KR20080004486A - 생체 적합 물질 - Google Patents

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KR20080004486A
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앤드류 케이 린
윌리엄 본필드
로나 제이 깁슨
아이오아니스 브이 얀나스
브렌단 에이 할리
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캠브리지 엔터프라이즈 리미티드
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은 무기물 및 유기물을 포함하는 생체 적합 복합 물질 제조방법에 관한 것으로, (a) 액체 캐리어, 무기물 및 유기물을 포함하는 제 1 슬러리 조성물을 제공하는 단계; (b) 슬러리를 위한 모울드를 제공하는 단계; (c) 모울드 내에 슬러리를 침착하는 단계; (d) 모울드 내에 침착된 슬러리를 액체 캐리어가 복수의 고체 결정 또는 입자로 전환되는 온도로 냉각시키는 단계; (e) 승화 및/또는 증발에 의해 복수 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하여, 무기물 및 유기물을 포함하는 다공성 복합 물질이 남도록 하는 단계; 및 (f) 모울드로부터 물질을 분리하는 단계를 포함한다.

Description

생체 적합 물질{BIOMATERIAL}
본 발명은 생물의학적 적용을 위한 합성 뼈 재료, 특히, 콜라겐, 칼슘 포스페이트, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 조직공학용 다공성 모놀리스 및 다공성 적층된 스캐폴드에 관한 것이다.
천연 뼈는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸을 포함하는 비콜라겐성 유기 상, 및 칼슘 포스페이트의 생체복합물이다. 이의 복잡한 계층 구조는 높은 강성, 강도, 및 골절 인성을 포함하는 예외적인 기계적 특성을 유도하고, 매일 뼈에 가해지는 생리적 스트레스에 뼈가 견딜 수 있게 한다. 당해 기술 분야의 연구자들이 당면한 과제는 인체 또는 동물 체내에서 합성 물질에 및 그 주위에 천연 뼈가 성장할 수 있는 조성 및 구조를 지니는 합성 물질을 만들어 낸다는 것이다.
뼈가 신체 환경에서 형성된 뼈-유사 인회석층을 통해 인체 내에서 칼슘 포스페이트에 직접 결합하는 것(생체 활성으로 언급되는 특성)이 관찰되었다. 반면 콜라겐, 및 콜라겐과 글리코스아미노글리칸과 같은 다른 생체유기물질을 포함하는 공중합체가 수많은 세포 타입의 부착 및 증식을 위해 인체내에서 뼈의 생성 및 유지를 위해 필요한 것을 포함하는 최적의 기질인 것으로 알려져 있다.
히드록시인회석은 뼈 대용 물질에서 구성요소로서 가장 일반적으로 사용되는 칼슘 포스페이트이다. 그러나, 이것은 브러사이트, 트리칼슘 포스페이트 및 옥타칼슘 포스페이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 다른 형태에 비하여 비교적 불용성인 물질이다. 인회석의 비교적 낮은 용해성은 신체내에서 재흡수율이 특히 낮기 때문에 생체물질을 제조할 때 불리할 수 있다.
히드록시인회석과 같은 칼슘 포스페이트는 기계적으로 강성인 물질이다. 그러나, 이들은 천연 뼈에 비하여 비교적 부서지기 쉽다. 콜라겐은 기계적으로 인성의 물질이나, 천연 뼈에 비하여 비교적 강성이 낮다. 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공중합체를 포함하는 물질은 콜라겐 단독보다 인성이고 강성이나, 여전히 천연 뼈에 비하여 비교적 낮은 강성을 지닌다.
히드록시인회석 보다 개선된 기계적 인성 및 콜라겐 및 콜라겐과 글리코스아미노글리칸의 공중합체 보다 개선된 강성을 지니는 합성 뼈-대용 물질을 제조하려는 당해 기술분야의 종래 시도로서, 콜라겐 및 인회석을 기계적 혼합에 의해 조합하는 방법이 있다. 상기 기계적 방법은 EP-A-0164 484호에 기재되어 있다.
이후의 기술적 진보로는 히드록시인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 기계적 혼합시키는 것을 포함하여, 뼈-대체 물질을 제조하는 방법이 있다. 이것은 EP-A-0214070호에 기술되어 있다. 상기 문헌은 콜라겐에 콘드로이틴-4-설페이트를 탈수소가열로 가교시키는 것을 추가로 기술한다. 인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 포함하는 물질이 양호한 생체적합성을 지님이 발견되었다. 인회석을 콜라겐, 및 선택적으로 콘드로이틴-4-설페이트와 기계적으로 혼합시켜 본질적으로 인회석의 콜라겐/콘드로이틴-4-설페이트-코팅된 입자를 형성한다. 상기 물질이 인체 또는 동물체내에 존재할 때 생체적합성임에도 불구하고 천연 뼈의 제한된 내증식을 일으키며 합성 물질의 칼슘 포스페이트 상이 개질되지 않음이 발견되었다.
골격부의 재생은 외상, 기형, 또는 질병에 따라 달라질 수 있고, 피부, 신경 및 다른 대부분의 조직 유형과 달리, 골격 결함이 다양하고, 조직 유형(즉, 뼈, 연골조직, 힘줄 및 인대)에 따라 특징적이며, 규칙적인 기계적 하중이 걸리는 위치에 관련되고, 미네랄화된 조직과 미네랄화되지 않은 조직 유형(예컨대, 인대 삽입부, 뼈/연골조직에서의 "최고점(tidemark)") 사이 중간을 가로지르기 때문에 외과 수술에 대한 특별한 도전으로 간주된다.
현재의 임상적 접근방법으로는 재흡수 불가능 인공 임플란트, 자가 또는 동종 이형 조직 이식편, 화학 제제, 세포 이식 또는 이들 방법의 조합에 의한 골격 결을 재생하는 것이다. 이러한 접근 방법들이 단일 조직 타입의 치료에 대하여는 어느 정도 성과가 있었으나, 예컨대, 관절 접합 결함과 같은 미네랄화된 조직과 미네랄화되지 않은 조직 사이 경계면이 관련되는 경우, 기껏해야 불완전한 치료결과를 초래하게 된다. 또한, 현재 치료법 중 가장 성공적인 치료법이라 하더라도 제공 부위로부터 조직의 수확 및/또는 뼈, 연골, 인대 또는 힘줄에 대한 접합을 필요로 한다. 후자는 실행에 어려움이 있고, 접합 구멍을 형성하는 부가적인 결함을 발생하는 데 반하여, 전자의 과정들은 제공 부위의 부족 및 제공 부위의 이환율 때문에 어려움이 있다.
복합 스캐폴드 및 적층 스캐폴드라는 용어는 동의어로서, 각 층이 인접한 다 른 층 또는 층들의 물질 조성과 실질적으로 다른 물질 조성을 가지는 둘 이상의 층을 포함하는 스캐폴드를 의미하며, 단일-적층된 스캐폴드 또는 모놀리스 스캐폴드라는 용어는 동의어로서, 전체적으로 각 층 내의 물질 조성이 대체로 균일한 하나의 층만을 포함하는 스캐폴드를 의미한다.
최근, 연골, 또는 연골 및 뼈와 관련한 관절 접합 결함의 치료를 위한 다공성, 적층 스캐폴드를 적용하는 조직-공학 기법을 개발하기 위하여, 한정된 수의 몇 가지 노력들이 있어왔다. 이러한 연구들은 뼈 및 연골의 재생을 동시에 유발하지만, 각각에 대한 별도의 스캐폴드를 사용한다(Niederauer 등, 2000; .Schaefer 등, 2000; Gao 등, 2001; Gao 등, 2002; Schaefer 등, 2002; Sherwood 등, 2002; Hung 등, 2003; Hunziker 및 Driesang, 2003).
적층된 스캐폴드의 다른 특징은 연골 밑 뼈 판에 뼈 층이 직접 부착되어 접합 부분이 없이 고정 지지될 수 있다는 것이다. 제공된 연골부는 뼈 부분에 강하게 부착되고, 다른 부가의 고정이 필요 없다. 또한 무접합 고정은 뼈에 대해 힘줄 및 인대의 삽입부와 관련한 결함을 치료할 수도 있다. 이러한 새로운 시도의 장점에도, 두 가지 단점으로 인하여 적층된 스캐폴드의 효율성이 제한될 수 있다. 첫 번째 단점은 스캐폴드 각 층에 대해 사용되는 물질에 관한 것이다. 이제까지 재흡수가능한 합성 폴리머가 연골층에 사용되는 유일한 재료였으며, 이러한 스캐폴드의 뼈 부분의 구성성분이었다. 합성 폴리머는 제작이 용이하지만, 세포 결합 및 증식을 촉진하는 데는 콜라겐과 같은 천연 폴리머에 미치지 못하며, 분해될 때 고농도의 산을 더 많이 방출한다. 더욱이, 힘줄 또는 인대 회복이 필요한 경우의 적용에 대하여, 가교가 이루어지는 방식과 무관하게, 재흡수가능한 합성 폴리머는 재활 운동 중에 적용되는 감소된 하중을 견디기에도 부적합한 강도 및 경도를 갖는다.
종래의 적층된 스캐폴드의 두 번째 단점은 각 층간의 경계면에 대한 것이다. 천연 관절 접합 및 힘줄/인대 삽입 지점은 미네랄화된 영역과 미네랄화되지 않은 영역 사이의 콜라겐 섬유의 연속성에 의해 특성화된다. 매끄러운 변이로 생성된 시스템(연질 경계면)은 이들 부위에 대한 필수적인 기계적 안정성을 부여하고, 이는 기계적 결함 없이 생리적 하중을 견딜 수 있도록 한다. 반대로, 현재의 여러 적층 스캐폴드는 두 가지 비유사 물질들 간에 구별되는 경계를 형성하는 경질 경계면을 포함한다. 봉합술(Schaefer 등, 2000), 섬유 접착술(Gao 등, 2001) 및 다른 기술(Gao 등, 2002;, Hung 등, 2003)은 이러한 경계면을 보강하기 위하여 사용되어 왔다. 그러나, 제어된 동물 모델에서 조차 경계면간의 탈착이 보고되고 있다. 또한 이러한 봉합 및 접착술은 민감하고 재생이 매우 어렵다.
콜라겐 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸(GAGs)의 다공성 스캐폴드를 제조하기 위하여, 동결-건조 프로토콜의 파라미터가 제어될 수 있는 수단을 개발하기 위한 연구들이 이루어져 왔다(Yannas 등, 1989; O'Brien 등, 2004; O'Brien 등, 2005; Loree 등, 1989). 이러한 기술들은 공극 크기 및 종횡비와 같은 스캐폴드의 특징이 제어 방식, 외상 또는 상해 부위에서 치유반응에 대한 효과를 나타내는 것으로 알려진 파라미터들을 내에서 변화시키는 거이다. 그러나, 골격 및 근육 골격 결함과 관련한 상처의 치료를 위해서는, 미네랄화되지 않은 콜라겐-GAG 스캐폴드의 특성에 반하여, 뼈의 특성에 근접한 물질 조성 및 기계적 특성이 있는 다공성 스캐 폴드를 제조하기 위한 기술이 개발될 필요가 있다.
본 발명은 종래 분야와 관련된 적어도 일부의 문제점들을 해소하기 위해 고안된 것이다.
본 발명에 따른 무기물 및 유기물을 포함하는 생체 적합 복합 물질 제조방법은
(a) 액체 캐리어, 무기물 및 유기물을 포함하는 제 1 슬러리 조성물을 제공하는 단계;
(b) 슬러리를 위한 모울드를 제공하는 단계;
(c) 모울드 내에 슬러리를 침착(deposit)하는 단계;
(d) 모울드 내에 침착된 슬러리를 액체 캐리어가 복수의 고체 결정 또는 입자로 전환되는 온도로 냉각시키는 단계;
(e) 승화 및/또는 증발에 의해 복수의 고체 결정 또는 입자 중 적어도 일부를 제거하여, 무기물 및 유기물을 포함하는 다공성 복합 물질이 남도록 하는 단계; 및
(f) 모울드로부터 물질을 분리하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 "생체 적합 물질"은 인간 또는 동물의 몸에 생리적으로 적합한 물질을 말한다.
본 명세서에서 "슬러리"는 슬러리, 용액, 현탁액, 콜로이드 및 분산액을 포함한다.
본 명세서에서 "무기물"은 전형적으로 칼슘 포스페이트 물질을 포함한다.
본 명세서에서 "유기물"은 전형적으로 생-유기종, 예컨대 수성 용매에 용해 또는 분산되어 슬러리를 형성할 수 있다. 하나 이상의 알부민, 글리코스아미노글리칸, 하이알루로난, 키토산, 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드가 예가 될 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐이, 선택적으로 글리코스아미노글리칸과 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "콜라겐"은 재조합 인간 (rh) 콜라겐을 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 무기물은 칼슘 포스페이트 물질을 포함하며, 유기물은 콜라겐, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 이는 칼슘 포스페이트 물질 및 콜라겐 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 형성한다. 바람직하게는, 제 1 슬러리가 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 제 1 슬러리가 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물을 포함한다.
또는, 제 1 슬러리가 단순히 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸의 기계적 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 예컨대, EP-A-0164 484 및 EP-A-0214070에 기재된 바와 같은 종래 기술에 의해 제조될 수 있다. 기계적 혼합물이 슬러리를 형성하는 데 사용될 수는 있지만, 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물 또는 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물이 바람직하다.
칼슘 포스페이트 물질은, 예컨대, 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 칼슘 포스페이트 물질은 브러사이트를 포함한다.
슬러리의 pH는 2.5 내지 6.5가 바람직하며, 더 바람직하게는 2.5 내지 5.5이고, 더욱더 바람직하게는 3.0 내지 4.5이며, 3.8 내지 4.2가 가장 바람직하다.
슬러리 조성물은 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 슬러리 조성물은 하나 이상의 칼슘 포스페이트 물질을 포함할 수 있다. 전구체 슬러리 내에 다른 화학종(은, 실리콘, 실리카, 식탁용 소금, 설탕 등)이 배제되는 것은 아니다.
적어도 복수 고체 결정 또는 입자 중 일부가 승화 및/또는 증발에 의해 제거되어 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 남기게 된다. 바람직하게는, 승화시킨다.
단계 (d) 및 (e)는 동결-건조법에 의해 행해진다. 액체 캐리어가 물인 경우, 승화 단계는 모울드 및 동결 슬러리 주변의 압력을 물/얼음/물 증기 시스템의 삼성분점 아래로 낮추고, 얻어진 진공 압력하에서 고체-증기 전이 온도 보다 높은 온도로 온도를 높이는 과정을 포함한다. 주위 액체 증기 부분압이 현재 온도에서 동결 액체의 부분압 더욱 더 낮은 한, 생성물 내의 얼음은 승화를 통해 직접 증기로 전환된다.
온도는 전형적으로 0℃ 이상의 온도로 상승한다. 이 단계는 승화를 통해 동결 슬러리로부터 얼음 결정을 제거하는 데 바람직하다.
동결-건조 파라미터는 바람직한 공극 크기 및 종횡비를 제어하기 위하여 조정될 수 있다. 일반적으로, 냉각 속도가 낮고 최종 동결 온도가 높을수록 (예컨대, 약 -10℃의 온도까지 분당 대략 0.25℃의 온도로 냉각) 더 높은 종횡비를 가지는 큰 공극이 생기며, 냉각 속도가 빠르고 최종 동결 온도가 낮을수록 (예컨대, 약 -40℃의 온도까지 분당 대략 2.5℃의 온도로 냉각) 작게 균분된 공극을 형성하는 경향이 있다.
본 명세서에서 "모울드"는 슬러리 조성물을 성형, 유지 또는 지지할 수 있는 임의의 모울드, 컨테이너 또는 기질을 포함한다. 따라서, 가장 간단한 형태의 모울드는 단지 지지 표면을 포함할 수 있다. 모울드는 임의의 바람직한 형성을 가질 수 있으며, 폴리머(예컨대, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티타늄, 코발트 크롬), 세라믹(예컨대, 알루미나, 지르코니아), 유리 세라믹 및 유리(보로실리케이트 유리)를 포함하는 임의의 적합한 물질로부터 제조될 수 있다.
2004년 10월 28일 출원된 본 출원인의 선출원, PCT/GB04/004550는 콜라겐, 브러사이트 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물 및 그 제조방법을 기재하고 있다. PCT/GB04/004550의 기재 내용은 참고문헌으로서 본 출원과 관련된다.
참고문헌 PCT/GB04/004550에 기재된 제조방법은 콜라겐, 칼슘원(calcium source) 및 인 소스(phosphorous source) 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 산성 수용액을 제공하는 단계, 및 콜라겐, 브러사이트 및 글리코스아미노글리칸을 수용액으로부터 함께 침전시켜 삼성분 공침물을 형성하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 "공침물"은 동일한 용액/분산액으로부터 실질적으로 동시에 침전된 두가지 또는 세 가지 화합물의 침전물을 의미한다. 이것은, 특히 성분들이, 예를 들어 상이한 용액에서 개별적으로 침전되는 경우에 성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과는 구별된다. 공침물의 미세구조는 그 성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과는 실질적으로 상이하다.
공침물 제조 단계에 있어서, 칼슘원은 칼슘 니트레이트, 칼슘 아세테이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 알콕사이드, 수산화칼슘, 칼슘 실리케이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 글루코네이트 및 헤파린의 칼슘 염 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 헤파린의 칼슘 염은 돼지의 장 점막으로부터 유래될 수 있다. 적합한 칼슘염이 시그마-알드리치 인크(Sigma-Aldrich Inc.)로부터 시판된다. 인 소스는 암모늄-디히드로겐 포스페이트, 디암모늄 히드로겐 포스페이트, 인산, 이나트륨 수소 오르쏘포스페이트 2-수화물 (Na2HPO4.2H2O, 종종 GPR 소렌슨 염이라 불림) 및 트리메틸 포스페이트, 포스페이트의 알칼리 금속 염 (예컨대, Na 또는 K), 포스페이트의 알칼리토류 염 (예컨대, Mg 또는 Ca) 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
글리코스아미노글리칸은 반복 이당류 유닛을 함유하는 비분지된 장쇄 다당류를 함유하는 거대분자 패밀리이다. 바람직하게는, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 더마틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트 및 히알루론산으로부터 선택된다. 콘드로이틴 설페이트는 콘드로이틴-4-설페이트 또는 콘드로이틴-6-설페이트일 수 있고, 둘 모두는 시그마-알드리치 인크로부터 시판된다. 콘드로이틴-6-설페이트는 상어 연골로부터 유래될 수 있다. 히알루론산은 사람 탯줄로부터 유래할 수 있다. 헤파린은 돼지의 장 점막으로부터 유래될 수 있다.
콜라겐은 가용성 또는 불용성이며, 임의의 동물 내의 임의의 조직으로부터 유래될 수 있고, 임의의 종래 기술을 사용하여 추출될 수 있다.
침전은 콜라겐, 칼슘원, 인 소스 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 산성 수용액에서 조합하고, 침전이 일어날 때까지 용액을 방치하고, 용액을 교반하고, 암모니아와 같은 염기성 적정제를 사용하여 적정하고, 미리 제조된 브러사이트와 같은 핵형성제를 첨가하고, 칼슘원의 첨가 속도를 변화시키고, 상기 기술을 임의로 조합시킴에 의해 수행될 수 있다.
슬러리 내에 다른 성분들이 존재할 수 있음은 자명하다. 예컨대, 성장 인자, 유전자, 약물 또는 다른 생리학적 활성종이 단독 또는 상호 조합으로 슬러리에 첨가될 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 액체 캐리어 및 유기물 및 선택적으로 무기물을 포함하는 제 2 슬러리 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 냉각 단계 전, 상기 제 1 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 모울드 내에 상기 제 2 슬러리 조성물을 침착하는 단계를 더 포함한다. 전술한 바와 같이, 유기물은 하나 이상의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산, 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함한다.
제 2 슬러리 조성물은 무기물, 바람직하게 칼슘 포스페이트 물질을 포함할 수 있다.
바람직하게, 제 2 슬러리 조성물이 액체-캐리어, 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 이러한 실시예에 있어서, 제 2 슬러리 조성물은 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다. 공침물에 대하여는 제 1 슬러리의 제조와 관련하여 이미 기술하였다.
또는, 제 2 슬러리가 단지 콜라겐 및 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸 중 하나 또는 둘의 기계적 혼합물을 포함할 수 있다. 기계적 혼합물에 대하여는 제 1 슬러리의 제조와 관련하여 이미 기술하였다.
제 2 슬러리내의 칼슘 포스페이트 물질이 존재하는 경우, 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석이 선택될 수 있다.
제 1 및 제 2 슬러리 조성물은 모울드내에 제 1 및 제 2 층으로 침착될 수 있다. 예컨대, 제 1 슬러리가 모울드내에 침착되고, 제 2 슬러리가 침착된다. 이후, 모울드 내용물은 단계 (d), (e) 및 (f)를 거치게 될 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 다중-적층된 물질을 형성하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는 적어도 하나의 층이 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 포함한다. 제 2 슬러리 조성물에 의해 형성된 층은 다공성 또는 비-다공성 층이다. 다공성 층이 요구되는 경우, 공극은 제 2 슬러리 내에 형성된 복수의 고체 결정 또는 입자의 승화 및/또는 증발에 의해 생성될 수 있다.이러한 기술은 이미 제 1 슬러리와 관련하여 기술하였으며, 바람직하게는 동결 건조법이 포함된다.
본 발명에 따른 방법은 액상에서 행해지며, 이는 제 1 슬러리 층 및 제 2 슬러리 층 사이의 확산에 의해 행해진다. 층은 임의적인 적층 순서 또는 기하학적 형태로 침착될 수 있다. 층은 예컨대, 수직(즉, 다른 층의 위에 적층), 수평(즉, 다른 층의 옆에 적층), 및/또는 방사상(다음 층 정상 위의 구상 층)으로 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 캐스팅 방법은 조직 공학용으로 사용되는 다공성 모놀리스 및 다공성 적층 스캐폴드를 제조할 수 있다.
제 1 및 제 2 슬러리 조성물이 모울드 내에 침착된 후, 모울드의 내용물은 냉각 단계 전, 24 시간 미만 동안 방치하는 것이 바람직하다. 이는 인접층 사이의 여러 슬러리 구성 성분의 경계-확산이 일어날 수 있어 유리하다. 이는 층간 결합 강도를 개선시킨다.
제 1 슬러리내의 액체 캐리어는 물을 포함하는 것이 바람직하다. 제 2 슬러리내의 액체 캐리어도 물을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 냉각 단계 전, 상기 제 1 및/또는 제 2 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 다른 슬러리 층이 모울드내에 침착될 수 있음을 알 수 있다.
냉각 단계 전, 모울드 내에 침착된 슬러리의 온도가 슬러리의 점성도에 영향을 미치는 것이 일반적이다. 온도가 너무 높으면, 슬러리의 점성도가 너무 낮아지게 되고, 이는 제 2 슬러리가 침착 되고 나서 제 1 층과 제 2 층이 완전 상호 혼합되는 바람직하지 않은 결과를 초래하게 된다. 또한, 너무 높은 온도는 콜라겐의 변성을 초래하기도 한다. 한편, 너무 낮은 온도는 슬러리의 점성도를 너무 높게 하여, 효율적인 분산, 연마 또는 성형이 이루어지지 못하게 하며, 얼음 결정 조기 에 형성될 염려가 있다. 따라서, 본 발명자들은 냉각 단계 전, 제 1 모울드 내에 침착된 슬러리의 온도가 바람직하게는 2 내지 40℃의 온도, 더욱 바람직하게는 4 내지 37℃, 더 더욱 바람직하게는 20 내지 37℃인 것을 발견하였다.
적층 슬러리 조성물이 사용된다면, 부가의 슬러리에도 이러한 온도 범위가 적용될 수 있다.
제 1 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계는 바람직하게 ≤0℃의 온도로 행해진다. 더욱 바람직하게, 냉각단계는 -100 내지 0 ℃의 온도범위로, 더욱 더 바람직하게 -80 내지 -10℃의 온도, 더욱 더 바람직하게 -40 내지 -20℃의 온도로 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
제 1 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계는 바람직하게 0.02 - 10℃/분, 더 바람직하게 0.02 - 6.0℃/분, 더욱 더 바람직하게 0.2 - 2.7℃/분의 냉각 속도로 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
일반적으로, 냉각 속도가 느리고 최종 동결 온도가 높을 수록(예컨대, 0.25℃/분의 냉각 속도로 -10℃의 온도까지 냉각) 더 높은 종횡비를 가지는 공극이 형성되고, 냉각 속도가 빠르고 최종 동결 온도가 낮을 수록(예컨대, 2.5℃의 냉각 속도로 -40℃의 온도까지 냉각) 작게 균분된 공극을 형성하는 경향이 있다.
모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계는 1 - 200 kPa, 바람직하게 50 - 150 kPa, 더욱 바람직하게 50 - 101.3 kPa의 압력에서 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 50 kPa 미만의 압력에서는 슬러리내에 버블을 형성하고, 200 kPa 초과의 압력에서는 인접층의 과도한 혼합을 초래하는 것을 발견하였다.
제 1 모울드 내에 침착된 슬러리의 두께는 바람직하게 0.1 - 500 mm, 더욱 바람직하게 0.5 - 20 mm, 더욱 더 바람직하게 1.0 - 10 mm이다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 두께가 500 mm를 초과하는 경우에는 완전하게 고화(solidify)가 이루어지기 어렵고, 두께가 0.1 mm 미만인 경우 거의 순간적으로 동결이 일어날 수 있어 얼음 결정의 핵화 및 성장 과정을 정확하게 제어하기 어렵게 된다.
모울드 내에 침착되기 전의 제 1 슬러리의 점성도는 바람직하게 0.1 - 50 Pa·s, 더욱 바람직하게 0.1 - 10 Pa·s, 더욱 더 바람직하게 0.5 - 5 Pa·s이다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 슬러리의 점성도가 너무 큰 경우, 분산, 연마 또는 성형이 어렵고, 너무 낮은 점성도의 경우, 제 2 슬러리가 침착되면 제 1 및 제 2 층간에 완전한 상호 혼합이 일어나게 된다(따라서, 바람직하지 않음).
승화에 의해 제 1 슬러리 내의 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계는 바람직하게 0 - 0.08 kPa, 더욱 바람직하게 0.0025 - 0.08 kPa, 더욱 더 바람직하게 0.0025 - 0.04 kPa의 압력 범위에서 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 물의 삼중점 압력(약 0.08 kPa) 이상의 압력에서 행해지는 경우, 승화 대신 용융이 일어날 염려가 있고, 너무 낮은 압력은 수행하기도 어렵고 불필요한 승화를 촉진하게 한다.
제 1 슬러리 내 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 승화에 의해 제거하는 단계에 관하여, 승화 시간이 너무 짧으면, 나머지 물과 용매가 스캐폴드 벽의 재용해를 초래하기 96 시간 이하의 시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 12 - 72 시간, 더욱 더 바람직하게 24 - 36 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
승화에 의해 제 1 슬러리 내 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계는 바람직하게 -10 - 60℃의 온도, 더욱 바람직하게 0 - 40℃의 온도, 더욱 더 바람직하게 20 - 37℃의 온도, 가장 바람직하게 25 - 37℃의 온도 범위에서 수행한다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 승화 중의 온도가 너무 낮으면, 승화가 완료되기에 필요한 시간이 너무 길어지게 되고, 온도가 너무 높으면(즉, 40℃ 초과의 온도), 콜라겐이 변성될 위험이 있다.
물질이 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 콜라겐과 하나 이상의 글리코스아미노글리칸이 다공성 생체 적합 복합 물질(porous composite bimaterial) 내에서 가교하는 단계를 더 포함한다. 가교은 전형적으로 물질이 승화 후에 모울드로부터 제거된 후 일어난다. 교차 결합은 공침물을 하나 이상의 감마 방사, 자외선 방사, 탈수열처리, 글루코스, 만노스, 리보오스 및 슈크로스와 같은 단당류와의 무효소 당화, 삼성분 공침물과 하나 이상의 글루타르알데히드, 카보디이미드(예컨대, 에틸 디메일아미노프로필 카보디이미드) 및/또는 노르- 디히드로구아리아레트산과의 접촉법, 또는 이들 방법의 임의의 조합에 의한 방법을 행함으로써 수행된다. 이들 방법은 기술분야에 공지되어 있다.
물질이 칼슘 포스페이트를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 다공성 생체 적합 복합 물질 내의 칼슘 포스페이트 물질의 적어도 일부를 다양한 칼슘 포스페이트 상으로 전환하는 단계를 더 포함한다. 예컨대, 방법이 다공성 생체 적합 복합 물질내의 적어도 일부의 브러사이트를 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환시킨다. 브러사이트의 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로의 전환은 가수분해에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 상 전환은 전형적으로 물질이 모울드로부터 제거( 및 선택적으로 가교)된 후에 일어난다.
인회석은 칼슘 및 인산염을 포함하는 광물 부류이며, 일반식 Ca5(PO4)3(X)이며, X는 전형적으로 OH-, F- 및 Cl-인 이온, 또는 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 다른 이온 일 수 있다. 본 명세서에서 "인회석"은 또한 실리콘 치환 인회석과 같은 대체 인회석일 수 있다. 본 명세서에서 "인회석"은 인회석의 구체적인 예인 수산화인회석일 수 있다. 수산화 인회석은 또한 예컨대, 실리콘과 같은 다른 화학종으로 치환될 수도 있다.
상기한 바와 같이, 슬러리 층은 상기 냉각 단계 전, 또는 상기 제 1 및/또는 제 2 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 모울드내에 침착 될 수 있다. 추가의 슬러리도 전형적으로 예컨대, 액체 캐리어, 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함할 수도 있다. 모울드의 내용물을 바람직하게 24 시간 미만 동안 방치하여, 인접 층 간의 여러 슬러리 성분의 경계 확산이 이루어지게 한다.
따라서, 본 발명은 하나, 둘 또는 그 이상의 층을 포함하는 생체 적합 복합 물질의 제조방법을 제공한다. 적어도 하나의 층은 바람직하게 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 바람직하게는 글리코스아미노글리칸의 다공성 생체 복합물질을 포함한다. 모든 층은 바람직하게 콜라겐을 포함한다.
본 발명에 따른 생체 적합 복합 물질은 예컨대, 적어도 하나의 층이 다공성인 다공성 모놀리스 스캐폴드, 또는 다중-적층된 스캐폴드를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 생체 적합 복합 물질은 근골격 및 치과적 용도의 조직 재생 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게 제 1 및 제 2 층 내의 유기 성분으로서 콜라겐을 혼합하는 것과 관련된다(바람직하게는, 콜라겐이 제 1 및 제 2 층 내의 주요 유기 성분임). 부가 층이 존재하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게 하나 이상의 부가 층 내 유기 성분으로서 콜라겐을 혼합하는 것과 관련된다(바람직하게는, 콜라겐이 하나 이상의 부가 층 내의 주요 유기 성분임). 본 발명에 따른 방법은 모든 층, 따라서 이들 사이의 경계면을 액상으로 동시에 제조하는 데 관련된다. 이는 경계 확산을 통해 강한 층간 경계면을 형성하게 된다. 본 명세서에서 "경계 확산"은 서로 다른 조성을 가지는 두 슬러리가 접하여 위치할 때 일어나는 분자 확산 또는 브라운 운동에 의한 혼합을 의미한다.
제 2의 관점에서, 본 발명은 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질 및 하나의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산 또는 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함하는 다공성 공침물로부터 형성되며, 매크로포어 사이즈(포어 직경)가 바람직하게 1 - 1000 마이크론, 더욱 바람직하게 200 - 600 마이크론인 합성 생체 적합 복합 물질을 제공한다. 본 발명에 따른 복합물질은 바람직하게 콜라겐을 포함한다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택된다. 다공성 물질은 바람직하게 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물을 포함한다. 이는 상기 본 발명의 제 1 관점과 관련하여 이미 기술하였다. 본 명세서에서 물질이 "다공성"이라는 것은 물질이 매크로포어 및/또는 마이크로포어를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. "매크로포어"는 전형적으로 대략 10 마이크론 초과 스캐일의 공극과 관련한 특징을 말한다. "미세공극률"은 전형적으로 대략 10 마이크론 미만 스캐일의 공극과 관련한 특징을 말한다. 물질내의 오픈 및 클로즈 셀의 임의의 조합이 가능함을 알 수 있다. 예컨대, 물질이 일반적으로 매크로포어 및 마이크로포어를 모두 포함하는 조합이 될 수 있다.
본 발명의 제 1 및 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)는 전형적으로 1 내지 1200 마이크론, 바람직하게 10 내지 1000 마이크론, 더욱 바람직하게 100 내지 800 마이크론, 더욱 더 바람직하게 200 내지 600 마이크론이다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서 평균 종횡비 범위는 바람직하게 1 내지 50, 더욱 바람직하게 1 내지 10이고, 가장 바람직하게는 대략 1이다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내의 공극 크기 분포(평균 포어 직경의 표준 편차)는 바람직하게 1 내지 800 마이크론, 더욱 바람직하게 10 내지 400 마이크론, 더욱 더 바람직하게 20 내지 200 마이크론이다. 본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내의 공극률은 바람직하게 50 내지 99.99 vol%, 및 더욱 바람직하게 70 내지 98 vol%이다.
오픈-셀 공극률의 백분률(오픈- 및 클로즈-셀의 전체 공극수의 백분률로 측정)은 바람직하게 1 내지 1 100%, 더욱 바람직하게 20 내지 100%, 및 더욱 더 바람직하게 90 내지 100%이다.
본 발명의 제 3 관점에 있어서, 본 발명은 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질 및 둘 이상의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함하는 다공성 삼성분 공침물로부터 형성된다. 본 발명에 따른 물질은 바람직하게 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 본 발명에 따른 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명에 따른 다공성 물질은 바람직하게 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다. 이는 본 발명의 제 1 관점과 관련하여 이미 기술하였다. 본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)가 제 3의 관점에도 적용될 수 있다. 평균 종횡비 범위, 공극 크기 분포, 공극률 및 오픈-셀 공극 백분률에 대하여도 동일하다. 제 4의 관점에서, 본 발명은 제 2 및 제 3의 관점에 따른 생체 적합 복합 물질로 이루어진 제 1 층; 및 상기 제 1 층에 결합되고, 콜라겐, 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 3 성분 공침물을 포함하는 물질로 형성된 제 2 층을 포함하는 합성 생체 적합 복합 물질을 제공한다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택된다.
바람직하게, 제 1 및 제 2 층은 일체로 형성된다. 유리하게는, 액상 공합성과 관련된 방법에 의해 형성된다. 이는 다중 층을 포함하는 밀집 또는 다공성 물질로 이루어진 인접층이 액체 캐리어 또는 캐리어들을 제거시키기 전에, 각 층에 대한 전구체를 포함하는 슬러리를 전체적으로 상호 접촉시킴으로써 형성되며, 모든 층으로부터 액체 캐리어 또는 캐리어들의 제거는 실질적으로 동시에 행해지는 것이 바람직하다. 액체 캐리어를 제거하기 전에, 전구체 슬러리(즉, 아직 액상)를 전체 접촉시키는 것이 인접 슬러리 사이에 경계 확산이 일어날 수 있도록 한다. 이는 생성 물질의 인접층 사이 경계면에 중간확산영역이 생기게 되며, 이 영역의 물질 조성은 인접층의 조성에 대해 중간적이다. 중간 확산 영역의 존재로 인하여 인접층 사이의 경계면에 대하여 기계적 강도 및 안정성을 부여할 수 있다. 따라서, 제 1 및 제 2 층은 경계 확산층을 통하여 바람직하게 결합되어 있다.
또는, 제 1 및 제 2 층은 경계 층을 통하여 서로 결합될 수 있다. 본 명세서에서 "경계 층"은 결합 강도를 개선하거나 또는 생성 스캐폴드의 인접층 사이의 셀, 분자 또는 유체의 경로를 차단할 목적으로 다른 두 층 사이에 독립적으로 침착된 임의의 층을 의미하며, 예컨대, 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 섬유소, 안티-안제오젠 약물(예컨대, 수라민(suramin)), 성장인자, 유전자 또는 임의의 다른 성분들이 될 수 있다. 경계 확산층은 인접층 사이의 경계 확산층으로 인하여 상호 배타적으로 형성되는 데 반하여, 경계 층은 조성이 다른 슬러리로서 별도로 침착되기 때문에 경계 층과 확산층은 구별된다.
제 1 층은 다공성이다. 제 2 층은 필요한 경우 비-다공성 또는 실질적으로 비-다공성 층일 수 있으나, 다공성인 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)가 본 발명의 제 4의 관점에도 적용될 수 있다. 평균 종횡비 범위, 공극 크기 분포, 공극률 및 오픈-셀 공극 백분률에 대하여도 동일하다. 본 발명의 제 2, 3, 또는 4 의 관점에서, 제 1 및/또는 제 2 층에 결합되는 하나 이상의 부가 층들을 포함할 수 있으며, 상기 각 부가 층이 콜라겐, 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 및 적어도 하나의 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 물질로 형성된다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택된다. 제 1 및 제 2 층 및 상기 하나 이상의 부가 층은 바람직하게 일체로 형성되며, 인접층은 바람직하게 경계 확산층을 통하여 상호 결합하고, 이는 전형적으로 액상 공합성에 의해 형성된다. 일반적으로, 적어도 하나의 상기 부가 층은 다공성이다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)는 부가 층에 대해서도 적용될 수 있다. 평균 종횡비 범위, 공극 크기 분포, 공극률 및 오픈-셀 공극 백분률에 대하여도 동일하다.
인접층 사이의 공극 크기에 있어서의 편차는 +/- 1000 마이크론 정도로 거의 무시할 만하다.
다른 언급이 없다면, 이하의 기재는 본 발명의 범주 내에서 임의의 다른 실시에도 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 물질은 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸은 가교될 수 있다. 콜라겐은 물질 내에 바람직하게, 1 내지 99 wt%, 더 바람직하게 5 내지 90 wt%, 더욱 더 바람직하게 15 내지 60 wt%의 량으로 존재한다.
글리코스아미노글리칸은 물질 내에 바람직하게, 0.01 내지 20 wt%, 더욱 바람직하게 1 내지 12 wt%, 더욱 더 바람직하게 1 내지 5.5 wt%의 량으로 존재한다.
본 발명에 따른 물질이 브러사이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 브러사이트의 중량비는 바람직하게, 10:1 내지 1:100, 더욱 바람직하게 5:1 내지 1:20의 중량비가 된다.
본 발명에 따른 물질이 옥타칼슘 포스페이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 옥타칼슘 포스페이트의 중량비가, 바람직하게 10:1 내지 1:100, 더욱 바람직하게 5:1 내지 1:20의 중량비이다.
콜라겐 대 글리코스아미노글리칸의 중량비는 바람직하게 8:1 내지 30:1의 중량비이다.
본 발명에 따른 생체 적합 물질은 뼈 대체물 또는 치과 재료로 사용될 수 있다. 따라서, 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재한 바와 같은 생체 적합 물질을 포함하는 합성 뼈 재료, 뼈 임플란트, 뼈 이식편, 뼈 대체 재료, 뼈 스캐폴드, 충전재, 코팅재 또는 시멘트를 제공한다.
생체 적합 물질은 유용하게 다중-적층된 스캐폴드 형태로 제공된다. 특히, 본 발명은 근골격 및 치과적 용도를 위한 조직 재생 스캐폴드를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 다층(즉, 둘 이상의 층) 스캐폴드는 예컨대, 뼈/연골 경계면(예컨대, 관절 접합), 뼈/힘줄 경계면(예컨대, 힘줄 삽입 포인트), 뼈/인대 경계면(예컨대, 인대 삽입 포인트), 및 치아/인대 경계면(예컨대, 치아/치주 인대 접합물)의 용도로 사용될 수 있다.
본 발명은 주로 조직 공학적 용도를 위한 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 물질은 상당기간 신체에서 견딜 수 있는 임플란트 제조에 사용될 수 있다. 예컨대, 반영구 임플란트는 힘줄 및 인대 용도로 필요할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재한 바와 같은 방법에 의해 얻어질 수 있는 다공성 생체 적합 복합 물질을 제공한다.
합성 방법
이하에서 본 발명을 실시예를 참고로 기재한다. 바람직한 합성법은 순차적인 단계들을 포함하며, 바람직하게 적어도 하나의 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 하나 이상의 층을 가지는 다공성 스캐폴드를 제조하기 위하여, 전체 또는 부분적으로 적용될 수 있다.
단계 0: 슬러리 제조
미네랄화된 콜라겐/GAG/브러사이트 슬러리 또는 슬러리들은 본 출원인의 선행 국제특허출원, PCT/GB04/004550호(2004년 10월 28일자 출원)에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 국제출원 PCT/GB04/004550호는 본 발명의 참고문헌으로서, 본 명세서에 이를 첨부한다.
미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 슬러리 또는 슬러리들의 제조는 참고문헌[Yannas 등, 1989; O'Brien 등, 2004; O'Brien 등, 2005); Loree 등, (1989)]에 기재된 방법에 따라 얻어질 수 있다.
선택적으로 성장 인자, 유전자, 약물 또는 다른 생리적 활성종이 단독 또는 혼합되어 슬러리에 가해지며, 스캐폴드로의 혼합을 촉진하기 위한 기계적 혼합이 이용된다. 이 경우, 스캐폴드가 하나 이상의 층을 가지는 경우, 한 층에 가해지는 생리적 활성종과 다음 층에 가해지는 활성종이 동일할 필요는 없다.
단계 I: 캐스팅
단계 I-a: 제 1 층 캐스팅
단계 I-b: 제 2 층 캐스팅
단계 I-c: 제 3 층 캐스팅
단계 I-n: 제 n 층 캐스팅
캐스팅 단계는 용액, 현탁액, 콜로이드 또는 분산액 형태로, 슬러리 또는 슬러리들의 연속적인 디포지션을 수반하며, 물이 모울드로의 주요 희석제이고, 적어도 하나의 슬러리가 콜라겐, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 브러사이트의 삼성분 공침물을 포함하며, 모든 슬러리들이 콜라겐을 포함한다. 모울드는 임의의 바람직한 형상을 가지며, 폴리머 (예컨대, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티타늄, 크롬 코발트) 또는 세라믹(예컨대, 알루미나, 지르코니아), 유리 세라믹, 또는 유리(예컨대, 보로실리케이트 글래스)를 포함하는 물질들 중 임의의 물질들로 제조될 수 있다. 구체적으로 층의 제조를 촉진하기 위한 모울드가 제조될 수 있다. 적합한 디자인의 예가 제 1 도 및 제 2 도에 도시되어 있다. 층은 예컨대, 수직(즉, 다른 층의 위에 적층), 수평(즉, 다른 층의 옆에 적층), 및/또는 방사상(다음 층 정상 위의 구상 층)으로 위치할 수 있다.
스캐폴드가 하나의 층을 포함하는 경우, 캐스팅되는 단일층은 콜라겐, 바람직하게 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 공침물 슬러리를 포함한다. 바람직하게, 슬러리는 콜라겐, 브러사이트 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물을 포함한다. 바람직한 층 두께는 표 1에 기재되어 있다.
스캐폴드가 두 층을 포함하는 경우, 캐스팅되는 적어도 하나의 층은 콜라겐, 바람직하게 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 공침물 슬러리를 포함한다. 바람직하게는, 슬러리가 콜라겐, 브러사이트, 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물을 포함한다. 이러한 층의 바람직한 두께는 표 1에 나타나 있다. 다른 층은 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 슬러리를 포함한다. 이러한 슬러리 조성물은 바람직하게 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 콜라겐 및 브러사이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 바람직하게는 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다.
상기한 바와 같이, 부가 층이 포함될 수 있으며, 이러한 부가 층들은 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 슬러리로부터 형성된다. 추가의 슬러리 조성물은 바람직하게 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 콜라겐 및 브러사이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 바람직하게는 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다.
각 인접층들 내의 슬러리 조성은 동일하거나 약간 다르거나 상당히 다를 수 있다. 각 층에 콜라겐 및 바람직하게는 글리코스아미노글리칸이 존재하고, 적어도 하나의 층이 예컨대, 브러사이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질을 포함한다.
단계 II : 경계 확산
공-확산 단계는 캐스트, 적층 슬러리의 각 층이 경계 확산하도록 한다. 이 단계는 인접층 사이의 슬러리 성분을 경계-확산시키기 위하여 행해지며, 따라서 고화 및 승화 후 경계층의 결합 강도를 증가시킨다. 경계-확산 단계의 바람직한 조건이 표에 기재되어 있다.
단계 III : 제어 냉각
제어 냉각 단계는 슬러리를 포함하는 모울드를 0℃의 온도 이하의 최종 온도까지 제어 속도로 냉각시키는 환경으로 하는 것을 수반한다. 이러한 단계는 슬러리 내의 핵화 및 성장을 개시하고 속도를 제어함으로써 수행된다. 순차적으로 얼음 결정은 승화에 의해 제거되어 다공성 스캐폴드를 남기게 된다. 얼음 결정 네트워크의 설계는 궁극적인 스캐폴드의 공극 구조를 결정하게 된다. 냉각에 대한 바람직한 파라미터는 표3에 나열되어 있다.
단계 IV : 어닐링
어닐링 단계는 슬러리를 제어 냉각 단계의 최종 온도에서 소정의 시간 동안 방치하는 것을 포함한다. 이러한 단계는 슬러리를 완전히 또는 실질적으로 완전히 동결시키게 된다. 어닐링에 대한 바람직한 파라미터는 표4에 나열되어 있다.
단계 V: 승화
승화 단계는 동결 슬러리가 대략 제어 냉각 및 어닐링 단계의 최종 온도로 유지되는 동안, 모울드 및 동결 슬러리 주변 환경의 압력을 물/얼음/수증기의 삼중 점 미만으로 감소시키고, 얻어진 진공 압력에서 고체-증기 전이 온도더욱 더 높은 온도(전형적으로 ≥ 0℃의 온도)로 온도를 상승시키는 것을 포함한다. 이 단계는 승화에 의해 동결 슬러리로부터 얼음 결정을 제거하기 위하여 수행된다. 물을 제거하는 방법에 있어, 증발에 비하여 승화는 사전에 미리 존재하는 얼음 결정의 네트워크 설계를 정확하게 모방하는 빈 공간(즉, 공극)의 네트워크를 남기는 장점이 있다. 얼음이 용융될 수 있으면, 얼음 결정 네트워크는 그 형상을 잃게 되며, 공극 네트워크는 그 형상을 잃게 되고, 생성되는 공극 네트워크의 설계는 절충되게 된다. 승화 단계에 대한 바람직한 파라미터는 표5에 나열되어 있다.
단계 V + I: 가교
필요한 경우, 방법은 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸를 가교시키기 위하여 가교단계를 수반할 수 있다. 이에 관하여는 상기 본 출원인의 선행 국제 출원 PCT/GB04/004550(2004년 10월 28일 출원)에 기재되어 있다. 국제 출원 PCT/GB04/004550의 기재 내용은 본 출원의 참고문헌으로서, 본 명세서에 이를 첨부한다.
실시예 I: 콜라겐/ GAG / CaP 의 단일-층 스캐폴드
재료
콜라겐: 소 힘줄로부터 추출된 미세섬유 콜라겐, 타입 I, 인테그라 라이프 사이언스 플레인스보로[Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA].
GAG: 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 [Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)].
칼슘원: 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
가교제: (i) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (=EDAC); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) N-히드록시숙신이미드 (=NHS); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA).
절차
단계 0: 슬러리 제조
3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 H3PO4 14.3mL에 분산되어 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다. 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨 가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물 슬러리를 생성하였으며, 이때 삼성분 공침물 슬러리의 pH는 약 4.0이었다. 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 25℃에서 48시간 동안 교반기에서 혼합시키면서 유지하고, 4℃에서 12시간 동안 유지하였다. 냉각된 슬러리를 25 Pa 압력에서 25시간 동안 진공 플라스크 내에서 탈기시켰다.
단계 1 : 캐스팅
자동 적정기를 사용하여 15mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 50mm 길이, 30mm 폭, 및 50mm 깊이의 폴리술폰 모울드내로 캐스팅하였다. 핸드 피펫을 사용하여 슬러리로부터 큰 버블을 모두 제거하였다.
단계 II : 경계-확산
실시예 I의 스캐폴드는 하나의 층만을 포함하기 때문에, 경계-확산 단계는 불필요하다.
단계 III : 제어 냉각
모울드 및 슬러리를 온도 제어 강철 쉘프가 장착된 온도-제어 버티스 동결 건조기(VirTis Genesis 동결 건조기)에 위치시키고 동결 건조기의 쉘프 온도를 약 2.4℃/분의 속도로, 4℃에서 -20℃의 온도가 되도록 온도를 낮추었다.
단계 IV : 어닐링
동결 건조기의 쉘프 온도를 -2O℃의 온도에서 10 시간 동안 유지하였다.
단계 V: 승화
쉘프 온도가 아직 -20℃의 온도일 때, 모울드 및 (현재 동결된) 슬러리를 포함하는 챔버에 25Pa 미만의 진공(약 200mTorr)을 적용하였다. 챔버 온도를 37℃의 온도로 올리고, 36 시간 동안 연속적으로 승화가 일어나도록 하였다. 그 후, 진공을 제거하고, 온도를 다시 실온으로 상승시켜 50mm X 30mm X 10mm 크기의 콜라겐/GAG/CaP의 단층 스캐폴드가 남도록 하였다.
단계 V + I: 가교
스캐폴드를 40mL의 탈이온수로 20분 동안 수화시켰다. 20mL의 0.035M EDAC 및 0.014M NHS 용액을 삼성분 공침물 및 탈이온수를 함유하는 컨테이너에 첨가하고, 삼성분 공침물을 2시간 동안 실온에서 부드러운 교반하에 가교시켰다. EDAC 용액을 제거하고, 스캐폴드를 포스페이트 완충 용액(PBS)으로 세정하고, 새로운 PBS에서 가벼운 교반하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 스캐폴드를 약 2.4℃의 온도/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각시키고, -20℃의 온도에서 약 5 시간동안 어닐링한 후, 25Pa 미만 및 37℃의 온도에서 승화시킴으로써, 동결 건조시켜 물을 제거하여, 대략 50mm X 30 mm X 10mm 크기의 가교된 콜라겐/GAG/CaP 스캐폴드를 생성하였다.
생성된 단층 스캐폴드의 X-선 단층 촬영 이미지, SEM(scanning electron microscope)이미지, 이온 분포도 및 기계적 압축 특성은 도 3 내지 10에 도시하였다. 도 3은 X-선 단층 촬영에 의해 나타난 것으로, 상기 공정에 의해 제조된 스캐폴드의 9.5mm x 9.5mm 원통부의 프로파일을 나타낸다. 전체 스캐폴드의 물질 조성 및 공극률은 실질적으로 균일함을 알 수 있다. 동일한 스캐폴드의 연속 단면이 도 4에 도시되어 있으며, 스캐폴드 공극 구조가 균일한 특성을 나타내고 있고, 고도의 공극 경계 연접성, 균분 공극 형태 및 큰 (500 마이크론의 평균 직경) 매크로포어 사이즈를 입증하고 있다. 도 5의 SEM 마이크로그래프도 매크로포어 형태를 잘 나타내고 있으며, 특정 매크로포어의 벽에서 볼 수 있는 한정된 미세 공극률을 보여주고 있다. 스캐폴드 벽 부분의 고배율(400Ox), 2차(즉, X-단층촬영 반응), 및 후방 산란(즉, 조성-반응) 전자 이미지(도 6)는 약 1-2 마이크론 크기의 작은 마디가 돌출되는 형태의 한정된 형태적 변이가 존재하긴 하지만, 스캐폴드 벽의 조성이 균일함을 증명하고 있다. 도 7에 도시한 인 및 칼슘 분포도는 전체 스캐폴드를 통해 두원소가 균일하게 분포되는 것을 통하여 스캐폴드 전체가 실질적으로 조성에 있어 동일성을 가지고 있다는 결론에 이를 수 있다. 도 8은 건조 상태의 단층 스캐폴드를 나타내고 있으며, 스캐펠, 면도날 및 관상톱날(각막 이식에 사용되는 원형 절단 수단)과 같은 통상의 외과 수단을 사용하여 부스러짐, 갈라짐 또는 일체성이 상실되지 않고 바람직한 형성으로 절단될 수 있다는 것을 나타내고 있으며, 도 8은 또한 고체-스틸 볼-베어링의 중량하에서 그 중량을 견딜 수 있는 건조 단층 스캐폴드의 체중 부하능(weight bearing capacity)을 나타내고 있다. 도 9는 건조 상태의 단층 스캐폴드의 양상을 나타내고 있다. 이러한 양상은 762+/-188kPa의 탄성률 및 85.2+/-11.7kPa의 압축 항복 강도를 가지는 다공성 고체의 전형적인 3 단계 변형을 나타낸다. 이러한 건조 스캐폴드의 항복 강도는 스캐폴드가 강한 고정 압력이 적용되는 경우(예컨대, 임플란트의 형상을 외과적으로 수정하는 경우), 영구적으로 변형되지 않고 (예컨대, 결함 사이트로의 삽입 중) 견고한 엄지 손가락 압력(firm thumb pressure)을 견딜 수 있게 한다. 도 10에는 가수분해 단계에서의 단층 스캐폴드의 압축 변형이 도시되어 있다. 건조단계에서, 가수분해된 미네랄화 콜라겐 /GAG 스캐폴드는 압축 로딩(loading)하에서 3 단계 기계적 양상을 나타내지만, 건조 스캐폴드의 해당 특성보다 대략 낮은 정도의 압축탄성률(4.12+/-0.76kPa) 및 항복강도(0.29+/-0.1IkPa)를 갖는다. 또한, 붕괴 평탄역에서, 압축 스트레스의 해제에 따라 점탄성 변형 회복이 관찰되었다.
실시예 II : 2층 미네랄화 / 미네랄화되지 않은 스캐폴드
재료
콜라겐 (미네랄화된 슬러리용) : 인소 힘줄로부터 추출된 타입 I 미세섬유 콜라겐, 테그라 라이프 사이언스 플레인스보로[Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA].
GAG (미네랄화된 슬러리용) : 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 [Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)].
타입 II 콜라겐
+ GAG (미네랄화되지 않은 슬러리용) : 돼지 연골로부터 용해된 타입 II 콜라겐 및 GAG (콜라겐/GAG) 슬러리, 겔스리치 바이오머티리얼스[Gelstlich Biomaterials, (Wolhusen, Switzerland)].
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA).
인 소스: 오르쏘인산(H3PO4), BDH 래버러토리 서플라이스 (BDH Laboratory Supplies, Poole, United Kingdom).
가교제: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (=EDAC); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 N-히드록시숙신이미드 (=NHS); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA).
단계 0: 슬러리 제조
미네랄화된 슬러리 제조
3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 H3PO4 14.3mL에 분산되어 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다. 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물 슬러리를 생성하였으며, 이때 삼성분 공침물 슬러리의 pH는 약 4.0였다. 냉각된 슬러리를 25 Pa 압력에서 25시간 동안 진공 플라스크내에서 탈기시켰다.
미네랄화되지 않은 슬러리 제조
타입 II 콜라겐/GAG 슬러리를 냉장고로부터 제거하고 실온으로 온도를 회복시킨다.
단계 I: 캐스팅
2.5mL의 미네랄화되지 않은 타입 II 콜라겐/GAG 슬러리를 바닥부가 50mm 길이, 30mm 폭, 및 2mm 깊이의 혼합 폴리술폰 모울드의 바닥부에 캐스팅하였다. 슬러리를 면도날(razor blade)을 사용하여 표면을 매끄럽게 하였다. 폴리술폰으로 만들어지고, 50mm 길이, 30mm 폭, 및 6mm 깊이의 상부 컬러를 매끄러운 미네랄화되지 않은 슬러리를 포함하는 모울드의 바닥부에 부착시켰다. 9mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 동일하게 배치하는 방식으로, 매끄러운, 미네랄화되지 않은 층 위, 미리 비워둔 상부 컬러에 위치시켰다. 핸드 피펫을 사용하여 슬러리로부터 큰 버블을 모두 제거하였다.
단계 II : 경계-확산
적층된 슬러리를 동결 건조기에 위치시키기 전에, 실온 및 대기압에서 전체 4시간 동안 유지하였다.
단계 III : 제어 냉각
모울드 및 슬러리를 (온도 제어 강철 쉘프가 장착된 온도-제어) 버티스 동결 건조기 (VirTis Genesis freeze dryer)에 위치시키고 동결 건조기의 쉘프 온도를 4℃에서 -20℃의 온도까지, 약 2.4℃/분의 속도로, 온도를 낮추었다.
단계 IV : 어닐링
동결 건조기의 쉘프 온도를 -2O℃의 온도에서 10 시간 동안 유지하였다.
단계 V: 승화
쉘프 온도는 -40℃를 유지하면서, 모울드 및 (현재 동결된) 슬러리를 포함하는 챔버에 25Pa 미만의 진공(약 200mTorr)을 적용하였다. 챔버 온도를 37℃까지 올리고, 36 시간 동안 연속적으로 승화가 일어나도록 하였다. 그 후, 진공을 제거하고, 온도를 다시 실온으로 상승시켜, 크기가 50mm X 30mm X 10mm이고, 2mm 두께의 미네랄화되지 않은 층과 6mm 두께의 미네랄화된 층으로 이루어진 2층 스캐폴드를 얻었다.
단계 V + I: 가교
스캐폴드를 32mL의 탈이온수로 20분 동안 수화시켰다. 18mL의 0.035M EDAC 및 0.014M NHS 용액을 스캐폴드 및 탈이온수를 함유하는 컨테이너에 첨가하고, 스캐폴드를 2시간 동안 실온에서 부드러운 교반하에 가교시켰다. EDAC 용액을 제거하고, 스캐폴드를 포스페이트 완충 용액(PBS)으로 세정하고, 새로운 PBS에서 가벼운 교반하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 스캐폴드를 약 -2.4℃/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각하고, -20℃의 온도에서 5 시간 동안 어닐링한 후, 25Pa 미만의 압력 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 승화시키도록 동결 건조 시킴으로써, 물을 제거하여, 대략 50mm X 30 mm X 8mm 크기의 미네랄화되지 않은 층과 미네랄화된 층으로 이루어진 2층 스캐폴드를 생성하였다.
생성된 단층 스캐폴드의 X-선 단층 촬영 이미지, SEM 이미지, 및 이온 분포도를 도 11 내지 17에 도시하였다. 상기 공정에 의해 제조된 2층 스캐폴드의 9.5mm x 9.5mm 원통부의 X-선 단층 촬영 이미지가 도 11에 도시되어 있다. 아래쪽 불투명 한 영역은 미네랄화된 층을 나타내며, 위쪽 투명한 영역은 미네랄화되지 않은 층을 나타낸다. 두 층 모두 조성 및 공극에 있어 매우 균일함을 알 수 있다. 도 12에 도시된 연속 단면은 평균 매크로포어 크기를 나타내고 있는데, 미네랄화되지 않은 층이 700 마이크론 단위인데 반하여 미네랄화된 층은 약 400 마이크론 정도이며, 두 층 모두 균분 공극 형태를 나타내었다. 도 13의 SEM 이미지는 미네랄화되지 않은 층의 정상도를 나타내는 데, 미세 공극성의 흔적이 약간 나타나는 데 반하여, 도 14에서는 임의의 큰 공간이나 미네랄화되거나 미네랄화되지 않은 층을 구별하는 비연속성이 없음을 볼 수 있다.
도 15는 2층 압축 로딩하에서, 2층 스캐폴드의 양상을 나타내고 있다. 압축 로드를 적용할 때, 미네랄화된 스캐폴드에서는 임의의 충분한 변형을 유도하기에 불충분한 응력에서, 순응적인 미네랄화되지 않은 층은 압축되기 시작하여 연골 부분의 거의 완전한 컴팩션이 일어난다. 로딩이 해제된 후, 미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 층은 거의 즉시 원래의 형상으로 되돌아간다(도 15d). 도 16 은 수화 상태의 2층 스캐폴드의 역학적 양상을 나타내고 있다. 일단 수화되면, 미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 층은 낮은 규모의 하중하에서 압축될 수 있다(도 16a-c). 건조상태와 달리, 수화된 미네랄화되지 않은 부분은 제 1 압축 하중 적용 후, 원래 두께로 완전히 회복되지 않지만(도 16d), 대신 미네랄화된 부분의 단면에 걸쳐 드리워져 있다. 그러나, 이러한 초기 압축 후의 각 후속 압축 하중 적용 후에는 미네랄화되지 않은 층이 그 압축 두께를 회복한다(도 16d). 도 17에는 관절 접합부 내의 뼈 및 연골 경계면을 둘러싸는 외과적 결함의 벽에 부착되는 2층 스캐폴드의 미네랄화 되지 않은 층을 유추하여 도시하였다. 도 17에서의 유리 슬라이드는 뼈 연골 결함의 벽과 유사하며, 미네랄화되지 않은 층의 이 표면에의 부착력은 스캐폴드가 이러한 결함을 스캐폴드 및 인접 관절 연골의 미네랄화되지 않은 층 사이에 갭이 지속되지 않고 그 주변으로 채우는 능력을 나타낸다.
실시예 III : 3층 미네랄화 - 비미네랄화 - 미네랄화 스캐폴드
재료
콜라겐(미네랄화된 슬러리용): 소 힘줄로부터 추출된 미세섬유 콜라겐, 타입 I, 인테그라 라이프 사이언스 플레인스보로[Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA].
GAG(미네랄화된 슬러리용): 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 [Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)].
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
콜라겐(미네랄화되지 않은 콜라겐-GAG 슬러리용): 돼지 피부로부터의 펩신-용해된 콜라겐; 85% 타입 I, 15% 타입 III; 재팬 미트 팩커스(Japan Meat Packers, Osaka, Japan)
GAG(미네랄화되지 않은 슬러리용): 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
희석제(미네랄화되지 않은 콜라겐 및 GAG용): 빙초산 (CH3COOH), 피셔 사이언티픽[Fiher Scientific, Loughborough, UK)
가교제: 노르디히드로구아리아레인산(NDGA), 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA);이수소인산나트륨(NaH2PO4), BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom), 염화나트륨(NaCl), 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
절차
단계 0: 슬러리의 제조
미네랄화된 슬러리 제조
3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 H3PO4 14.3mL에 분산되어 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다. 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도 로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물 슬러리를 생성하였으며, 이때 삼성분 공침물 슬러리의 pH는 약 4.0이었다. 이후, 냉각된 슬러리를 25 Pa 압력에서 25시간 동안 진공 플라스크내에서 탈기시키고, 균질화장치를 이용하여 30분 동안 재혼합한 후, 48시간 동안 다시 탈기시켰다.
미네랄화되지 않은 슬러리 제조
1.9322g의 타입 I/III 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.1718g의 GAG를 실온에서 0.05M의 초산 28.6mL에 용해시켜 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다.
단계 I: 캐스팅
3.5mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 바닥부가 50mm 길이, 30mm 폭, 및 3mm 깊이의 혼합 폴리술폰 모울드의 바닥부에 캐스팅하였다. 슬러리를 면도날(razor blade)을 사용하여 평편한 표면을 매끄럽게 하였다. 폴리술폰으로 만들어지고, 50mm 길이, 30mm 폭, 및 5mm 깊이인 중간 컬러를 매끄러운 미네랄화된 슬러 리를 포함하는 모울드의 바닥부에 부착시켰다. 7.5mL의 미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 슬러리를 동일하게 배치하는 방식으로, 매끄러운, 미네랄화되지 않은 층 위, 미리 비워둔 중간 컬러에 위치시켰다. 또한, 폴리술폰으로 만들어지고, 50mm 길이, 30mm 폭, 및 3mm 깊이인 상부 컬러를 매끄러운 미네랄화되지 않은 슬러리 위, 모울드의 중간부에 부착시켰다. 3.5mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 동일하게 배치하는 방식으로, 매끄러운, 미네랄화되지 않은 층 위, 미리 비워둔 상부 컬러에 위치시켰다. 핸드 피펫을 사용하여 슬러리로부터 큰 버블을 모두 제거하였다.
단계 II : 경계-확산
3층 슬러리를 동결 건조기에 위치시키기 전에, 실온 및 대기압에서 20분 동안 유지하였다.
단계 III: 제어 냉각
모울드 및 3층 슬러리를 (온도 제어 강철 쉘프가 장착된 온도-제어) 버티스 동결 건조기(VirTis Genesis freeze dryer)에 위치시키고 동결 건조기의 쉘프 온도를 4℃에서 -40℃까지, 약 -2.4℃/분의 속도로, 온도를 낮추었다.
단계 IV: 어닐링
동결 건조기의 쉘프 온도를 -40℃의 온도로 10 시간 동안 유지하였다.
단계 V: 승화
쉘프 온도는 -40℃를 유지하면서, 모울드 및 (현재 동결된) 슬러리를 포함하는 챔버에 25Pa 미만의 진공(약 200mTorr)을 적용하였다. 챔버 온도를 37℃까지 올리고, 36 시간 동안 연속적으로 승화가 일어나도록 하였다. 그 후, 진공을 제거하 고, 온도를 다시 실온으로 상승시켜, 크기가 50mm X 30mm X 11mm이고, 5mm 두께의 미네랄화되지 않은 중간층과 이를 둘러싼 3mm 두께의 두 미네랄화된 층으로 이루어진 3층 스캐폴드를 생성하였다.
단계 V + I: 가교
스캐폴드를 인산염 완충 식염수내의 0.1M NaH2PO4 및 0.15M NaCl(PBS; pH 7.0)에서 30분 동안 수화시켰다. NDGA를 1N NaOH에 현탁시키고, PBS에 가해, 3mg/mL의 PBS 내 NGDA용액을 제조하며; 스캐폴드를 이 용액내에서 24시간 동안 교반하에 수화시켰다. 3층 스캐폴드를 NGDA-PBS 용액으로부터 제거하고, 탈이온수로 세정하였다. 스캐폴드를 약 2.4℃/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각하고, -20℃의 온도에서 5 시간 동안 어닐링한 후, 25Pa 미만의 압력 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 승화시키도록 동결 건조시킴으로써, 건조 가교 스캐폴드를 얻었다. 후처리는 0.1mg/mL NDGA의 농도에서 행해졌다. 이 후, 스캐폴드를 70% 에탄올로 6 시간에 걸쳐 세정하고, 이어서 24 시간 in PBS내에서 24시간 동안 실온에서 세정하였다. 스캐폴드를 약 2.4℃/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각하고, -20℃의 온도에서 5 시간 동안 어닐링한 후, 최종적으로 25Pa 미만의 압력 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 승화시켜 잔존하는 물을 제거하도록 2차 동결 건조시켰다.
하기 표의 파라미터들은 다른 언급이 없는 한, 본 발명의 범주내에서 단독으로 또는 조합하여 다양하게 적용될 수 있다.
표 1: 캐스팅에 바람직한 파라미터
제어 냉각의 개시 온도 바람직함 0 내지 37℃
보다 바람직함 2 내지 37℃
가장 바람직함 4 내지 37℃
층두께 바람직함 0.1 내지 500mm
보다 바람직함 0.5 내지 20mm
가장 바람직함 1.0 내지 10mm
슬러리 점성도 바람직함 0.1 내지 50 Pa·s
보다 바람직함 0.1 내지 10 Pa·s
가장 바람직함 0.1 내지 5 Pa·s
모울드 벽 두께 바람직함 1 내지 50mm
보다 바람직함 5 내지 20mm
가장 바람직함 5 내지 15mm
층 수 바람직함 1 내지 50
보다 바람직함 1 내지 5
가장 바람직함 1 내지 3
표 2: 경계-확산에 바람직한 파라미터
경계확산에 허용되는 시간 바람직함 0 내지 24시간
보다 바람직함 0 내지 6시간
가장 바람직함 0 내지 2시간
온도 바람직함 2 내지 40℃
보다 바람직함 4 내지 37℃
가장 바람직함 20 내지 37℃
압력 바람직함 1 내지 200 kPa
보다 바람직함 50 내지 150 kPa
가장 바람직함 50-101.325 kPa
표 3: 제어-냉각에 바람직한 파라미터
냉각 속도 바람직함 0.02 내지 10.0℃/분
보다 바람직함 0.02 내지 6.0℃/분
가장 바람직함 0.2 내지 2.7℃/분
최종 냉각 온도 바람직함 -100 내지 0℃
보다 바람직함 -80 내지 -10℃
가장 바람직함 -40 내지 -20℃
표 4: 어닐링에 바람직한 파라미터
어닐링 온도 바람직함 -100 내지 0℃
보다 바람직함 -80 내지 -10℃
가장 바람직함 -40 내지 -20℃
어닐링 시간 바람직함 0 내지 48시간
보다 바람직함 2 내지 12시간
가장 바람직함 8 내지 10시간
표 5: 승화에 바람직한 파라미터
승화 압력 바람직함 0 내지 0.08 kPa
보다 바람직함 0.0025 내지 0.08 kPa
가장 바람직함 0.0025 내지 0.04 kPa
승화 시간 바람직함 0 내지 120시간
보다 바람직함 12 내지 72시간
가장 바람직함 24 내지 36시간
승화 온도 바람직함 -10 내지 -60℃
보다 바람직함 0 내지 40℃
가장 바람직함 20 내지 37℃
참고문헌
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본 발명은 다양한 용도에 적용될 수 있으며, 그 예로써 이하의 실시예를 제공한다.
관절 연골 치유 제품: 2층 스캐폴드
2층 스캐폴드는 뼈 골수 유래 줄기 세포가 관절- 연골 상처 부위로 뼈 골수 유래 줄기 세포를 모이게 하는 현존하는 최일선의 외과 과정에 있어서 효율성을 증 진시킬 수 있다.
예컨대, 건조, 진공-팩, 감마 살균된 스티로폼 유사 물질의 건조, 2cm x 2cm x lcm 블록과 같이 전달될 때, 이러한 스캐폴드는 스캐펠 또는 다른 수단을 사용하여 절단될 수 있고, 엄지 손가락- 또는 무딘-도구 압력만을 사용하여 쉽게 결함에 삽입될 수 있고, 봉합 또는 접합 없이도 부위에 직접 결합될 수 있다.
슬개골 인대 제공 부위 치유 제품: 3층 스캐폴드
3층 스캐폴는, 전 십자인대 인대(ACL) 재생 중, 정면 무릅 통증을 완화하고, 슬개골 인대 파열 및 슬개골 골절 위험을 감소시키기 위하여, 슬개골 인대(슬개골 힘줄) 제공 부위에서의 재생을 증진시킬 수 있다.
힘줄 치유 제품: 2층 스캐폴드
연장된 미네랄화되지 않은 성분을 갖는 2층 스캐폴드는 회전 근개 과정 중 힘줄 치유 효과를 개선하고, 현재 효과적인 치유책이 존재하지 않는 소-힘줄에 대한 적용을 유도할 수 있다.
본 발명은 이하의 대규모 동물 시험에 대하여 연구되었으며, 이하에서 이의 개요를 제공한다.
시험 1 : 양 뼈 결함 모델
본 발명에 따라, 한 면은 구조 및 조성이 뼈와 유사한 한편, 다른 면은 미네랄화되지 않은 조직(예컨대, 연골, 인대, 힘줄)이며, 그 사이의 경계면은 매끄럽고 안정된, 적층된 조직 재생 스캐폴드를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라, 이러한 임플란트의 뼈 부분의 미네랄 상의 화학 조성을 체계적으로 변경시킬 수 있 다.
- 동물 : 골격이 충분히 성숙한 암컷 텍셀 유럽양(Texcel Continental sheep
결함: 9mm 직경 및 9mm 깊이를 가지는 외측 대퇴 과상 돌기상의 다공성 뼈 결함
- 이식 기간: 6주.
실험 집단: 각 실험군의 6개 임플란트를 동일한 동물의 각 면에 동일한 임플란트 타입으로 반대 측면으로 임플란트하였다.
- 제어 집단:
포지티브 제어: 네 부위를 경골 조면으로부터 얻어진 다공질 자가이식편으로 채워넣었다.
네가티브 제어: 네 부위를 미네랄을 전혀 포함하지 않는 임플란트를 포함하는 제어 임플란트로 채워 넣는다(즉, 뼈 대용물(ChondroMimetic)의 골질면 만의 유기 성분 포함).
- 연구 목적: 임플란트 실험 집단을 화학 조성에 의해 구분된 4개의 실험 집단의 수행에 있어서의 차이를 규명하고, 뼈 대용물의 골질 구획을 위해 한 최종 가장 바람직한 조성물을 규명하고자 함.
- 주요 발견: 3개의 실험 집단은 어떠한 해로운 면역반응도 나타내지 않았으며, 세 실험 집단 및 미네랄화되지 않은 네가티브 제어 집단은 세포 매개 직접 치환 메카니즘을 통해 뼈의 내부 성장을 지지하였으며; 세 임플란트 집단이 관찰된 장소 사이에 통계적으로 유의할만한 차이가 나타나지 않았으며, 세 실험 집단 모두 에서 관찰된 뼈 형성이 네가티브 제어 집단에 있어서 보다 통계적으로 유의할 만 할 정도로 높았다.
- 임플란트 디자인을 위한 이식: 본 연구에 의한 직접 치환 시스템은 본 발명에 따른 뼈 형성 메카니즘이, 종래의 뼈-이식편 대용물에서 관찰되는 전형적인 병치 메카니즘 보다, 태아 및 신생 동물(신생아 포함)의 성장판에서 일어나는 모형 뼈 형성에 더욱 더 가깝다는 것을 제시하고 있다. 이러한 미네랄화되지 않은 제어에 있어서의 치환 메카니즘의 존재는 임프란트의 유기 성분이 이러한 특성을 부여한다는 사실을 제시하고 있다.
임플란트에 대한 공극 크기는 임플란트의 골질 구획의 평균 공극 크기를 감소시킴으로써 이러한 치환 메카니즘을 설명하기 위하여 변경될어야 할 것이다.
세 실험 집단의 뼈 형성 양상에 있어서 상당한 차이가 나타나지 않는다는 사실은 공정의 파라미터가 대부분의 임플란트 미네랄 조성물을 규명하는 데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
시험 2: 염소 뼈 연골 결함 모델
연구의 목적은 골수 자극 기술(연골하 드릴링)의 결과를 개선하는 수단으로서 뼈 대용물의 성능을 평가하는 것이다.
- 동물: 골격이 성숙한 수컷 스페인 염소 산양
- 결함: 4mm 직경 및 6mm 깊이를 가지는 뼈 연골 결함(활차 그루우브에 하나; 측면 관절 돌기에 하나).
- 이식 기간: 16주.
- 실험 집단: 기본형이 되는 뼈 대용물의 6개 임플란트.
- 제어 집단: 종래의 연골하 드릴링을 모방한 6개의 결함(즉, 임플란트를 포함하지 않음).
- 연구 목적: 골수 자극을 돕는 보조 수단으로서, 뼈 대용물의 성능 평가
- 주요 발견: 뼈 대용물의 취급 특성에 관하여 외과의사로부터의 피드백은 예외없이 매우 긍정적이었다.
첨부 1
2004년 10월 28일자 출원된 국제출원 PCT / GB04 /004550호의 명세서 기재 내용
본 발명은 생물의학적 적용을 위한 합성 뼈, 치과 재료 및 재생 골격 분야에 관한 것이고, 특히, 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 합성 뼈, 치과 재료 및 재생 골격 및 이들의 전구체에 관한 것이다.
천연 뼈는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸을 포함하는 비콜라겐성 유기 상, 및 칼슘 포스페이트의 생체복합물이다. 이의 복잡한 계층 구조는 높은 강성, 강도, 및 골절 인성을 포함하는 예외적인 기계적 특성을 유도하고, 매일같이 뼈에 가해지는 생리적 스트레스에 뼈가 견딜 수 있게 한다. 당해 분야의 연구자들의 당면 과제는 인체 또는 동물체내에서 합성 물질 및 그 주위에 천연 뼈가 성장할 수 있는 조성 및 구조를 지니는 합성 물질을 만들어 낸다는 것이다.
뼈가 신체 환경에서 형성된 뼈-유사 인회석 층을 통해 인체내에서 칼슘 포스페이트에 직접 결합하는 것(생체활성으로 언급되는 특성)이 관찰되었다. 반면 콜 라겐, 및 콜라겐과 글리코스아미노글리칸과 같은 다른 생체유기물질을 포함하는 공중합체가 수많은 세포 타입의 부착 및 증식을 위해 인체내에서 뼈의 생성 및 유지를 위해 필요한 것을 포함하는 최적의 기질인 것으로 알려져 있다.
히드록시인회석은 뼈 대용 물질에서 구성요소로서 가장 일반적으로 사용되는 칼슘 포스페이트이다. 그러나, 이것은 브러사이트, 트리칼슘 포스페이트 및 옥타칼슘 포스페이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 다른 형태와 비교하여 비교적 불용성인 물질이다. 인회석의 비교적 낮은 용해성은 신체내에서 재흡수율이 특히 낮기 때문에 생체물질을 제조할 때 불리할 수 있다.
히드록시인회석과 같은 칼슘 포스페이트는 기계적으로 강성인 물질이다. 그러나, 이들은 천연 뼈에 비하여 비교적 부서지기 쉽다. 콜라겐은 기계적으로 인성 물질이나, 천연 뼈에 비하여 비교적 강성이 낮다. 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공중합체를 포함하는 재료는 콜라겐 단독보다 인성이고 강성이나, 여전히 천연 뼈에 비하여에 비하여 강성을 지닌다.
히드록시인회석 보다 개선된 기계적 인성 및 콜라겐 및 콜라겐과 글리코스아미노글리칸의 공중합체 보다 개선된 강성을 지니는 합성 뼈-대용 물질을 제조하려는 당해 기술분야에 있어 종래의 시도로서, 콜라겐 및 인회석을 기계적 혼합에 의해 조합하는 방법이 있다. 상기 기계적 방법은 EP-A-0164 484호에 기재되어 있다.
이후의 기술적 진보로는 히드록시인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 기계적 혼합시키는 것을 포함하여, 뼈-대체 물질을 제조하는 방법이 있다. 이것은 EP-A-0214070호에 기술되어 있다. 상기 문헌은 콜라겐에 콘드로이틴-4-설페 이트를 탈수소가열로 가교시키는 것을 추가로 기술한다. 인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 포함하는 물질이 양호한 생체적합성을 지님이 발견되었다. 인회석을 콜라겐, 및 선택적으로 콘드로이틴-4-설페이트와 기계적으로 혼합시켜 본질적으로 인회석의 콜라겐/콘드로이틴-4-설페이트-코팅된 입자를 형성한다. 상기 물질이 인체 또는 동물체내에 존재할 때 생체적합성임에도 불구하고 천연 뼈의 제한된 내증식을 일으키며 합성 물질의 칼슘 포스페이트 상이 개질되지 않음이 발견되었다.
본 발명은 종래 분야와 관련된 적어도 일부의 문제점들을 해소하기 위해 고안된 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 복합 물질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 콜라겐, 칼슘원 및 인 소스, 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 산성 수용액을 제공하는 단계, 및 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 수용액으로부터 함께 침전시켜 삼성분 공침물을 형성하는 단계를 포함한다.
삼성분 공침물이란 용어는 동일한 용액/분산액으로부터 실질적으로 동시에 침전된 세 가지 화합물의 침전물을 언급한다. 이것은, 특히 성분들이, 예를 들어 상이한 용액에서 개별적으로 침전되는 경우에 성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과는 구별된다. 공침물의 미세구조는 그 성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과는 실질적으로 상이하다.
제1 측면에서, 용액은 2.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 2.5 내지 5.5의 pH 를 지니는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 용액의 pH가 3.0 내지 4.5이다. 또한 더욱 바람직하게는, 용액의 pH가 3.8 내지 4.2이다. 가장 바람직하게는, 용액의 pH가 약 4이다.
칼슘원은 칼슘 니트레이트, 칼슘 아세테이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 알콕사이드, 수산화칼슘, 칼슘 실리케이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 글루코네이트 및 헤파린의 칼슘 염 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 헤파린의 칼슘 염은 돼지의 장 점막으로부터 유래될 수 있다. 적합한 칼슘 염이 시그마-알드리치 인크(Sigma-Aldrich Inc.)로부터 시판된다.
인 소스는 암모늄-디히드로겐 포스페이트, 디암모늄 히드로겐 포스페이트, 인산, 이나트륨 수소 오르쏘포스페이트 2-수화물 (Na2HPO4.2H2O, 종종 GPR 소렌슨 염이라 불림) 및 트리메틸 포스페이트, 포스페이트의 알칼리 금속 염 (예컨대, Na 또는 K), 포스페이트의 알칼리토류 염 (예컨대, Mg 또는 Ca) 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
글리코스아미노글리칸은 반복 이당류 유닛을 함유하는 비분지된 장쇄 다당류를 함유하는 거대분자의 패밀리이다. 바람직하게는, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 더마틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트 및 히알루론산으로부터 선택된다. 콘드로이틴 설페이트는 콘드로이틴-4-설페이트 또는 콘드로이틴-6-설페이트일 수 있고, 둘 모두는 시그마-알드리치 인크로부터 시판된다. 콘드로이틴-6-설페이트는 상어 연골로부터 유래될 수 있다. 히알루론산은 사람 탯줄로부터 유래될 수 있다. 헤파린은 돼지의 장 점막으로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 삼성분 공침물의 침전시, 용액의 온도가 4.0 내지 50℃이다. 보다 바람직하게는, 용액이 15 내지 40℃의 온도를 지닌다. 용액의 온도가 20 내지 30℃의 실온일 수 있으며, 바람직한 온도는 20 내지 27℃이다. 가장 바람직하게는, 온도가 약 25℃이다.
수용액 중 칼슘 이온의 농도는 통상적으로 0.00025 내지 1 moldam-3이고, 바람직하게는 0.001 내지 1 moldam-3이다. 상기 방법이 여과 및/또는 저온 건조의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 수용액 중 칼슘 이온의 농도는 0.05 내지 0.5 moldam-3 (예를 들어, 0.08 내지 0.25 moldam-3)인 것이 보다 바람직하고, 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5 moldam-3이다. 상기 공정이 동결 건조 및 선택적으로 사출 성형의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 수용액 중 칼슘 이온의 농도는 0.01 내지 0.3 moldam-3인 것이 보다 바람직하고, 가장 바람직하게는 0.05 내지 0.18 moldam-3이다.
바람직하게는, 용액이 포스페이트 이온을 포함하고, 용액 중 포스페이트 이온의 농도는 통상적으로 0.00025 내지 1 moldam-3이며, 바람직하게는 0.001 내지 1 M이다. 상기 공정이 여과 및/또는 저온 건조의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경 우, 용액 중 포스페이트 이온의 농도는 0.05 내지 0.5 moldam-3인 것이 보다 바람직하고, 또한 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 M이며, 예를 들어 0.1 내지 0.35 moldam-3이다. 상기 공정이 동결 건조 및 선택적으로 사출 성형의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 용액 중 포스페이트 이온의 농도는 0.01 내지 0.3 moldam-3인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.18 M이다.
침전에 앞서 용액 중 콜라겐 대 하나 이상의 글리코스아미노글리칸의 총 량의 중량비는 8:1 내지 30:1인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 콜라겐 대 하나 이상의 글리코스아미노글리칸의 총 량의 중량비는 10:1 내지 12:1이고, 가장 바람직하게는 중량비가 11:1 내지 23:2이다.
바람직하게는, 삼성분 공침물 중 콜라겐 대 브러사이트의 중량비는 10:1 내지 1:100이고, 보다 바람직하게는 5:1 내지 1:20이고, 또한 더욱 바람직하게는 3:2 내지 1:10이며, 가장 바람직하게는 3:2 내지 1:4이다.
침전에 앞서 용액 중 콜라겐의 농도는 통상적으로 1 내지 20 g/L이고, 보다 바람직하게는 1 내지 10 g/L이다. 상기 공정이 여과 및/또는 저온 건조의 단계를 포함하는 경우, 용액 중 콜라겐의 농도는 1 내지 10 g/L인 것이 보다 바람직하고, 또한 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2.5 g/L이며, 가장 바람직하게는 1.5 내지 2.0 g/L이다. 상기 공정이 동결 건조 및 선택적으로 사출 성형을 포함하는 경우, 침전에 앞서 용액 중 콜라겐의 농도는 5 내지 20 g/L인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5 내지 12 g/L이며, 가장 바람직하게는 9 내지 10.5 g/L이다.
침전에 앞서 용액 중 하나 이상의 글리코스아미노글리칸의 총 농도는 통상적으로 0.01 내지 1.5 g/L이고, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 g/L이다. 상기 공정이 여과 및/또는 저온 건조의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 용액 중 하나 이상의 글리코스아미노글리칸의 총 농도는 0.03 내지 1.25 g/L인 것이 보다 바람직하고, 또한 더욱 바람직하게는 0.125 내지 0.25 g/L이며, 가장 바람직하게는 0.13 내지 0.182 g/L이다. 상기 공정이 동결 건조 및 선택적으로 사출 성형의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 용액 중 하나 이상의 글리코스아미노글리칸의 총 농도는 0.15 내지 1.5 g/L인 것이 보다 바람직하고, 또한 더욱 바람직하게는 0.41 내지 1.2 g/L이며, 가장 바람직하게는 0.78 내지 0.96 g/L이다.
용액은 칼슘 이온을 포함하는 것이 바람직하고, 콜라겐 대 칼슘 이온의 중량비는 통상적으로 1:40 내지 500:1이다. 상기 공정이 여과 및/또는 저온 건조의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 콜라겐 대 칼슘 이온의 중량비는 1:40 내지 250:1인 것이 보다 바람직하고, 또한 더욱 바람직하게는 1:13 내지 5:4이며, 가장 바람직하게는 1:13 내지 1:2이다. 상기 공정이 동결 건조 및 선택적으로 사출 성형의 부가적인 추가 단계를 포함하는 경우, 콜라겐 대 칼슘 이온의 중량비는 1:8 내지 500:1인 것이 바람직하고, 또한 더욱 바람직하게는 5:12 내지 30:1이며, 가장 바람직하게는 5:5 내지 5:1이다.
침전은 콜라겐, 칼슘원, 인 소스 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 산성 수용액에서 조합하고, 침전이 일어날 때까지 용액을 방치하고, 용액을 교반하고, 암모니아와 같은 염기성 적정제를 사용하여 적정하고, 미리 제조된 브러사이트 와 같은 핵형성제를 첨가하고, 칼슘원의 첨가 속도를 변화시키고, 상기 기술을 임의로 조합시킴에 의해 수행될 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 콜라겐, 옥타칼슘 포스페이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생체 적합 복합 물질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 복합 물질을 제공하는 단계, 및 복합 물질 중 브러사이트의 적어도 일부를 가수분해에 의해 옥타칼슘 포스페이트로 전환시키는 단계를 포함한다.
생체물질이란 용어는 인체 또는 동물체에 대해 생체적합한 물질을 언급한다.
제2 측면에서, 복합 물질은 바람직하게 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다. 삼성분 공침물은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 본원에 기술된 공정에 의해 형성될 수 있다.
브러사이트를 옥타칼슘 포스페이트로 가수분해시키는 단계는 바람직하게 삼성분 공침물을 수용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 수용액의 pH는 옥타칼슘 포스페이트가 열역학적으로 브러사이트 보다 안정해지는 pH이거나 그 이상의 pH이다. 바람직하게는, 수용액의 pH가 6 내지 8이다. 보다 바람직하게는, 수용액의 pH가 6.3 내지 7이다. 가장 바람직하게는, 상기 수용액이 약 6.65의 pH를 지닌다. 수용액은, 예를 들어 pH가 적정제, 완충 용액, 또 다른 칼슘-함유 화합물 및/또는 인-함유 화합물에 대해 포화된 용액으로 조정된 탈이온수를 포함할 수 있다. 바람직한 수용액은 암모니아를 사용하여 요망되는 pH로 적정된 아세트산을 포함한다.
바람직하게는, 브러사이트를 옥타칼슘 포스페이트로 가수분해시키는 단계가 20 내지 50℃, 보다 바람직하게는 30 내지 40℃, 또한 더욱 바람직하게는 36 내지 38℃, 가장 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 브러사이트를 옥타칼슘 포스페이트로 가수분해시키는 단계가 12 내지 144시간, 보다 바람직하게는 18 내지 72시간, 가장 바람직하게는 24 내지 48시간 동안 수행된다.
제3 측면에서, 본 발명은 콜라겐, 인회석 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생체 적합 복합 물질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 복합 물질을 제공하는 단계, 및 복합 물질 중 브러사이트의 적어도 일부를 가수분해에 의해 인회석으로 전환시키는 단계를 포함한다.
인회석은 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 미네랄류이며, 일반식 Ca5(PO4)3(X) (상기 식에서, X는 통상적으로 OH-, F- 및 Cl-인 이온 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 이온일 수 있다)를 지닌다. 인회석은 또한 규소-치환된 인회석과 같은 치환된 인회석을 포함한다. 인회석은 히드록시인회석이고, 이것은 인회석의 특정 예이다. 히드록시인회석은 또한 규소로 치환될 수 있다.
제3 측면에서, 복합 물질은 바람직하게 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다. 삼성분 공침물은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 본원에 기술된 방법에 따라 형성될 수 있다.
바람직하게는, 브러사이트를 인회석으로 가수분해시키는 단계는 삼성분 공침물을 수용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 수용액의 pH는 인회석이 열역학적으로 브러사이트 보다 안정해지는 pH이거나 그 이상의 pH이다. 바람직하게는, 브러사이트를 인회석으로 전환시키기 위한 수용액의 pH가 6.65 내지 9이고, 보다 바람직하게는 7 내지 8.5이며, 또한 더욱 바람직하게는 7.2 내지 8.5이다. 수용액은, 예를 들어 pH가 적정제, 완충 용액, 또 다른 칼슘-함유 화합물 및/또는 인-함유 화합물에 대해 포화된 용액으로 조정된 탈이온수를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 브러사이트를 인회석으로 가수분해시키는 단계가 20 내지 50℃, 보다 바람직하게는 30 내지 40℃, 또한 더욱 바람직하게는 36 내지 38℃, 가장 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 브러사이트를 인회석으로 가수분해시키는 단계가 12 내지 288시간, 보다 바람직하게는 18 내지 72시간, 가장 바람직하게는 24 내지 48시간 동안 수행된다.
브러사이트가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환되는 속도를 증가시키는 방법으로는 (i) 온도, (ii) 용액 중 브러사이트 농도, 및/또는 (iii) 교반 속도를 증가시키는 방법이 있다.
인회석 및 옥타칼슘 포스페이트 둘 모두를 포함하는 본 발명에 따른 생체물질을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 제2 및 제3 측면의 방법은 옥타칼슘 포스페이트 및 인회석 둘 모두를 포함하는 물질을 제공하기 위해 조합될 수 있다. 삼성분 공침물 중 브러사이트가 먼저 옥타칼슘 포스페이트로 전환된 다음 옥타칼슘 포스페이트가 부분적으로 인회석으로 전환될 수 있다. 브러사이트 또는 옥타칼슘 포스페이트의 인회석으로의 전체 전환 또는 전체에 근접한 (즉, 98% 이상) 전환은 통상적으로 8.0 이상의 pH에서 약 12시간 동안의 가수분해에 의해 일어난다. 물질 중 브러사이트 및/또는 인회석의 부분적인 전환은 따라서 12시간 미만 동안의 가수분해에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 옥타칼슘 포스페이트를 인회석으로 가수분해시키는 단계가 6.65 내지 10, 보다 바람직하게는 7.2 내지 10, 또한 더욱 바람직하게는 8 내지 9의 pH에서 수행된다.
옥타칼슘 포스페이트를 인회석으로 가수분해시키는 단계가 20 내지 50℃, 보다 바람직하게는 30 내지 40℃, 또한 더욱 바람직하게는 36 내지 38℃, 가장 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 옥타칼슘 포스페이트를 인회석으로 가수분해시키는 단계가 2 내지 144시간, 보다 바람직하게는 12 내지 96시간, 가장 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 수행된다.
본 발명의 제2 및 제3 측면에서, 브러사이트를 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환시키는 것은 30 내지 40℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 전환이 36 내지 38℃의 온도에서 수행된다. 가장 바람직하게는, 전환이 약 37℃의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 본 발명의 공정이 삼성분 공침물 중 하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및 콜라겐을 가교시키는 단계를 추가로 포함한다. 여기에서 삼성분 공 침물이란 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물 및 공침물의 유도체를 언급한다. 유도체는 브러사이트의 적어도 일부가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환된 공침물, 및 형상화되거나 성형되거나, 임의의 화학적 또는 기계적 프로세싱을 추가로 받은 공침물을 포함한다. 가교는 임의의 통상적인 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
바람직하게는, 브러사이트의 적어도 일부가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환되고, 글리코스아미노글리칸 및 콜라겐이 브러사이트가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환되기 전에 가교된다. 상기 가교는 삼성분 공침물에 감마 조사, 자외선 조사를 가하거나, 탈수소가열 처리하거나, 글루코오스, 만노오스, 리보오스 및 수크로오스와 같은 단당류를 이용한 무효소 당화하거나, 삼성분 공침물을 글루타르알데히드, 에틸 디메틸아미노프로필, 카르보디이미드 및/또는 노르-디히드로구아리아레트산 중 하나 이상과 접촉시키거나, 상기 방법 중 임의의 조합 중 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 당 분야에서 통상적이다.
바람직하게는, 브러사이트의 적어도 일부가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환되고, 브러사이트가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환된 다음 글리코스아미노글리칸 및 콜라겐이 가교된다. 브러사이트가 인회석/옥타칼슘 포스페이트로 전환된 후의 가교는 상기 언급된 방법 중 하나 이상 또는 탈수소가열 처리, 또는 상기 방법의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다. 탈수소가열 처리는 상승된 온도에서 기질에 저압 대기를 가하는 것이다. 탈수소가열 처리 온도는 95 내지 135℃일 수 있다. 상기 온도는, 탈수소가열 처리가 통상적으로 18 내지 36시 간 후에 완료되는 것이 바람직한 경우, 100 내지 110℃인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 105 내지 110℃일 수 있다. 상기 온도는, 탈수소가열 처리가 통상적으로 4 내지 8시간 후에 완료되는 것이 바람직한 경우, 120 내지 135℃인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 125 내지 135℃일 수 있다.
바람직하게는, 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸이 브러사이트가 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환되기 이전 및 이후 둘 모두에 가교된다.
본 발명의 방법은 생체 적합 복합 물질을 뼈 또는 치아 대용물로서 사용하기 적합한 구조로 형상화시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 삼성분 공침물 형성 후, 그러나 브러사이트의 임의의 전환 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 가교가 일어나기 전에 일어날 수 있다.
또는, 생체물질을 형상화시키는 단계는 인회석 및/또는 옥타칼슘 포스페이트로의 브러사이트의 전환 또는 콜라겐과 글리코스아미노글리칸의 가교에 후속하여 일어날 수 있다.
바람직하게는, 복합 물질은 (i) 여과 및/또는 저온 건조, (ii) 동결 건조, (iii) 사출 성형 및 (iv) 냉각 프레싱으로부터 선택된 기술을 사용하여 형상화된다. 온도가 15 내지 40℃이고, 가장 바람직하게는 35 내지 40℃인 여과 및/또는 저온 건조는 통상적으로 조밀한 입자 형태의 물질을 생성한다. 동결 건조는 통상적으로 열린 다공성 형태를 생성한다. 사출 성형은 사용된 다이의 형상에 따라 매우 다양한 형상/형태의 물질을 생성한다. 냉각 프레싱은 통상적으로 조밀한 펠렛 형태를 생성한다.
본 발명은 합성 생체물질로 변형되기에 적합한 전구체 물질을 제공하며, 상기 전구체 물질은 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 복합 물질을 포함한다. 복합 재료는 바람직하게 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물을 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다. 삼성분 공침물은 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 콜라겐, 브러사이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생체 적합 복합 물질을 제공하고, 생체물질은 여기에 기술된 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 콜라겐, 옥타칼슘 포스페이트 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생체 적합 복합 물질을 제공하고, 생체물질은 본 발명의 제2 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 콜라겐, 인회석 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생체 적합 복합 물질을 제공하고, 생체물질은 본 발명의 제3 측면에 따른 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 브러사이트의 삼성분 공침물을 포함하는 생체 적합 복합 물질을 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 포스페이트 물질의 입자, 콜라겐 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생체물질을 제공하고, 콜라겐 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸은 가교되어 매트릭스를 형성하고, 칼슘 포스페이트 물질의 입자는 상기 매트릭스에 분산되며, 상기 칼슘 포스페이트 물질은 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석 중 하나 이상으로부터 선택된다.
하기 설명은 달리 언급되지 않는 한 본 발명에 따른 생체 적합 복합 물질의 모든 측면에 관한 것이다.
콜라겐 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸은 가교되는 것이 바람직하다.
콜라겐은 물질 중 5 내지 90 (건조) 중량%, 보다 바람직하게는 15 내지 60 (건조) 중량%, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 (건조) 중량%의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸이 물질 중 0.01 내지 12 (건조) 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 5.5 (건조) 중량%, 가장 바람직하게는 1.8 내지 2.3 (건조) 중량%의 양으로 존재한다.
바람직하게는, 물질이 브러사이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 브러사이트의 중량비는 10:1 내지 1:100 (건조)이고, 보다 바람직하게는 5:1 내지 1:20 (건조)이며, 가장 바람직하게는 3:2 내지 1:10 (건조)이고, 예를 들어 3:2 내지 1:4 (건조)이다.
바람직하게는, 물질이 옥타칼슘 포스페이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 옥타칼슘 포스페이트의 중량비는 10:1 내지 1:100 (건조), 보다 바람직하게는 5:1 내지 1:20 (건조)이며, 가장 바람직하게는 3:2 내지 1:10(건조)이다.
바람직하게는, 콜라겐 대 하나 이상의 글리코스아미노글리칸의 총 량의 중량비는 8:1 내지 30:1 (건조)이고, 보다 바람직하게는 10:1 내지 30:1 (건조)이며, 또한 더욱 바람직하게는 10:1 내지 12:1 (건조)이고, 가장 바람직하게는 11:1 내지 23:2 (건조)이다.
본 발명에 따른 생체 적합 복합 물질은 뼈 또는 치아 대용 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 생체 적합 복합 물질을 포함하는 합성 뼈 물질, 뼈 임플란트, 뼈 이식편, 뼈 대용물, 뼈 골격, 충전제, 코팅제 또는 시멘트를 제공한다. 코팅제란 용어는 본 발명의 생체물질 또는 전구체를 포함하는 임의의 코팅제를 포함한다. 코팅제는 인체 또는 동물체내에 사용되기 위해 보철 부재의 외부 또는 내부 표면, 뼈 또는 임의의 기질에 도포될 수 있으며, 이것은 미립 물질을 포함한다. 본 발명의 조성물은 뼈 및 치과 재료를 포함하나 이에 제한되지 않는 미네랄화된 생물학적 물질 모두의 생체내 및 생체외 둘 모두의 복구에 사용될 수 있다. 본 발명의 생체물질은 동종이식 및 자가이식의 성장에 이용될 수 있다.
옥타칼슘 포스페이트를 포함하는 본 발명에 따른 생체물질에는 임의의 전구체 브러사이트 상이 존재하지 않거나 본질적으로 존재하지 않을 수 있다. 생체물질은 생체물질의 칼슘 포스페이트 물질의 전체 양 중 2 중량% 미만의 브러사이트를 포함할 수 있다.
칼슘 포스페이트 물질은 순수한 옥타칼슘 포스페이트 또는 인회석 상을 포함하거나 본질적으로 이로 구성될 수 있다. 순수한 상이란 바람직하게 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 99.5% 이상의 요망되는 상 (x-선 회절에 의해 측정됨)을 함유하는 것을 의미한다. 또는, 생체물질은 요망되는 생체물 질의 특성에 따라, 옥타칼슘 포스페이트 및 인회석의 혼합물을 포함할 수 있다.
브러사이트를 포함하는 본 발명의 물질은 생체물질을 제조하기 위한 전구체 물질로서 사용될 수 있거나, 그 자체가 생체물질로서 적합할 수 있다.
본 발명에 따른 공정은 전부 또는 부분적으로 적용될 수 있는, 콜라겐, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및 하나 이상의 칼슘 포스페이트 구성성분의 생체복합물을 제조하는 연속적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 하기 설명은 예를 위해 제시된 것이며 본 발명에 따른 공정의 임의의 측면에 적용될 수 있다.
I: 산성 pH에서 콜라겐, GAG 및 칼슘 포스페이트 브러사이트의 삼성분 공침물
상기 단계는 용액으로부터의 침전을 통해 복합물의 세 가지(또는 그 이상) 구성성분의 동시 형성을 개시하고, 세 가지(또는 그 이상) 개별적인 상의 비를 조절하기 위해 수행된다. 복합물의 조성 특성의 조절 (및 특히 콜라겐:GAG:CaP 비)은 pH, 온도, 에이징 시간, 칼슘 이온 농도, 인 이온 농도, 콜라겐 농도 및 GAG 농도 중 하나 이상을 변화시켜 달성될 수 있다. pH는 일정하게 유지되거나 (예를 들어, 완충액, pH-스탯(stat) 적정 또는 기타 방법) 다양할 수 있다. 가능한 2차(오염물질) 상으로는 기타 산성 칼슘 포스페이트(예컨대, 모네타이트, 칼슘 히드로겐 포스페이트), 및 적정 및 반응물 첨가의 부산물을 포함하는 착물이 있다(예컨대, 암모늄 포스페이트, 암모늄 니트레이트). 가교를 돕는 첨가제(예컨대, 글루코오스, 리보오스) 또는 생체내 반응을 증진시키는 첨가제(예컨대, 성장 인자, 유전자 전사 인자, 규소, 나트륨이뇨 펩티드)가 또한 상기 단계 동안 첨가될 수 있다.
II: 최종 형상 형성
상기 단계는 특히 포어 구조에 중점을 둔 요망되는 구조의 최종 복합물 형태를 생성하기 위해 수행될 수 있다. 예시가 되는 기술로는 여과 및 저온 건조(조밀한 입자 형태를 생성함), 동결 건조(열린 다공성 형태를 생성함), 사출 성형(다이의 형태에 따라 광범한 형상을 생성함) 및 냉각 프레싱(조밀한 펠렛 형태를 생성함)이 있다.
III: 1차 가교
상기 단계는 상승된 pH의 용액에 존재하는 경우, 바람직하게 복합물의 GAG 함량을 신속하게 벗어나지 않으며, 더욱이 복합물의 기계적 특성 및 붕괴 특성을 증진시킴을 확실하게 하기 위해 수행될 수 있다. 예시가 되는 기술로는 저온 물리적 기술(예컨대, 감마 조사, 자외선 조사, 탈수소가열 처리), 화학적 기술(예컨대, 단당류, 글루타르알데히드, 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드, 노르-디히드로구아리아레트산을 이용한 무효소 당화), 또는 조합 방법(예컨대, 동시 무효소 당화 및 감마-조사)가 있다. 옥타칼슘 포스페이트로의 전환이 요망되는 경우 (즉, 단계 IV), 1차 가교가 바람직하게 약 37℃ 미만의 온도에서 수행되어 브러사이트 상이 이의 탈수화된 형태, 즉 옥타칼슘 포스페이트로 용이하게 가수분해되지 않는 칼슘 포스페이트인 모네타이트로 전환되는 것을 억제한다.
IV. 가수분해
상기 단계는 CaP 상을 브러사이트 (생리학적 pH에서 높은 용해성을 지니는 상)로부터 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석 (생리학적 pH에서 보다 낮은 용해 성을 지니는 상)으로 부분적으로 또는 완전히 가수분해하고, 임의의 가용성 오염물질 상(예컨대, 암모늄 니트레이트, 칼슘 히드로겐 포스페이트)을 실질적으로 제거하기 위해 수행될 수 있다. OCP로 가수분해되는 경우, 선택된 pH는 (완충액, pH 스탯, 또는 기타 방법을 사용하여) 약 6.65에서 일정하게 유지되는 것이 바람직하며, 온도는 약 24 내지 48시간 동안 약 37℃에서 유지된다. 단계 I의 경우와 같이, 가교를 돕는 첨가제(예컨대, 글루코오스, 리보오스) 또는 생체내 반응을 증진시키는 첨가제(예컨대, 성장 인자, 유전자 전사 인자, 규소, 나트륨이뇨 펩티드)가 또한 가수분해 단계(단계 IV) 동안에 첨가될 수 있다.
V: 2차 가교
상기 단계는 복합물의 기계적 특성 및 붕괴 특성을 추가로 조절하기 위해 수행될 수 있다. 임의의 가교 공정 또는 상기 단계 III에 개시된 모든 가교 공정이 2차 가교를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
하기 실시예 및 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 추가로 돕기 위해 제공된 것이다. 실시예 및 도면이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 실시예 또는 도면에 기술된 임의의 특징은 상기 설명의 임의의 측면에 적용될 수 있다.
실시예
실시예 1
실시예 1은 단계 I 내지 III만을 적용하여 수행된, 상기 기술된 합성 방법의 예이다. 삼중 공동-침전이 실온(20 내지 25℃)에서 약 3.2 (암모니아를 이용한 적 정에 의해 유지됨)의 pH로 수행된다. 상기 실시예에서, 공침물을 37℃에서 건조시키고, 탈수소가열 처리를 통해 가교시킨다. CaP의 가수분해 전환은 물론 2차 가교도 본 실시예에서 수행되지 않는다.
재료
콜라겐: 재구성됨, 펩신-추출된 돼지 피부 콜라겐(아텔로콜라겐); 85% 타입 I, 15% 타입 III; 재팬 미트 팩커스(Japan Meat Packers, Osaka, Japan)
GAG: 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (BDH Laboratory Supplies, Poole, United Kingdom)
적정제: 암모니아; NH3; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
절차
단계 I
용액 A:
- Ca(OH)2를 0.12M의 농도로 실온에서 0.48M H3PO4에 용해시키고, 생성된 용액을 암모니아를 이용하여 pH = 3.2까지 적정하였다.
현탁액 B:
- 콘드로이틴-6-설페이트를 3.2 g/L의 농도로 탈이온수에 용해시켰다. 이후 일정한 교반하에, Ca(NO3)2.4H2O 및 Ca(OH)2를 1.5의 니트레이트:히드록사이드 몰 비로 콘드로이틴 설페이트 용액에 첨가하여, 총 칼슘 농도가 2.4M인 현탁액을 제조하였다.
- 0.144g의 콜라겐을 20mL의 용액 A에 첨가하고, 용해될 때까지 균질화기를 이용하여 혼합시켰다. 이후 4mL의 현탁액 B를 일정한 교반하에 용액 A에 첨가하였다.
- 교반을 60분 동안 지속하고, 3.15 < pH < 3.30 범위가 유지되는지를 확인하기 위해 pH를 모니터링하였다. 생성된 슬러리를 24시간 동안 실온에서 에이징하였다.
단계 II
- 슬러리를 공기 중 37℃에서 5일 동안 건조시키고, 남아있는 삼성분 공침물을 탈이온수로 세정한 다음, 37℃에서 추가로 24시간 동안 다시 건조시켰다.
- 생성된 삼성분 공침물의 x-선 회절 패턴을 도 1에 도시하며 (Cu-K(알파) 조사) SEM 이미지를 도 2에 도시한다.
단계 III
삼성분 공침물을 105℃에서 50mTorr의 진공하에 48시간 동안 탈수소가열 처리(DHT)를 통해 가교시켰다. DHT 후 삼성분 공침물의 TEM 이미지를 도 3에 도시한다. 도 4는 DHT 후 삼성분 공침물의 x-선 회절 패턴을 도시하며, 이것은 브러사이트 상이 이의 탈수화된 형태인 모네타이트로 전환되었음을 나타낸다.
실시예 2
실시예 2는 단계 I 내지 IV만을 적용하여 수행된, 상기 기술된 합성 방법의 예이다. 삼중 공동-침전이 실온에서 4.0의 pH로 수행된다. 상기 실시예에서, pH 조절은 수산화칼슘 및 칼슘 니트레이트 농도의 신중한 조절에 의해 수행된다 - 또한 삼성분 공침물 중 브러사이트 대 콜라겐 및 GAG의 질량 비를 조절할 수 있는 접근법. 이후 생성된 삼성분 공침물을 -20℃까지 동결시키고, 진공하에 둔 다음, 가열시켜 미결합된 물(즉, 얼음)의 승화를 유도하였다. 1차 가교를 1-에틸 3-(3-디메틸 아미노프로필)카르보디이미드 처리를 이용하여 수행하였다. 이후 수득된 건조된 삼성분 공침물을 6.67의 pH에서 약 37℃로 가수분해에 의해 옥타칼슘 포스페이트로 전환시켰다. 상기 실시예에서, 2차 가교는 수행되지 않았다.
재료
타입 I: 소 힘줄로부터 용해된 산, 인테그라 라이프 사이언시즈 플레인스보로(Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA)
GAG: 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
적정제: 없음
가교제: (i) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (=EDAC); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) N-히드록시숙신이미드 (=NHS); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
절차
단계 I
- 브러사이트 대 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 표적 질량 비를 1:1로 선택하였다.
- 200mL의 총 반응 부피 중 콜라겐 및 GAG의 농도를 21mg/mL로 설정하였다.
- (i) 이온성 농도 (즉, [Ca2 +] = [H3PO4]) 및 (ii) 칼슘 니트레이트 : 수산화칼슘의 비를 다르게 한 경험적인 pH 변화의 3차원 지도(1.0의 [Ca2 +] 대 [P] 반응 이온 비 상수에서 생성됨)를 이용하여, 4.0에서 일정하게 유지된 pH에 관해서 점 궤적을 규명하였다. 이를 도 5에 도시한다 (pH = 4.0을 유지하기 위한 이온성 농 도 및 칼슘 니트레이트 : 수산화칼슘 비의 조합 세트).
- 동일 축을 지니는 브러사이트 질량 수율의 지도 상에 상기 점 궤적을 겹치고, 21mg/mL 선과의 교차점을 규명하여 1:1 질량 비의 칼슘 포스페이트(21mg/mL) 대 콜라겐 및 GAG(21mg/mL)를 함유하는 삼중 공동침전물 슬러리가 pH 4.0([Ca2 +] = [H3PO4] = 0.1383M; Ca(NO3).4H2O : Ca(OH)2 = 0.1356)에서 생성될 수 있는 반응 농도를 설정하였다. 도 6 참조: 1:1 질량 비의 칼슘 포스페이트 대 콜라겐 및 GAG를 함유하는 삼중 공동침전물 슬러리의 pH 4.0 합성에 대한 조건의 규명.
- 3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다.
- 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 14.3mL로 분산되어 GAG 용액을 생성하였다.
- 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다.
- 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼중 공동침전물 슬러리를 생성하고, 이후 14.3mL의 0.1383M H3PO4를 슬러리에 추가로 혼합시켰다.
- 삼중 공동침전물 슬러리의 pH는 약 4.0이다.
- 삼중 공동침전물 슬러리를 25℃에서 48시간 동안 유지하였다.
단계 II
- 삼중 공동침전물 슬러리를 -20℃의 냉동기에 두고 밤새 응고시켰다.
- 이후 결빙된 슬러리를 냉동기로부터 제거하고, 약 80mTorr의 진공에 놓고, 온도를 실온으로 상승시켜 슬러리로부터 얼음의 승화를 유도하였으며, 이것은 48시간 동안 진행되었다.
- 미결합된 물을 제거한 후의 콜라겐/GAG/브러사이트 삼성분 공침물의 x-선 회절 패턴(Cu-K (알파) 조사)을 도 7에 도시하며, 공침물 표면의 SEM 이미지를 도 8에 도시한다 (CaP : 콜라겐 + GAG = 1:1인 삼성분 공침물 표면의 2차(SE) 및 후방산란된 전자(BSE) 이미지).
단계 III
- 미결합된 물을 완전히 제거한 후, 1.25g의 수득된 건조 삼중 공동침전물을 40mL의 탈이온수로 20분 동안 수화시켰다.
- 20mL의 0.035M EDAC 및 0.014M NHS 용액을 삼중 공동침전물 및 탈이온수를 함유하는 컨테이너에 첨가하고, 삼중 공동침전물을 2시간 동안 실온에서 부드러운 교반하에 가교시켰다.
- EDAC 용액을 제거하고, 삼중 공동침전물을 포스페이트 완충 용액(PBS)으로 세정하고, 새로운 PBS에서 가벼운 교반하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
- PBS에서 2시간 후, 삼중 공동침전물을 탈이온수로 세정하고, 37℃에서 가벼운 교반하에 2회의 10분 간격으로 인큐베이션하였다.
- 이후 삼중 공동침전물을 37℃에서 72시간 동안 건조시켰다. 도 9는 EDAC 가교 후 콜라겐/GAG/브러사이트 삼중 공동침전물의 x-선 회절 패턴을 도시한다 (Cu-K(알파) 조사).
단계 IV
- 가교된 삼중 공동침전물 입자를 37℃에서 50mL의 탈이온수에 놓고, 암모니아를 이용하여 용액의 pH를 6.67로 조정하였다.
- 온도 및 pH를 48시간 동안 일정하게 유지하고, 이후 공침물을 여과하고, 탈이온수로 세정하고, 공기 중에서 37℃로 건조시켰다.
- OCP로 전환 이후 공동침전물의 x-선 회절 패턴을 도 10에 도시한다 (콜라겐/GAG/OCP 생체복합물을 형성하기 위해 37℃에서 72시간 동안 pH 6.67에서 OCP로 전환된 후 EDAC-가교된 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물, Cu-K(알파) 조사).
실시예 3
실시예 3은 단계 I 내지 V를 적용하여 수행된, 상기 기술된 합성 방법의 예이다. 삼중 공동-침전이 실온에서 약 4.5의 pH로 수행된다. 실시예 2와 같이, pH 조절은 적정제를 사용하지 않고 수산화칼슘 및 칼슘 니트레이트 농도의 신중한 조절에 의해 수행된다. 이후 생성된 삼성분 공침물을 -20℃까지 동결시키고, 진공하 에 둔 다음, 가열시켜 미결합된 물(즉, 얼음)의 승화를 유도하였다. 1차 가교를 1-에틸 3-(3-디메틸 아미노프로필)카르보디이미드 처리를 이용하여 수행하였다. 이후 수득된 건조된 공동침전물을 8.50의 pH에서 37℃로 인회석으로 전환시켰다. 2차 가교는 감마 조사를 이용하여 수행되었다.
재료
타입 I: 소 힘줄로부터 용해된 산, 인테그라 라이프 사이언시즈 플레인스 (NJ, USA)
GAG: 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
적정제: 없음
가교제: (i) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (=EDAC); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) N-히드록시숙신이미드 (=NHS); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
절차
단계 I
- 브러사이트 대 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 표적 질량 비를 3:1로 선택하였다.
- 200mL의 총 반응 부피 중 콜라겐 및 GAG의 농도를 10 mg/mL로 설정하였다.
- (i) 이온성 농도 (즉, [Ca2 +] = [H3PO4]) 및 (ii) 칼슘 니트레이트 : 수산화칼슘의 비를 다르게 한 경험적인 pH 변화의 3차원 지도(1.0의 [Ca2 +] 대 [P] 반응 이온 비 상수)를 이용하여, 4.5에서 일정하게 유지된 pH에 관해서 점 궤적을 규명하였다. 이를 도 11에 도시한다 (pH = 4.5을 유지하기 위한 이온성 농도 및 칼슘 니트레이트 : 수산화칼슘 비의 조합 세트).
- 브러사이트 질량 수율(동일한 축을 지님)의 지도 상에 상기 점 궤적을 겹치고, 30mg/mL(즉, 콜라겐 및 GAG의 3배 농도) 선과의 교차점을 규명하여 3:1 질량 비의 칼슘 포스페이트(30mg/mL) 대 콜라겐 및 GAG(10mg/mL)를 함유하는 삼중 공동침전물 슬러리가 pH 4.5([Ca2 +] = [H3PO4] = 0.1768M; Ca(NO3).4H2O : Ca(OH)2 = 0.049)에서 생성될 수 있는 반응 농도를 설정하였다. 이것을 도 12에 도시한다: 3:1 질량 비의 칼슘 포스페이트 대 콜라겐 및 GAG를 함유하는 삼중 공동침전물 슬러리의 pH 4.5 합성에 대한 조건의 규명.
- 1.837g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1768M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동 안 혼합하여 콜라겐 분산액을 생성하였다.
- 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.163g의 GAG가 실온에서 0.1768M의 14.3 mL로 분산되어 GAG 용액을 생성하였다.
- 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다.
- 혼합한 지 90분 후, 2.498g의 Ca(OH2) 및 0.380g의 Ca(NO3)2.4H2O를 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼중 공동침전물 슬러리를 생성하고, 이후 14.3mL의 0.1768M H3PO4를 혼합 슬러리에 추가로 혼합시켰다.
- 삼중 공동침전물 슬러리의 pH는 약 4.5이다.
- 삼중 공동침전물 슬러리를 25℃에서 48시간 동안 유지하였다.
단계 II
- 삼중 공동침전물 슬러리를 -20℃의 냉동기에 두고 밤새 응고시켰다.
- 이후 결빙된 슬러리를 냉동기로부터 제거하고, 약 80mTorr의 진공에 놓고, 온도를 실온으로 상승시켜 슬러리로부터 얼음의 승화를 유도하였으며, 이것은 48시간 동안 진행되었다. 미결합된 물을 제거한 후의 콜라겐/GAG/브러사이트 삼성분 공침물의 x-선 회절 패턴(Cu-K (알파) 조사)을 도 13에 도시한다.
단계 III
- 미결합된 물을 완전히 제거한 후, 1.25g의 수득된 건조 삼중 공동침전물을 40mL의 탈이온수로 20분 동안 수화시켰다.
- 20mL의 0.018M EDAC 및 0.007M NHS 용액을 삼중 공동침전물 및 탈이온수를 함유하는 컨테이너에 첨가하고, 삼중 공동침전물을 2시간 동안 실온에서 부드러운 교반하에 가교시켰다.
- EDAC 용액을 제거하고, 삼중 공동침전물을 포스페이트 완충 용액(PBS)으로 세정하고, 새로운 PBS에서 가벼운 교반하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
- PBS에서 2시간 후, 삼중 공동침전물을 탈이온수로 세정하고, 37℃에서 가벼운 교반하에 2회의 10분 간격으로 인큐베이션하였다.
- 이후 삼중 공동침전물을 37℃에서 72시간 동안 건조시켰다. EDAC 가교 후 콜라겐/GAG/브러사이트 삼중 공동침전물의 x-선 회절 패턴 (Cu-K(알파) 조사)을 도 14에 도시한다.
단계 IV
- 가교된 삼중 공동침전물 입자를 37℃에서 브러사이트에 대해 미리 포화된 50mL의 탈이온수에 놓고, 암모니아를 이용하여 용액의 pH를 8.50으로 조정하였다.
- 온도 및 pH를 72시간 동안 일정하게 유지하고, 이후 공침물을 여과하고, 탈이온수로 세정하고, 공기 중에서 37℃로 건조시켰다. 인회석으로 전환 이후 공침물의 x-선 회절 패턴을 도 15에 도시한다 (콜라겐/GAG/인회석 생체복합물을 형성 하기 위해 37℃에서 72시간 동안 pH 8.50에서 인회석으로 전환된 후 EDAC-가교된 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물, Cu-K(알파) 조사).
단계 V
- 건조된 콜라겐/GAG/Ap 삼중 공동 침전물에 32.1kGy 선량의 감마 조사를 가하였다. 도 16은 감마 조사 후 x-선 회절 패턴을 도시한다 (감사 조사를 통한 2차 가교 후 EDAC-가교된 콜라겐/GAG/Ap 삼중 공동침전물).
실시예 4
재료
콜라겐: 재구성됨, 펩신-추출된 돼지 피부 콜라겐(아텔로콜라겐); 85 중량% 타입 I, 15 중량% 타입 III; 재팬 미트 팩커스(Osaka, Japan)
GAG: 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
적정제: 암모니아; NH3; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
절차
단계 I
- Ca(OH)2를 0.12M의 농도로 실온에서 0.48M H3PO4에 용해시켜 용액 A를 제조하고, 생성된 용액을 pH 3.2까지 적정하였다.
- 콘드로이틴-6-설페이트를 3.2 g/L의 농도로 탈이온수에 용해시켜 현탁액 B를 제조하였다. 이후 일정한 교반하에, Ca(NO3)2.4H2O 및 Ca(OH)2를 1.5의 니트레이트:히드록사이드 몰 비로 콘드로이틴 설페이트 용액에 첨가하여, 총 칼슘 농도가 2.4M인 현탁액을 제조하였다.
- 0.144g의 콜라겐을 20mL의 용액 A에 첨가하고, 용해될 때까지 균질화기를 이용하여 혼합시켰다. 이후 4mL의 현탁액 B를 일정한 교반하에 용액 A에 첨가하였다. 교반을 60분 동안 지속하고, 3.15 < pH < 3.30 범위가 유지되는지를 확인하기 위해 pH를 모니터링하였다. 생성된 슬러리를 24시간 동안 실온에서 에이징하였다.
단계 II
- 슬러리를 공기 중 37℃에서 5일 동안 건조시키고, 남아있는 삼성분 공침물을 탈이온수로 세정한 다음, 37℃에서 추가로 24시간 동안 다시 건조시켰다.
단계 III
- 공동 침전물을 희석된 아세트산 (pH = 3.2) 중에 두고, 30kGy 선량의 감마선을 조사하였다. 이후 가교된 침전물을 용액으로부터 제거하고, 세정하고, 공기 중에서 37℃에서 건조시켰다.
단계 IV
- 가교된 공침물 입자를 37℃에서 50mL의 탈이온수에 두고, 용액의 pH를 암모니아를 이용하여 6.65로 조정하였다. 온도 및 pH를 48시간 동안 일정하게 유지하고, 이후 공침물을 여과하고, 탈이온수로 세정하고, 공기 중에서 37℃에서 건조시켰다.
단계 V
- 가교되고 가수분해된 공침물 입자를 실온에서 진공 오븐내에 두고, 50mTorr의 진공을 가한 후, 온도를 105℃까지 증가시켰다. 24시간 후, 온도를 실온으로 낮추고, 진공을 해제하였다.
도 17은 삼중 공동-침전 및 건조(단계 I 및 II) 직후 복합물의 x-선 회절 패턴을 도시한다. 상기 패턴은 존재하는 주된 상이 브러사이트임을 입증한다.
도 18은 1차 가교(단계 III) 후 공침물 입자 구조의 SEM 현미경사진을 도시한다. 미세구조상 입자의 균질한 특성에 주목할 만하다.
옥타칼슘 포스페이트로의 가수분해의 진행(단계 IV)이 도 19의 XRD 패턴으로 묘사된다. 12.5°의 브러사이트의 피크 강도가 점차 감소하고, 4.5°의 주요한 옥타칼슘 포스페이트(OCP) 피크가 증가하는 것은 48시간에 걸쳐서 무기상이 OCP로 전환되는 것을 나타낸다.
복합물의 TEM 이미지를 도 20에 도시한다. 콜라겐/GAG 매트릭스에 분산된 칼슘 포스페이트 결정의 10-20nm 저 양상-비의 임의적인 분포가 명백하다.
본 발명의 생체 적합 복합 물질은 재흡수성 물질로서 사용될 수 있다. 이식 후, 상기 물질로 구성된 장치가 완전히 재흡수되어, 임플란트 자체의 흔적을 남기지 않고 건강하고 재생된 조직만이 남게 될 것으로 예상된다.

Claims (55)

  1. (a) 액체 캐리어, 무기물 및 유기물을 포함하는 제 1 슬러리 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 슬러리를 위한 모울드를 제공하는 단계;
    (c) 모울드 내에 슬러리를 침착(deposit)하는 단계;
    (d) 모울드 내에 침착된 슬러리를 액체 캐리어가 복수의 고체 결정 또는 입자로 전환되는 온도로 냉각시키는 단계;
    (e) 승화 및/또는 증발에 의해 복수의 고체 결정 또는 입자 중 적어도 일부를 제거하여, 무기물 및 유기물을 포함하는 다공성 복합 물질이 남도록 하는 단계; 및
    (f) 모울드로부터 물질을 분리하는 단계를 포함하는
    무기물 및 유기물을 포함하는 생체 적합 복합 물질 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 무기물이 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 칼슘 포스페이트 물질이 브러사이트(brushite)를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기물이 하나 이상의 콜라 겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난(hyaluronan), 키토산, 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 무기물이 칼슘 포스페이트 물질을 포함하고, 유기물이 콜라겐 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하며, 다공성 복합 물질이 칼슘 포스페이트 물질 및 콜라겐 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 제 1 슬러리가 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물을 포함하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 제 1 슬러리가 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물을 포함하는 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 포스페이트 물질이 브러사이트를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 캐리어 및 유기물 및 선택적으로 무기물을 포함하는 제 2 슬러리 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 냉각 단계 전, 상기 제 1 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 모울드 내에 상기 제 2 슬러리 조성물을 침착하는 단계를 더 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 유기물이 하나 이상의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산, 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  11. 제 9 항 또는 10 항에 있어서, 제 2 슬러리 조성물이 무기물, 바람직하게 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 슬러리 조성물이 액체-캐리어, 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 제 2 슬러리 조성물이 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 방법.
  14. 제 12 항 또는 13 항에 있어서, 제 2 슬러리 조성물이 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 방법.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 슬러리 조성물이 모울드 내에 제 1 층 및 제 2 층으로 침착되는 방법.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 한 층이 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 포함하는 다층 물질을 형성하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 제 2 슬러리 조성물로부터 형성되는 층이 다공성 층인 방법.
  18. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 슬러리 조성물을 모울드 내에 침착한 후, 냉각 단계 전 24시간 이하의 시간 동안 모울드 내용물을 방치하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 모울드 내용물을 방치하는 단계가 1 - 200 kPa, 바람직하게 50 - 150 kPa, 더욱 바람직하게 50 - 101.3 kPa의 압력에서 행해지는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 캐리어가 물을 포함하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 냉각 단계 전, 모울드 내에 침착된 슬러리의 온도가 2 내지 40℃, 바람직하게 4 내지 37℃, 더욱 바람직하게 20 내지 37℃인 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계가 ≤ 0℃의 온도에서 행해지는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계가 -100 내지 0 ℃, 바람직하게 -80 내지 -10℃, 더욱 바람직하게 -40 내지 -20℃의 온도범위에서 행해지는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계가 0.02 - 10℃/분, 바람직하게 0.02 - 6.0℃/분, 더욱 바람직하게 0.2 - 2.7℃/분의 냉각 속도에서 행해지는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 모울드 내에 침착된 슬러리의 두께가 0.1 - 500 mm, 바람직하게 0.5 - 20 mm, 더욱 바람직하게 1.0 - 10 mm인 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 모울드 내에 침착되기 전의 슬러리 점성도가 0.1 - 50 Pa·s, 바람직하게 0.1 - 10 Pa·s, 더욱 바람직하게 0.5 - 5 Pa·s인 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 승화에 의해 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계가 0 - 0.08 kPa, 바람직하게 0.0025 - 0.08 kPa, 더욱 바람직하게 0.0025 - 0.04 kPa의 압력에서 행해지는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 승화에 의해 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계가 120 이하의 시간, 바람직하게 12 - 72 시간, 더욱 바람직하게 24 - 36 시간 동안 행해지는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 승화에 의해 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계가 -10 - 6O℃의 온도, 바람직하게 0 - 4O℃의 온도, 더욱 바람직하게 20 - 37℃의 온도에서 행해지는 방법.
  30. 제 5 항 내지 제 8 항 및 제 12 항 내지 제 29 항들 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐과 하나 이상의 글리코스아미노글리칸이 다공성 생체 적합 복합 물질(porous composite bimaterial) 내에서 가교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  31. 제 2 항 내지 제 8 항들 및 제 11 항 내지 제 30 항들 중 어느 한 항에 있어서, 다공성 생체 적합 복합 물질 내의 칼슘 포스페이트 물질의 적어도 일부를 다른 칼슘 포스페이트 상으로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 칼슘 포스페이트 물질이 브러사이트를 포함하고, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환되는 방법.
  33. 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질, 및 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산 또는 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나를 포함하는 다공성 공침물로부터 형성되며, 매크로포어 사이즈(포어 직경)가 바람직하게 1 - 1000 마이크론, 더욱 바람직하게 200 - 600 마이크론인 합성 생체 적합 복합 물질.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질 및 콜라겐을 포함하는 다공성 공침물로부터 형성되는 합성 생체 적합 복합 물질.
  35. 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질, 및 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드 중 둘 이상을 포함하는 다공성 삼성분 공침물로부터 형성되며, 매크로포어 사이즈(포어 직경)가 바람직하게 1 - 1000 마이크론, 더욱 바람직하게 200 - 600 마이크론인 합성 생체 적합 복합 물질.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 생체 적합 물질의 적어도 일부가 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 다공성 삼성분 공침물로부터 형성되는 합성 생체 적합 복합 물질.
  37. 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 물질로 형성된 제 1 층 ; 및
    상기 제 1 층에 결합되고, 콜라겐, 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 물질로 형성된 제 2 층을 포함하는 합성 생체 적합 복합 물질.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 제 1 층이 제 33 항 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 의해 정의되는 바와 같은 물질로 형성된 생체 적합 물질.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 층이 일체로 형성되며, 바람직하게 액상 공합성에 의해 형성되는 생체 적합 물질.
  40. 제 33 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 층이 경계 확산층을 통하여 서로 결합되는 생체 적합 물질.
  41. 제 33 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 층이 경계 층을 통하여 서로 결합되는 생체 적합 물질.
  42. 제 33 항 내지 제 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 층이 다공성 또는 비-다공성인 생체 적합 물질.
  43. 제 33 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 층에 결합되는 하나 이상의 부가 층들을 더 포함하며, 상기 각 부가 층이 콜라겐, 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 및 적어도 하나의 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 물질로 형성되는 생체 적합 물질.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 층 및 상기 하나 이상의 부가 층들이 일체로 형성되는 생체 적합 물질.
  45. 제 43 항 또는 44 항에 있어서, 인접층들이 경계 확산층을 통해 서로 결합되 는 생체 적합 물질.
  46. 제 43 항 내지 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 부가 층 중 적어도 하나가 다공성 또는 비-다공성인 생체 적합 물질.
  47. 제 33 항 내지 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 상기 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸이 가교되는 생체 적합 물질.
  48. 제 33 항 내지 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 콜라겐을 포함하고, 상기 콜라겐이 물질 내에 1 내지 99 wt%, 바람직하게 5 내지 90 wt%, 더욱 바람직하게 15 내지 60 wt% 포함되는 생체 적합 물질.
  49. 제 33 항 내지 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 상기 글리코스아미노글리칸이 물질 내에 0.01 내지 20 wt%, 바람직하게 1 내지 5.5 wt%의 량으로 포함되는 생체 적합 물질.
  50. 제 33 항 내지 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 콜라겐을 포함하며, 상기 칼슘 포스페이트가 브러사이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 브러사이트의 중량비가 10:1 내지 1:100, 바람직하게 5:1 내지 1:20인 생체 적합 물질.
  51. 제 33 항 내지 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 콜라겐을 포함하며, 상기 칼슘 포스페이트 물질이 옥타칼슘 포스페이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 옥타칼슘 포스페이트의 중량비가 10:1 내지 1:100, 바람직하게 5:1 내지 1:20인 생체 적합 물질.
  52. 제 33 항 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 콜라겐 대 글리코스아미노글리칸의 중량비가 8:1 내지 30:1인 생체 적합 물질.
  53. 제 33 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 생체 적합 물질을 포함하는 합성 뼈 재료, 뼈 임플란트, 뼈 이식편, 뼈 대체 재료, 뼈 스캐폴드, 충전재, 코팅재 또는 시멘트.
  54. 제 33 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 정의된 생체 적합 물질을 포함하는 조직공학적 용도의 모놀리틱 또는 적층된 뼈 스캐폴드.
  55. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻어질 수 있는 다공성 생체 적합 복합 물질.
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