在化した組織を除去すると、多孔質マトリックスの断片は、この組織に付着したまま残った。多孔質マトリックス断片が新たに形成された組織に結合したまま残るという事実は、新たな血管と多孔質マトリックス表面との近接、または親密性を説明するものである。実際に、一定の血管は多孔質マトリックス断片を取り囲んでおり、また血管の芽が観察可能である。

・０．１ｍＬの塩水中の０．１ｍｇのレクチン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（イソレクチンＩＢ４、Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）の頸静脈内注射は、階層的に組織された血管ネットワークの実証を提供する。

・３Ｄネットワーク内で発達した血管システムの機能性は、α−ＳＭアクチンの発現（モノクローナル抗α平滑筋アクチン、マウス腹水クローン１Ａ４、シグマーアルドリッチ）によって特徴付けられる動脈または細動脈に特異的な平滑筋細胞の存在によって示される。

結論として、この血管新生研究は以下の結果を提供する：１／多孔質マトリックスは血管起源の細胞と適合性であり、新規な血管と多孔質マトリックスとの「親密性」が存在する。２／血管システムは、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質移植をコロニー形成することができる。細動脈および細静脈を含んでなる血管ネットワークは、多孔質マトリックスの上および中に組織される。

４．３ 上皮再構築
インビトロでの積層上皮を形成するために、血清を含む培地を使用することを特徴とする２段階培養技術を使用した。第一の工程は、ケラチン細胞およびマウス繊維芽細胞を、浸漬培地中で共増殖させることからなっている（Ｊｉｍ Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ Ｇｒｅｅｎによって開発された技術）。

その増殖がマイトマイシンＣでの処理によって阻害されるこれらマウス繊維芽細胞（Ｊ２）は、ケラチン細胞の結合を促進する細胞外マトリックスのタンパク質、およびケラチン細胞の増殖を刺激する成長因子を分泌することによって、栄養細胞の役割を果たす。

ケラチン細胞の単細胞シートを得た後、第二の工程は、ケラチン細胞のための培養支持体を、上皮が空気／液体界面に位置することを可能にするグリッド上に配置することからなる。それを空気／液体界面に置くことによって、上皮の生理学的状況を模倣し、それによって上皮の積層を促進することが可能である。

先に説明した両工程のための血清を含む培養培地の組成は、以下の通りである。

・ＤＭＥＭ／ＨＡＭ・Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）（２／１：容量／容量）、
・ウシ胎児血清（１０％容量／容量）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、
・ヒドロコルチゾン（１００μｇ／ｍＬ）（シグマ−アルドリッチ）、
・インスリン（５ｍｇ／ｍＬ）（シグマ−アルドリッチ）、
・ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、
・上皮成長因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）（シグマ−アルドリッチ）、および
・コレラ毒素（０．１ｎＭ）（シグマ−アルドリッチ）。

２０日の増殖の後、サンプルをクライオミクロトームにより切断した。５〜１５μｍの切断片を、冷メタノールおよび４％パラホルムアルデヒド溶液で固定する。ケラチン１０、ケラチン６、ケラチン１４、インボルクリン、Ｅ−カドヘリン、およびインテグリンβ１の特異的なマウス抗体を用いて、間接免疫蛍光による標識が得られた。使用された二次抗体は、フルオレセインの誘導体（ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート）と結合されたヤギにおいて得られた抗マウス抗体である。核ＤＮＡは、色素であるヘキスト３３３４２（シグマ−アルドリッチ）でマークされた。

被覆組織代替物の組織学的分析は、多孔質マトリックス支持体上に成長した幾つかの細胞層を含む表皮の存在、並びに真皮区画における繊維芽細胞の存在を明らかにする。ＤＮＡをラベルすることによって、ケラチン細胞の形態学が評価される。多孔質マトリックス上に形成された表皮上部層の殆どの細胞は、紡錘体形状で且つ平坦化された核を含んでいる。この形態学は、顆粒層を含むケラチン細胞を特徴としている。これらの所見は、多孔質マトリックス表面をコロニー形成した後のケラチン細胞が、最終分化プログラムに従事しており、それによって成長の２０日後に積層された表皮を形成することを示している。

免疫組織学によるこの表皮の特徴付けは、表皮の異なる特異的マーカーが存在するとの結論を提供する。

実施例５： 被覆組織代替物のインビボでの組込み
実施例１．３で合成したＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０多孔質マトリックス、ラット１型コラーゲン、およびヒト真皮繊維芽細胞からなる真皮均等物、並びに障壁の役割を果たす多層ヒト上皮を含む皮膚代替物を作製した後に、この被覆組織代替物をインビボで一体化する可能性を評価することが不可欠であるように思える。

この観点で、被覆組織のこの型の代替物のサンプルが、ヌードマウス（ヒト細胞の拒絶を回避するために免疫抑制されたマウス）の背中に、皮膚代替物に対応する大きさ（W×１：７ｍｍ×７ｍｍ）でマウス皮膚の断片を切取った後に移植された。被覆組織代替物の移植および治癒は、２７日の期間に亘って行われた。何よりもまず、我々は移植後4日に、移植片の輪郭が炎症を起こし、該代替物の上皮表意面は移植前と同じ色を維持することを観察した。移植の２７日後には、該代替物の周囲において血管ネットワークが組織化され、それをコロニー形成するように見える。従って、この代替物は、創傷の傷口のマウスケラチン細胞のための良好な遊走支持体のように思える。このコロニー形成は、マウスが該被覆組織代替物を拒絶しなかったことを示している。

全ての実施例は、ＰＬＡ_５０−ＰＥＧ−ＰＬＡ_５０で作製された多孔質マトリックスが、被覆組織代替物および／または生体活性包帯材として使用するための間充織代替物を形成できることを示している。

本発明による多孔質マトリックスのインビトロ分解試験の結果を示すグラフである。 本発明による多孔質マトリックスのインビボ分解試験の結果を示すグラフである。 本発明による多孔質マトリックス上での真皮繊維芽細胞の増殖実験の結果を示すグラフである。 本発明による多孔質マトリックス上での歯肉繊維芽細胞の増殖実験の結果を示すグラフである。 本発明による支持体上でのケラチン細胞増殖試験の結果を示すグラフである。

Claims (24)

1. 生体適合性で且つ生分解性の多孔質マトリックスであって、式（Ｉ）に適合する三つのブロックが連続した共重合体を含んでなることを特徴とし、
   Ｘ−Ｇ−Ｙ （Ｉ）
   ここで、
   Ｇは、ｐの反復ユニットを含むポリエチレングリコールブロックであり、ここでのｐは、１５０〜７００まで変化する数であり、
   ＸおよびＹは、同一または異なり、ラクチドモノマーから誘導されるホモポリマーブロックを表し、ＸおよびＹは各々がｎおよびｍ反復ユニットを含んでおり、ｎおよびｍの各々は、４５１〜３，５００で変化する数であり、
   また、２０〜５００μｍで変化する直径をもった孔を含んでなることを特徴とするマトリックス。
2. 請求項１に記載のマトリックスであって、ｎおよびｍは、４５１〜３，０００で相互に独立に変化することを特徴とするマトリックス。
3. 請求項１または２に記載のマトリックスであって、ｐは、１８０〜６５０で変化することを特徴とするマトリックス。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載のマトリックスであって、（ｍ＋ｎ）／ｐの比は、０．４８〜４７の間であることを特徴とするマトリックス。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のマトリックスであって、（ｍ＋ｎ）／ｐの比は、０．６０〜３３の間であることを特徴とするマトリックス。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載のマトリックスであって、前記ポリエチレングリコールポリマーブロックＧは、式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯＨを有し、ここでのｐは、２００〜６００で変化することを特徴とするマトリックス。
7. 請求項１〜６の何れか１項に記載のマトリックスを製造する方法であって、請求項１〜６の何れかに定義された共重合体を調製するための少なくとも一つのステップと、その後に、それによって調製された共重合体内に孔を形成するためのステップとを含んでなることを特徴とする方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記孔形成ステップが、孔形成材として炭酸水素アンモニウムを含んでなる粒子を適用することを特徴とする方法。
9. 請求項１〜６の何れか１項に記載の少なくとも一つのマトリックス、および少なくとも一つの生体適合性で且つ生分解性の新規な充填材を含んでなることを特徴とする、結合組織の足場。
10. 請求項９に記載の足場であって、前記充填材が、コラーゲンおよび／またはフィブリンを含有する生物学的または非生物学的材料から選択されることを特徴とする足場。
11. 請求項１０に記載の足場であって、前記充填材は、凝集したフィブリンに富む血漿であることを特徴とする足場。
12. 請求項１０に記載の足場であって、前記充填材がコラーゲンゲルであることを特徴とする足場。
13. 結合組織を再構築するため、および／または治癒のために有用な間充織代替物であって、内皮細胞および／または繊維芽細胞が付随した、請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックス、または請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の足場を含んでなることを特徴とする間充織代替物。
14. 請求項１３に記載の間充織代替物を製造する方法であって、請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックス、または請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の足場を内皮細胞および／または繊維芽細胞と接触させる工程、および、次いで細胞を増殖させる工程を含んでなることを特徴とする方法。
15. 被覆組織代替物であって、上皮細胞が付随した、請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックス、または請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の一つの足場、または請求項１３に記載の一つの間充織代替物を含んでなることを特徴とする被覆組織代替物。
16. 請求項１５に記載の被覆組織代替物を製造する方法であって、請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックス、または請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の足場を内皮細胞および／または繊維芽細胞と接触させる工程、および、次いで細胞を増殖させる工程を含んでなることを特徴とする方法。
17. 請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックスの使用であって、請求項１３に記載の間充織代替物またはその均等物を得るための使用。
18. 請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の足場の使用であって、請求項１３に記載の間充織代替物またはその均等物を得るための使用。
19. 請求項１３に記載の間充織代替物の使用であって、請求項１５に記載の被覆組織代替物を得るための使用。
20. 請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックス、請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の足場、請求項１３に記載の間充織代替物、または請求項１５に記載の被覆組織代替物の使用であって、皮膚を修復すること、および／または治癒を促進するための生体活性な包帯材を調製することを目的とした材料を調製するための使用。
21. 請求項１〜６の何れか１項に記載の多孔質マトリックス、請求項９〜１２の何れか１項に記載の結合組織の足場、請求項１３に記載の間充織代替物、または請求項１５に記載の被覆組織代替物の使用であって、インビトロ診断試験を行うことを目的とした使用。
22. 請求項２に記載のマトリックスであって、ｎおよびｍは、４５１〜２，５００で相互に独立に変化することを特徴とするマトリックス。
23. 請求項３に記載のマトリックスであって、ｐは、２００〜６００で変化することを特徴とするマトリックス。
24. 請求項５に記載のマトリックスであって、（ｍ＋ｎ）／ｐの比は、１〜２５の間であることを特徴とするマトリックス。

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