KR100737167B1

KR100737167B1 - 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체의 제조 방법

Info

Publication number: KR100737167B1
Application number: KR1020060054236A
Authority: KR
Inventors: 김수현; 정영미; 정기철; 김상헌
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2006-06-16
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2007-07-10

Abstract

본 발명은 다공성 뼈-연골 복합 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 뼈-연골 복합 지지체는 뼈 재생층과 연골 재생층이 다층 구조를 이룬 형태의 다공성 지지체로서, 생체적합성 고분자, 생리활성형 세라믹과 공극형성물질을 혼합, 압착 및 가열하여 제조한 뼈 재생층과 용매에 생체적합성 탄성 고분자를 용해시킨 후 공극형성물질을 첨가한 후 겔화시킨 연골 재생층 형성용 혼합물을 함께 압착 성형한 후, 용매와 공극형성물질을 제거하는 공정으로 제조된다. 본 발명에 따르면 뼈와 연골의 재생에 적합한 생리활성과 기계적 강도를 가지는 다층 구조의 다공성 복합 지지체를 간단한 공정으로 얻을 수 있고, 얻어진 지지체는 공극 형태가 균일하고 공극간 상호 연결도가 우수한 특징을 가진다.

뼈-연골 복합지지체, 생리활성 세라믹, 탄성 생분해성 고분자, 조직공학용 다공성 지지체, 지지체 제조 방법

Description

조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING OF A POROUS OSTEOCHONDRAL COMPOSITE SCAFFOLD}

도 1은 비교예 1에서 제조한 폴리락타이드 지지체 표면의 전자주사현미경 사진.

도 2는 비교예 1에서 제조한 폴리락타이드 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 3은 실시예 1에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 표면의 전자주사현미경 사진.

도 4는 실시예 1에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 5는 실시예 1과 비교예 1에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체의 수은 다공도 분석기에 의한 다공도 분포 그래프.

도 6은 실시예 1과 비교예 1에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체의 인장 강도를 측정한 그래프.

도 7은 실시예 1과 비교예 1에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체를 친수성 염료로 염색하여 표면에 노출된 트리칼슘포스페이트를 확인한 사진.

도 8은 실시예 2에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 표면의 전자주사현미경 사진.

도 9는 실시예 2에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 10은 실시예 3에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 표면의 전자주사현미경 사진.

도 11은 실시예 3에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 12는 실시예 4에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 표면의 전자주사현미경 사진.

도 13은 실시예 4에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 14는 실시예 5에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 표면의 전자주사현미경 사진.

도 15는 실시예 5에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 16은 실시예 6에서 제조한 뼈-연골 복합체 재생을 위한 지지체의 모형도.

도 17은 실시예 6에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트/(락타이드/ε-카프로락톤 공중합체) 복합 지지체 단면의 전자주사현미경 사진.

도 18은 실시예 6에서 제조한 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트/(락타이드/ ε-카프로락톤 공중합체) 복합 지지체 단면에서 접합면을 확대한 전자주사현미경 사진.

본 발명은 다공성 뼈-연골 복합 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 생리활성형 세라믹이 표면에 잘 노출되어 있고 우수한 기계적 강도를 가지는 뼈 재생층과 실제 연골과 유사한 탄성을 가지는 연골 재생층이 상호연결되어 있어 뼈와 연골의 복합 재생이 가능한 뼈-연골 복합 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

매년 전 세계에서 많은 사람들이 질환, 사고, 선천성 이상이나 결손 등의 이유로 조직(tissue)을 잃거나 말기 장기부전(organ failure)을 겪는다. 예를 들면, 미국의 경우 1년에 조직이나 장기에 문제가 생긴 환자의 수가 수백만 명에 이르며 관련 시장의 규모는 약 350조원으로 추산된다.

골격계 조직 손상 환자는 인구의 노령화로 인하여 급증하고 있는 추세이고 새로운 면역 억제제의 개발, 마취 및 수술 기법의 발달로 인해 장기 이식이 급속도로 확산되고 있으나, 기증되는 조직 및 장기의 수 부족과 이식 거부반응이 심각한 문제로 대두되고 있다.

따라서, 최근에 손상되었거나 기능을 상실한 환자 자신의 조직이나 장기에서 세포를 일부 채취하여 생체적합성 고분자 지지체(scaffold)를 이용해 체외에서 배 양한 다음 체내의 원래 위치에 이식하여 조직이나 장기를 복원, 재생 또는 대체하는 조직공학(tissue engineering)이 크게 각광받고 있다.

1987년 미국과학재단(NSF)이 주최하는 의공학 관련 토론회에서 처음으로 조직공학이란 용어가 사용되었는데, 의학, 공학 및 생명과학의 다학제간 협동/공동 연구가 필수적인 응용과학기술의 하나이다. 조직공학기법을 이용하면 장기이식에 부족한 제공자(donor) 문제를 해결할 수 있고 면역반응, 감염, 세포괴사, 암 유발의 위험 없이 인체의 거의 모든 조직과 장기(피부, 뼈, 연골, 근육, 각막, 판막, 혈관, 심장, 간, 췌장, 창자, 방광, 요도, 신경계 등)를 재생할 수 있다는 장점이 있다. 현재, 인공피부와 인공연골은 상품화되고 있다.

연골 제조와 관련하여서는, 시험관, 배양기 등과 같은 인공적 환경인 3차원 담체 구조체에서 제작하거나(Minas et al., Articular Cartilage Defects, 1997, 20(6), 525-538, 국제공개 제94/20151호, 국제공개 제95/33821호), 지지체/세포 혼합물을 이용한 인 비보(in vivo)에서 제작하는 것이(미국특허 제5041138호, 국제공개 제90/12603호, 국제공개번호 제97/30662호) 연구된 바 있다.

인공뼈 제조와 관련하여서는, 뼈 대체물로 고분자, 세라믹, 금속 등의 재료를 사용하였으나 일정 시간 경과 후 별도의 제거 수술을 해야 한다는 단점이 있어 생분해성과 다공성을 가지는 3차원 지지체를 이용하는 조직공학적인 방법으로 대체하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

예를 들어, 덱사메타손과 비타민 C를 서서히 방출하는 생분해성 다공성 지지체(Kim et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 332(4), 1053-1060), 하이드록시아파타이트 다공성 세라믹 지지체로 제조된 뼈 대체재(대한민국 특허공개 제2000-2933호 및 제2002-0014034호) 등이 개발되었다.

뼈를 구성하는 경골조직은 골세포로 이루어져 있고 풍부한 골기질 속에 묻혀 있다. 골기질은 골화(骨化) 과정에서 급속하게 단단하고 불투명한 칼슘의 인산염 및 탄산염이 된다. 골세포는 불규칙한 성상(星狀)을 이루고 있는 가느다란 원형질 돌기로 이웃하는 다른 골세포와 서로 연결되어 있다. 연골은 발생학적으로 경골조직과 같은 중배엽에서 기원한 조직으로, 뼈와 함께 내골격을 형성한다. 이처럼 연골과 뼈는 유기적으로 작용하는 조직이지만, 종래의 연골과 뼈의 조직공학적 치료는 이들을 각각 치료하였다.

이런 점을 개선하여 뼈와 연골을 동시에 치료할 수 있는 지지체 개발에 대한 연구가 일부 진행되었다.

연골부분의 폴리글리콜산(PGA: poly(glycolic acid)) 지지체와 뼈부분의 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체(PLGA/PEG: poly(lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) 지지체 상에 각각의 세포를 따로 배양하고 두 지지체를 봉합사를 이용하여 붙여서 제조한 복합 지지체(Schaefer et al., Biomaterials, 2000, 21, 2599-2606), PLGA로 만든 천에 각각의 세포를 여러 장에 배양하고 봉합사로 붙여 제조한 복합 지지체(Guoping Chen et al., Materials Science and Engineering C 26 (2006) 124.129) 및 콜라겐/PLGA 스펀지 지지체(Guoping Chen et al., Materials Science and Engineering C 26 (2006) 118.123) 등이 시도되었으나, 우수한 효과를 가지는 뼈와 연골의 복합 재생용 지지체의 개발이 여전히 요구 되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 뼈와 연골 조직의 동시 재생이 가능하도록 각 층이 연골과 뼈 재생에 적합한 생리활성과 기계적 강도를 가지는 층상 구조의 다공성 지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, (i) 생체적합성 고분자와 생리활성형 세라믹을 포함하고 상기 세라믹이 표면에 노출되어 있는 다공성 뼈 재생층 및 (ⅱ) 생체적합성 탄성 고분자를 포함하는 다공성 연골 재생층을 포함하는, 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체를 제공한다.

본 발명에서는 또한, (ⅰ) 생체적합성 고분자, 생리활성형 세라믹 및 공극형성물질을 혼합하는 단계, (ⅱ) 단계 (ⅰ)에서 얻어진 혼합물을 주형에서 압착 성형하는 단계, (ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 얻어진 성형물을 가열 접합하여 다공성 뼈 재생층을 형성하는 단계, (ⅳ) 단계 (ⅲ)에서 형성된 뼈 재생층의 한쪽 면에, 용매에 생체적합성 탄성 고분자를 용해시킨 후 공극형성물질을 첨가한 후 겔화시킨 연골 형성용 혼합물을 부어준 후 압착 성형하여 복합 성형물을 얻는 단계, 및 (ⅴ) 단계 (ⅳ)에서 얻어진 복합 성형물 내의 용매와 공극형성물질을 제거하는 단계를 포함하는, 상기 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체는, 구조와 성질이 상이한 층상 구조를 가지는 지지체로서 뼈 재생층과 연골 재생층을 포함한다.

보다 구체적으로, 상기 뼈 재생층은 생체적합성 고분자와 생리활성형 세라믹으로 이루어지며 뼈 재생에 적합하도록 세라믹이 표면에 노출되어 있고 높은 기계적 강도를 가지는 반면, 상기 연골 재생층은 탄성 고분자로 이루어지며 연골 재생에 적합한 탄성과 기계적 강도를 가진다.

본 발명의 뼈-연골 복합 지지체는 뼈 또는 연골 재생에 적합하도록 상이한 구조와 특성을 가지는 층으로 이루어지지만, 각 층이 폐쇄적으로 존재하는 것이 아니라 유기적으로 연결되어 있다. 따라서, 각 층간 물질전달이 원활하여 세포의 점착과 증식 유도에 유리하고 3차원적인 조직재생에 적합하다.

상기한 본 발명의 뼈-연골 복합 지지체는 유기용매를 사용하지 않은 비용매 공정으로 뼈 재생층을 제조하고, 제조된 뼈 재생층의 한쪽 면에 연골 재생층을 복합화시키는 방법으로 제조된다.

이때, 뼈 재생층은 생체적합성 고분자 분말, 생리활성형 세라믹 분말 및 공극형성물질을 혼합하고, 얻어진 혼합물을 주형에서 압착 성형한 후 얻어진 성형물을 가열 접합하는 방법으로 제조된다.

본 발명의 뼈 재생층에 사용되는 고분자는 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는 생체적합성 고분자로, 바람직하게는 일정 기간 후에는 자발적으로 분해되는 고분자이다. 이러한 생체적합한 생분해성 고분자로는 폴리락타이드, 폴리글라이콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리트리메틸렌카보네이트, 폴리아미 노산, 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌옥사이드 및 이들의 공중합체 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 뼈 재생층에 사용되는 세라믹은 지지체에 접종된 세포의 뼈 분화를 유도하고 체내 이식 후에도 주변 조직으로부터 뼈 분화를 전도 및 유도할 수 있는 생리활성형 세라믹이다. 이러한 세라믹으로는 모노칼슘포스페이트, 트리칼슘포스페이트, 칼슘메타포스페이트 등의 칼슘포스페이트 계열, 옥시아파타이트, 하이드록시아파타이트 등의 아파타이트(apatite) 계열 화합물을 예로 들 수 있다.

상기 고분자와 세라믹이 균일하게 혼합되어 지지체 내에서 균일하게 분포하고 세포와의 접촉면적을 최대화하여 효과적인 생리활성을 수행하기 위해서는, 적절한 입자 크기를 가지는 고분자와 세라믹을 사용하여야 한다. 고분자와 세라믹 입자 크기는 바람직하게는 10 내지 800 ㎛이며, 복합 지지체와 전체 크기를 고려하여 선택하도록 한다.

또한, 본 발명에 따른 뼈 재생층에서 세라믹과 고분자의 함량비는 지지체의 뼈 유도 활성과 재생 속도 및 지지체의 강도를 고려하여 조절하도록 한다. 고분자와 세라믹은 95:5 내지 20:80의 중량비로 혼합하는 것이 바람직이다. 세라믹의 함량이 너무 낮으면 뼈 재생 효과가 낮고, 세라믹 함량이 너무 높으며 지지체 골격이 잘 형성되지 않아서 지지체의 기계적 강도가 약해지게 된다.

상기한 뼈 재생층을 제조하기 위하여 우선, 상기 고분자과 세라믹을 일정 비율로 균일하게 혼합한 후 공극형성물질을 균일하게 혼합하여 고압에서 압착하여 성형한다. 압착시는 50 내지 150 MPa, 보다 바람직하게는 100 내지 150 MPa의 압력 으로 가압하도록 한다. 50 MPa 미만의 압력에서는 입자 사이의 물리적 접합력이 매우 취약하여 성형물이 일정 형태를 유지하지 못하고 부서지게 되고 150 MPa을 초과하는 압력에서는 공극형성물질의 입자 크기가 일정하게 유지되지 못하고 부스러지게 된다.

다음, 압착 성형하여 얻은 상기 성형물을 가열 접합함으로써 뼈 재생층을 제조한다. 상기 성형물의 가열 접합에 적합한 온도와 시간은 고분자의 종류, 고분자와 세라믹의 함량비 등의 조건에 따라 조절되며 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직한 가열 접합 온도는 고분자의 용융 온도와 비슷한 온도로, 예를 들어, 폴리락타이드는 용융 온도 180℃ 근처인 190 내지 210 ℃이다. 또한, 바람직한 가열 접합 시간은 15 내지 60분이다.

접합 온도와 접합 시간이 상기 범위를 초과하면 가해지는 열량이 증가하게 되므로 생분해성 고분자 입자가 용융되면서 지지체 표면에 필름이 형성된다. 따라서, 공극형성물질이 제거되지 못하고 세라믹 입자가 용융된 고분자 용액에 의해 코팅되어 세라믹 입자와 세포가 직접적으로 접촉되지 못하므로 뼈 유도가 효과적으로 이루어지지 않는다. 한편, 접합 온도와 접합 시간이 상기 범위 미만이면, 고분자 입자가 불완전하게 접합되어 공극형성물질의 용해시에 그 형태를 유지하지 못하게 되는 문제점이 있다.

상기 방법으로 제조된 뼈 재생층은 성형물 내부의 공극형성물질을 제거한 후 단독으로 뼈 재생용 지지체로 사용될 수도 있다.

이와 같이 압착된 고분자 입자, 세라믹 입자와 공극형성물질로 이루어진 두 꺼운 높이를 가지는 성형물을 적절한 접합 온도에서 접합한 후 증류수로 공극형성물질을 제거하고, 적절한 접합 온도에서 다시 접합시킨 후 공극형성물질을 제거하는 방법을 수회 반복하면, 지지체 내부에서 입자들 간의 접합이 유도되면서 15 내지 100 mm 범위의 두꺼운 높이를 가지는 지지체의 제조도 가능하게 된다.

또한, 상기 제조된 뼈 재생층을 연골 재생층 형성용 혼합물과 복합화시키면 뼈-연골 복합 재생용 지지체를 제조할 수 있다.

상기 복합화 과정을 보다 구체적으로 살펴보면, 상기 뼈 재생층을 주형에 넣고 연골 재생층 형성용 혼합물을 부어준 후 압착 성형하는 공정이다. 이 때, 뼈 재생층에 연골 재생층 형성용 혼합물을 붓기 전에, 뼈 재생층에 공극형성물질을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 경우, 뼈 재생층과 연골 재생층 간의 공극간 상호 연결도를 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 연골 재생층 형성용 혼합물은 용매에 생체적합성 탄성 고분자를 용해시킨 후 공극형성물질을 첨가한 후 이를 겔화하는 공정으로 준비한다. 겔화 공정은 예를 들면, 용매를 증발시키는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 연골 재생층 형성에 사용되는 생체적합성 탄성 고분자로는 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체, 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체 등을 예로 들 수 있다. 이들 공중합체의 중량 평균 분자량(M_w)는 10,000 내지 500,000 범위인 것이 바람직하다. 분자량이 10,000 미만인 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 또는 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체로부터 제조된 지지체는 기계적 강도가 낮고, 분자량이 500,000을 초과하면 연골 재생에 적합한 고탄성의 물성을 얻을 수 없고 생분해 시간도 길어지게 된다.

상기 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체의 단량체의 바람직한 몰비는 락타이드:ε-카프로락톤이 2.0:8.0 내지 8.0:2.0이고, 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체에서 단량체의 바람직한 몰비는 글리콜라이드:ε-카프로락톤이 2.0:8.0 내지 8.0:2.0이다. 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 또는 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체에서 락타이드 몰 비율이 80 ％를 초과하면 공중합체의 모듈러스가 지나치게 높아져서 제조된 다공성 지지체가 너무 뻣뻣하게 되고, 20 ％ 이하이면 너무 부드러워 지지체의 구조가 붕괴하게 된다.

또한, 연골 재생층 형성에 사용되는 용매는 고분자를 용해시킬 수 있는 용매이면 특별히 제한되지 않으며, 클로로포름, 메틸 클로라이드, 테트라하이드로퓨란, 아세트산 등을 예시할 수 있다.

이 때, 연골 재생층 형성용 혼합물은 혼합물의 총 중량을 기준으로 10 내지 50 중량%의 용매를 포함하도록 겔화시켜서 뼈 재생층과 함께 압착 성형하도록 한다. 용매 비율이 10 중량% 미만이면 고분자 용액과 공극형성물질과의 연결이 양호하지 못하여 기계적 강도가 매우 약하여 다루기 어렵고 공극형성물질 용해시 일정한 형태를 유지하지 못하고 부스러지게 된다. 반면, 용매 비율이 50 중량%를 초과되면 지지체 표면에 필름이 형성되면서 막힌 공극이 형성되고 이로 인해 공극간 상호 연결성이 현저히 떨어지며 공극형성물질의 제거가 어렵게 된다.

상기한 뼈 재생층과 연골 재생층 형성용 혼합물의 압착 성형시, 25 내지 100 MPa, 보다 바람직하게는 35 내지 100 MPa의 압력으로 가압하도록 한다. 25 MPa 미만의 압력에서는 입자 사이의 물리적 접합력이 매우 취약하여 일정한 형태를 유지하지 못하면서 성형물이 부서지게 되고 100 MPa 초과의 압력에서는 연골 재생층 형성용 혼합물이 뼈 지지체 쪽으로 스며들어, 연골 재생층과 뼈 재생층의 경계면이 모호해지고 형태가 균일하지 않게 되기 때문이다.

상기한 뼈 재생층과 연골 재생층 형성용 혼합물을 압착 성형하여 제조한 복합 성형물은 진공 건조시키는 방법으로 성형물 내 용매를 제거하고, 물로 세척하여 공극형성물질을 제거하여 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체를 제조하도록 한다.

이와 같이 제조된 다공성 뼈-연골 복합 지지체의 직경 및 지지체의 뼈 재생층과 연골 재생층의 각 층별 높이는 결손된 뼈와 연골의 크기 등을 고려하여 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법으로 제조한 다공성 뼈-연골 복합 지지체는 공극 크기가 일정하고 공극간 상호연결성이 높은 형태를 가지고 적정 수준의 기계적 강도를 가져야 한다. 지지체의 공극 크기와 다공도가 지지체의 형태와 기능에 미치는 효과를 살펴보면 다음과 같다.

다공성 뼈-연골 복합 지지체로서의 역할 수행에 바람직한 공극 크기는 1 내지 800 ㎛이다. 공극 크기가 1 ㎛ 미만이면 지지체 내에서 공극형성물질의 추출이 어렵고 지지체 내부의 상호연결성이 양호하지 않다는 단점을 가지고, 공극 크기가 800 ㎛를 초과하면 지지체의 기계적 강도가 매우 약하다는 단점을 가진다. 지지체 의 공극 형태와 기계적 강도를 모두 고려할 때, 바람직한 공극 크기는 30 내지 800 ㎛이고, 보다 바람직한 공극 크기는 50 내지 500 ㎛이다.

또한, 다공성 뼈-연골 복합 지지체로서 역할 수행에 바람직한 다공도는 40 내지 97 %이다. 다공도가 40％ 미만이면 공극의 상호연결성이 크게 떨어지는 단점을 가지고, 97 ％를 초과할 때는 기계적 강도가 매우 약하다는 단점을 가진다. 지지체의 공극 형태와 기계적 강도를 모두 고려할 때, 바람직한 다공도는 50 내지 97%이고, 보다 바람직한 다공도는 70 내지 95％이다.

상기에서 살펴본 지지체의 공극 크기 및 다공도는 지지체 제조시 첨가되는 공극형성물질의 종류와 양으로 조절 가능하다. 지지체 제조에 사용되는 공극형성물질로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 등과 같은 결정성 염류, 수산화나트륨, 수산화칼슘 등과 같은 결정성 수산화물, 및 설탕, 녹말 등과 같은 수용성 다당류를 예로 들 수 있다.

상기한 공극형성물질의 바람직한 입자 크기는 10 내지 800 ㎛이다. 공극형성물질의 입자 크기가 10 ㎛ 미만이면 지지체에서 폐쇄된 공극이 형성되어 지지체 내 공극형성물질의 잔존 가능성이 매우 높고, 공극형성물질의 크기가 800 ㎛를 초과하면 고분자 입자의 접착이 용이하지 않게 된다.

첨가되는 공극형성물질의 양은 지지체의 다공도를 고려하여 결정하는데, 뼈 재생층 제조시에는 생체적합성 고분자, 생리활성형 세라믹과 공극형성물질의 총 중량을 기준으로 40 내지 97 중량%로 첨가하는 것이 바람직하고, 연골 재생층 제조시에는 생체적합성 탄성고분자와 공극형성물질의 총 중량을 기준으로 40 내지 97 중 량%로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 따라 다공성 뼈 재생층과 연골 재생층 형성용 혼합물의 복합화에 의해 제조된 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체의 각 층은 뼈와 연골 재생에 적합한 특성을 가진다. 구체적으로 살펴보면, 뼈 재생층은 뼈 재생을 위한 생리활성 세라믹이 표면에 잘 노출되어 있고 기계적 강도가 우수하여 뼈 재생에 적합하고, 연골 재생층은 실제 자연연골과 유사한 고탄성의 기계적 물성을 가지고 있어 연골 재생에 적합한 특성을 가진다. 또한, 두 재생층 간의 공극간 상호 연결도가 우수하여 영양 공급 및 물질의 전달이 원활히 이루어질 수 있으므로 뼈-연골의 복합 재생에 유리하다.

또한, 본 발명의 뼈-연골 복합 지지체에서 뼈 재생층은 유기용매를 사용하지 않는 비용매 제조법으로 고분자 지지체로 제조되기 때문에 제조 과정이 간단하다는 장점을 가진다.

이하, 본 발명을 다음의 비교예 및 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

비교예 1

중량 평균 분자량(M_w)이 110,000이고 입자 크기가 30-40 ㎛인 폴리락타이드 분말을 클로로포름 용액에 5 ％(무게/부피 비)가 되도록 혼합하고 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시켜 고분자 용액을 제조하였다. 제조된 고분자 용액을 바이알에 넣은 후 용해된 고분자와 동일 중량의 트리칼슘포스페이트을 넣고, 입자의 직경이 300-500 ㎛인 염화나트륨을, 염화나트륨, 폴리락타이드와 트리칼슘포스페이트의 총 중량을 기준으로 95 중량%가 되도록 넣어 소용돌이 혼합기(Voltex mixer)를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 준비된 주형에 상기 혼합된 용액을 붓고 72시간 동안 용매를 완전히 건조시켰다. 용매가 모두 증발된 후, 증류수를 3일 동안 9회 정도 교환하여 시편 내부에 존재하는 염화나트륨을 완전히 제거하고 시편을 동결 건조하는, 미세분말 석출법으로 다공성 지지체를 제조하였다.

상기의 미세분말 석출 방법으로 제조된 지지체의 다공도는 94 ％이고 공극의 직경은 180-440 ㎛였다. 또한, 제조된 다공성 지지체의 외부 표면과 내부 단편을 전자주사현미경으로 관찰하여 도 1과 도 2에 각각 나타내었다. 도 1과 도 2로부터 공극이 대부분 폐쇄되어 있는 것을 확인할 수 있다.

실시예 1

중량 평균 분자량(M_w)이 110,000이고 입자 크기가 30-40 ㎛인 폴리락타이드 분말과 입자 크기가 100-300 ㎛인 트리칼슘포스페이트 분말을 중량비 기준으로 5:5가 되도록 하여 혼합하고, 여기에 입자의 직경이 300-500 ㎛인 염화나트륨을, 염화나트륨, 폴리락타이드와 트리칼슘포스페이트의 총 중량을 기준으로 93 중량%가 되도록 균일하게 혼합하였다.

상기 혼합물을 직경 13mm 주형에 넣고 이를 유압 프레스를 이용하여 85 MPa 압력으로 압착하여 폴리락타이드/트리칼슘포스페이트/염화나트륨 시편을 제조하였다. 제조된 시편을 210 ℃에서 30분 동안 오븐에서 접합시켰다. 폴리락타이드 분 말이 접합된 시편을 증류수를 3일 동안 9회 정도 교환하여 시편 내부에 존재하는 염화나트륨을 완전히 제거하고 시편을 동결 건조하여 뼈 재생용 다공성 지지체를 제조하였다. 제조된 다공성 지지체의 무게를 측정하여 지지체에서의 염화나트륨 제거를 확인하였다.

상기 방법으로 제조된 뼈 재생용 다공성 지지체의 외부 표면과 내부 단면을 주사전자현미경(Scanning electron microscopy)으로 관찰하고 그 결과를 각각 도 3과 도 4에 나타내었다. 도 3과 도 4로부터, 본 발명의 방법에 따라 제조된 뼈 재생용 다공성 지지체는 형태가 매우 균일하며 공극의 연결도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.

또한, 비교예 1의 미세분말 석출법으로 제조된 지지체와 본 발명의 비용매법으로 제조된 지지체의 공극 크기별 분포를 수은 다공도 분석기로 비교하여 도 5에 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 방법으로 제조된 지지체의 공극의 크기가 매우 균일한 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 방법으로 제조된 지지체의 다공도는 93 ％이고 공극의 크기는 230-400 ㎛였다.

또한, 비교예 1의 방법으로 제조된 지지체와 본 발명의 방법으로 제조된 지지체의 인장강도를 고기능 시험기(univertial testing machine)인 인스트론(Instron)을 이용하여 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6으로부터, 본 발명의 방법에 따라 제조된 지지체가 기존의 미세분말석출법으로 제조된 지지체 비해 약 5배 높은 기계적 강도를 가짐을 알 수 있다.

또한, 비교예 1의 방법으로 제조된 지지체와 본 발명의 방법으로 제조된 지 지체를 친수성 염료(Pilot liquid ink, black)를 사용하여 염색하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7로부터, 본 발명의 방법으로 제조된 지지체는, 트리칼슘포스페이트 입자가 지지체 표면 바깥쪽으로 잘 노출되어 있어 뼈의 재생에 적합한 것을 확인할 수 있다.

실시예 2

실시예 1의 방법과 동일하게 뼈 재생용 다공성 지지체를 제조하되, 폴리락타이드 분말과 트리칼슘포스페이트 분말을 중량비 기준으로 9:1이 되도록 혼합하고 205 ℃에서 15분 동안 접합하였다. 상기 방법으로 제조된 지지체의 외부 표면과 내부 단편을 전자주사현미경으로 관찰하고 그 결과를 각각 도 8과 도 9에 나타내었다. 도 8과 도 9로부터, 본 발명의 방법으로 제조된 지지체는 막힌 공극이 거의 존재하지 않은 형태로서 공극의 연결도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.

실시예 3

실시예 1의 방법과 동일하게 뼈 재생용 다공성 지지체를 제조하되, 폴리락타이드 분말과 트리칼슘포스페이트 분말을 7:3의 중량비로 혼합하고 205 ℃에서 20분 동안 접합하였다. 상기 방법으로 제조된 지지체의 외부 표면과 내부 단편을 전자주사현미경으로 관찰하고 그 결과를 각각 도 10과 도 11에 나타내었다. 도 10과 도 11로부터, 본 발명의 방법에 따라 제조된 지지체는 막힌 공극이 거의 존재하지 않은 형태로 공극의 연결도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.

실시예 4

실시예 1의 방법과 동일하게 뼈 재생용 다공성 지지체를 제조하되, 입자 크 기가 300-500 ㎛인 칼슘메타포스페이트를 사용하고 폴리락타이드 분말과 칼슘메타포스페이트 분말을 중량비 기준으로 5:5가 되도록 혼합하여 210℃에서 35분 동안 접합하였다. 상기 방법으로 제조된 지지체의 외부 표면과 내부 단편을 전자주사현미경으로 관찰하고 그 결과를 각각 도 12와 도 13에 나타내었다. 도 12와 도 13으로부터, 본 발명의 방법으로 제조된 지지체는 막힌 공극이 거의 존재하지 않은 형태로 공극의 연결도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.

실시예 5

실시예 1의 방법과 동일하게 뼈 재생용 다공성 지지체를 제조하되, 입자 크기가 20-30 ㎛인 트리칼슘포스페이트를 사용하고 폴리락타이드 분말과 트리칼슘포스페이트 분말을 35:65의 중량비로 혼합하고 205℃에서 15분 동안 접합하였다. 상기 방법으로 제조된 지지체의 외부 표면과 내부 단편을 전자주사현미경으로 관찰하고 그 결과를 각각 도 14와 도 15에 나타내었다. 도 14와 도 15로부터, 본 발명의 방법에 따라 제조된 지지체는 막힌 공극이 거의 존재하지 않은 형태로 공극의 연결도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.

실시예 6

중량 평균 분자량(M_w)이 330,000 이고 몰비가 5:5인 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체를 클로로포름 용액에 4 ％(무게/부피 비)가 되도록 혼합하고 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시켜 고분자 용액을 제조하였다. 얻은 고분자 용액에 입자의 직경이 300-500 ㎛인 염화나트륨을, 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 및 염화나트륨의 총 중량을 기준으로 85 중량%가 되도록 첨가하고 후드 안에서 자석 교반기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 제조된 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체, 염화나트륨 및 클로로포름 혼합 용액의 총 중량을 기준으로 클로로포름이 25 중량%가 될 때까지 클로로포름을 증발시켜서 연골 재생층 형성용 혼합물을 준비하였다.

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 염화나트륨/트리칼슘포스페이트/폴리락타이드 시편을 실시예 1과 동일한 조건으로 열로 접합시킨 후, 시편을 다시 주형에 끼워 넣었다. 층간의 공극 상호 연결성을 향상시키기 위하여 염화나트륨을 넣어준 후, 상기에서 준비한 연골 재생층 형성용 혼합물을 시편 위에 올려놓고 유압프레스를 사용하여 40 MPa의 압력으로 압착하여 (염화나트륨/트리칼슘포스페이트/폴리락타이드)/((락타이드/ε-카프로락톤 공중합체)/염화나트륨) 복합체를 제조하고 진공 오븐 안에서 48시간 동안 방치하여 클로로포름을 완전히 제거하였다. 또한, 증류수를 3일 동안 9회 정도 교환하여 세척함으로써 시편 내부에 존재하는 염화나트륨을 완전히 제거하고 동결 건조하여 뼈-연골 다공성 복합 지지체를 제조하였다. 상기한 방법으로 제조된 복합 지지체의 무게를 측정하여 지지체에서 염화나트륨이 제거되었음을 확인하였다. 그 결과, 지름이 13 mm, 뼈 재생층의 높이가 10 mm이고 연골 재생층의 높이가 3 mm인 복합 지지체를 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 뼈-연골 복합 지지체의 모형도를 도 16에 나타내었다.

상기의 방법으로 제조된 복합 지지체를 주사전자현미경으로 관찰하여 도 17(30배 확대)과 도 18(150배 확대)에 나타내었다. 도 17과 도 18로부터 본 발명 의 방법으로 제조된 복합 지지체의 각 층의 공극의 형태가 매우 균일하고 상호 연결성도 매우 우수하며, 두 층간의 공극의 연결성도 매우 우수한 것을 확인할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명의 방법으로 제조된 뼈-연골 복합 지지체는 뼈와 연골 재생에 적합한 생리활성과 기계적 강도를 가지는 다층 구조의 지지체로서, 공극 형태가 균일하고 공극간 상호 연결도가 우수하여 뼈와 연골의 복합 재생에 유리하게 사용될 수 있고 15 mm 이상의 두꺼운 지지체도 쉽게 제조할 수 있다.

Claims

(i) 생체적합성 고분자와 생리활성형 세라믹을 포함하고 상기 세라믹이 표면에 노출되어 있는 다공성 뼈 재생층, 및

(ⅱ) 생체적합성 탄성 고분자를 포함하는 다공성 연골 재생층

을 포함하는, 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체.
제1항에 있어서, 뼈 재생층의 공극 크기가 1 내지 800 ㎛이고 다공도가 40 내지 97 %인 것을 특징으로 하는, 뼈-연골 복합 지지체.
제1항에 있어서, 연골 재생층의 공극 크기가 1 내지 800 ㎛이고 다공도가 40 내지 97 %인 것을 특징으로 하는, 뼈-연골 복합 지지체.
제1항에 있어서, 생체적합성 고분자가 폴리락타이드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리트리메틸렌카보렌카보네이트, 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌옥사이드 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 뼈-연골 복합 지지체.
제1항에 있어서, 생리활성형 세라믹이 트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 칼슘메타포스페이트, 하이드록시아파타이드, 옥시아파타이드 및 이들의 혼합 물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는, 뼈-연골 복합 지지체.
제1항에 있어서, 뼈 재생층이 생체적합성 고분자와 생리활성형 세라믹을 95:5 내지 20:80의 중량비로 포함된 것을 특징으로 하는, 뼈-연골 복합 지지체.
제1항에 있어서, 생체적합성 탄성 고분자가 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 또는 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체인 것을 특징으로 하는, 뼈-연골 복합 지지체.
제7항에 있어서, 생체적합성 탄성 고분자가 락타이드와 ε-카프로락톤의 혼합 몰비가 2:8 내지 8:2인 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체, 또는 글리콜라이드와 ε-카프로락톤의 혼합 몰비가 2:8 내지 8:2인 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체인 것을 특징으로 하는 뼈-연골 복합 지지체.
(ⅰ) 생체적합성 고분자, 생리활성형 세라믹 및 공극형성물질을 혼합하는 단계,

(ⅱ) 단계 (ⅰ)에서 얻어진 혼합물을 주형에서 압착 성형하는 단계,

(ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 얻어진 성형물을 가열 접합하여 다공성 뼈 재생층을 형성하는 단계,

(ⅳ) 단계 (ⅲ)에서 형성된 뼈 재생층의 한쪽 면에, 용매에 생체적합성 탄성 고분자를 용해시키고 공극형성물질을 첨가한 후 겔화시킨 연골 재생층 형성용 혼합물을 부어준 후 압착 성형하여 복합 성형물을 얻는 단계, 및

(ⅴ) 단계 (ⅳ)에서 얻어진 복합 성형물 내의 용매와 공극형성물질을 제거하는 단계

를 포함하는, 제1항에 따른 조직공학용 다공성 뼈-연골 복합 지지체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 단계 (ⅳ)를 수행하기 전, 단계 (ⅲ)에서 형성된 뼈 재생층에 공극형성물질을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 생체적합성 고분자가 폴리락타이드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리트리메틸렌카보렌카보네이트, 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르, 폴리에틸렌옥사이드 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 생리활성형 세라믹이 트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 칼슘메타포스페이트, 하이드록시아파타이드, 옥시아파타이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 단계 (ⅰ)에서 생체적합성 고분자와 세라믹을 95:5 내지 20:80의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 공극형성물질이 결정성 염, 결정성 수산화물 및 수용성 다량류로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 결정성 염이 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화마그네슘으로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 결정성 수산화물이 수산화나트륨 또는 수산화칼슘인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 수용성 다량류가 설탕 또는 녹말인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 생체적합성 탄성 고분자가 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 또는 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합체인 것을 특징으로 하는 방법
제18항에 있어서, 생체적합성 탄성 고분자가 락타이드와 ε-카프로락톤의 혼합 몰비가 2:8 내지 8:2인 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체, 또는 글리콜라이드와 ε-카프로락톤의 혼합 몰비가 2:8 내지 8:2인 글리콜라이드/ε-카프로락톤 공중합 체인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 용매가 클로로포름, 메틸 클로라이드, 테트라하이드로퓨란, 아세트산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 단계 (ⅳ)에서 용매를 겔 상태의 혼합물의 총 중량을 기준으로 10 내지 50 중량%의 범위로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.