KR20090038035A - 바이오물질 - Google Patents

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KR20090038035A
KR20090038035A KR1020097004974A KR20097004974A KR20090038035A KR 20090038035 A KR20090038035 A KR 20090038035A KR 1020097004974 A KR1020097004974 A KR 1020097004974A KR 20097004974 A KR20097004974 A KR 20097004974A KR 20090038035 A KR20090038035 A KR 20090038035A
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collagen
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KR1020097004974A
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앤드류 린
윌리엄 본필드
자체리 디. 위씨너-그로쓰
브렌단 에이 할리
아이오아니스 브이 얀나스
로나 제이 깁슨
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캠브리지 엔터프라이즈 리미티드
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

복합 바이오물질을 제조하는 방법은 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 1 구성성분을 제공하며; 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 액체 담체, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하는 유체 조성물을 제공하며; 상기 유체 조성물을 상기 제 1 구성성분의 상기 다공성 표면부와 접촉시키며; 상기 유체 조성물을 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키며; 적어도 일부의 복수의 고체 결정 또는 입자를 승화 및/또는 증발시켜 제거함을 포함한다.

Description

바이오물질 {BIOMATERIAL}
본 발명은 생물의학적 적용을 위한 합성 뼈 물질 분야, 및 특히 조직 공학에서 사용하기 위한 예를 들어 콜라겐, 칼슘 포스페이트, 및 임의적으로 글리코사미노글리칸을 포함한 층상 스캐폴드(layered scaffold)에 관한 것이다.
천연 뼈는 콜라겐, 글리코사미노글리칸을 포함한 비콜라겐성 유기상, 및 칼슘 포스페이트의 바이오복합체이다. 이러한 복잡한 계층적 구조(hierarchical structure)는 높은 강성도, 강도 및 파괴인성을 포함하는 특별한 기계적 성질을 초래하며, 이는 날마다 가해지는 생리학적 응력에 뼈가 견딜 수 있게 한다. 당해 기술 분야의 연구자들에게 당면하는 과제는 인간 또는 동물 체내에서 합성 물질에 및 그 주위에 천연 뼈가 성장할 수 있는 조성 및 구조를 갖는 합성 물질을 제조해야 한다는 것이다.
뼈가 신체 환경에서 형성된 뼈-유사 인회석 층을 통해 인체에서 칼슘 포스페이트에 직접적으로 결합하는 것(생체 활성으로 언급되는 특성)으로 관찰되었다. 다른 한편으로 콜라겐 및 콜라겐과 다른 생체유기물질, 예를 들어 글리코사미노글리칸을 포함한 코폴리머는 인체에서 뼈의 생산 및 유지를 초래하는 것을 포함하는 수많은 세포 타입의 부착 및 증식을 위한 최적의 기질인 것으로 알려져 있다.
히드록시인회석은 뼈 대용 물질의 구성성분으로서 가장 통상적으로 사용되는 칼슘 포스페이트이다. 그러나, 이는 칼슘 포스페이트 물질의 다른 형태, 예를 들어 브루샤이트, 트리칼슘 포스페이트 및 옥타칼슘 포스페이트와 비교하여 비교적 불용성의 물질이다. 신체내에서 물질의 재흡수율이 특히 낮기 때문에, 인회석의 비교적 낮은 용해성은 바이오물질을 생산할 때 불리할 수 있다.
칼슘 포스페이트, 예를 들어 히드록시인회석은 기계적으로 강성인 물질이다. 그러나, 이들은 천연 뼈와 비교하여 비교적 부서지기 쉽다. 콜라겐은 기계적으로 단단한(tough) 물질이지만, 천연 뼈와 비교하여 비교적 강성이 낮다. 콜라겐과 글리코사미노글리칸의 코폴리머를 포함하는 물질은 콜라겐 단독에 비해 보다 단단하고 강성이지만, 여전히 천연 뼈와 비교하여 비교적 낮은 강성을 지닌다.
히드록시인회석에 비해 기계적 단단함(toughness)이 개선되고, 콜라겐, 및 콜라겐과 글리코사미노글리칸의 코폴리머에 비해 강성이 개선된 합성 뼈 대용 물질을 생산하기 위한 이전의 시도는 기계적 혼합에 의해 콜라겐과 인회석을 조합하는 방법이 있다. 이러한 기계적 방법은 EP-A-0164 484호에 기술되어 있다.
최근의 개발로는 히드록시인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 기계 혼합함으로써 이러한 구성성분들을 포함하는 뼈 대용 물질을 형성시킴을 포함한다. 이는 EP-A-0214070호에 기술되어 있다. 이러한 문헌은 콜라겐에 콘드로이틴-4-설페이트를 탈수소가열적 가교시키는 것을 추가로 기술한다. 인회석, 콜라겐과 콘드로이틴-4-설페이트를 포함한 물질은 양호한 생체적합성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 인회석와 콜라겐, 및 임의적으로 콘드로이틴-4-설페이트를 기계적 혼합시켜 필수적으로 콜라겐/콘드로이틴-4-설페이트-코팅된 인회석 입자를 형성한다. 이러한 물질은 생체적합성임에도 불구하고, 인간 또는 동물 몸체에 존재할 때 천연의 뼈의 제한된 내부 성장(in-growth)을 형성하고 합성 물질의 칼슘 포스페이트 상을 재모델링(remodeling)시키지 못하는 것으로 밝혀졌다.
종래 연구에서는 콜라겐과 하나 이상의 글리코사미노글리칸(GAG)의 다공성 스캐폴드를 형성시키기 위해 냉동-건조 프로토콜의 파라미터를 조절할 수 있는 수단을 개발하였다. 이러한 기술들은 스캐폴드 특징, 예를 들어 공극 크기 및 종횡비를 제어된 방식, 외상 또는 상해 부위에서 치유 반응에 대해 현저한 효과를 갖게 하는 것으로 알려진 파라미터로 변경할 수 있도록 한다. 그러나, 골격 및 근골격 결함을 포함하는 상해의 치료를 위하여, 비미네랄화된(unmineralised) 콜라겐-GAG 스캐폴드와는 반대로, 뼈의 조성과 기계적 특징과 밀접하게 매칭되는 물질의 조성 및 기계적 특징을 갖는 다공성 스캐폴드를 생산하기 위한 기술을 개발할 필요가 있다.
본 출원인의 이전 국제특허출원 PCT/GB2006/000797호 (2006년 3월 6일 출원)는 생물의학 적용을 위한 물질, 특히 예를 들어 콜라겐, 칼슘 포스페이트, 및 임의적으로 글리코사미노글리칸을 포함한 다고성의 모놀리식(monolithic) 및 다공성의 층상 스캐폴드에 관한 것이다. PCT/GB2006/000797의 내용은 또한 본 발명의 보다 양호한 이해를 돕기 위하여 본원에 첨부된 별첨(Annex)에 포함된다.
조직공학 적용을 위한 발달된 스캐폴드화 물질의 지속된 사용 및 개발은 층상 스캐폴드 물질의 개발을 위한 필요성을 드러내었다. 신체에서 수많은 관련된 생리학적 부위는 하나 이상의 조직 타입들 사이의 경계면을 수반한다. 특정의 조직 타입 및 세포 타입은 특정 스캐폴드화 구조의 개발을 요구하며; 종종 생물학적 활성 스캐폴드 구조는 조직에서 조직으로, 세포에서 세포로, 및 한 적용에서 다른 적용으로 크게 변경시킬 수 있다[1]. 이러한 관찰들은, 더욱 복잡한 조직에서 및 계면 손상(즉, 연골에 대한 손상은 또한 종종 하부골을 손상시킴, 뼈 또는 근육으로의 삽입 포인트 부근의 힘줄 및 인대 상해)을 포함한 부위에서 상해 부위의 치료를 위하여, 스캐폴드 구조에서의 선명한 경계면 뿐만 아니라 스캐폴드 구조에서의 양쪽 비탈(both gradient)을 갖는 스캐폴드를 개발할 필요가 있음을 시사한다.
특히, 외상, 기형 또는 질환에 의해 손상된 골격 부위의 복구는 특정된 과제 세트를 취한다. 피부, 신경 및 대부분의 다른 조직에서의 결함과는 달리, 골격 결함은 다른 여러 조직 타입(즉, 뼈, 연골, 힘줄 및 인대)에 둘어싸여 있으며, 규칙적인 기계적 하중을 받는 위치에 영향을 미치고, 미네랄화된 조직과 비미네랄화된 조직 사이의 횡단 경계면(예를 들어, 인대 삽입 포인트, 뼈/연골 경계면에서의 "최고 도달점(tidemark)")을 포함한다.
오늘날의 스캐폴드 제작 기술은 물리적 구조, 기계적 성질, 또는 화학적 조성과 같은 파라미터의 명확한 구배를 갖는 스캐폴드를 제작하기 위한 적절한 프로토콜을 포함하지 않고 있다. 연골 단독 또는 뼈와 연골 둘 모두를 포함하는 관절 조인트 결함과 같은 상해를 치료하기 위한 다공성의 층상 스캐폴드를 이용하는 조직-공학적 전략을 개발하기 위한 제한된 수의 노력이 최근에 이루어졌다. 이러한 구조물은 각각에 대해 별도의 스캐폴드를 이용하여, 뼈와 연골의 재생을 동시에 유도할 것을 요구한다[2-9].
이러한 새로운 접근법의 장래성에도 불구하고, 두가지 중대한 결점으로 최근에 보고된 층상 스캐폴드의 효능이 제한될 수 있다. 첫번째 결점은 스캐폴드의 개개 층들을 위해 사용되는 물질과 관련이 있다. 재흡수가능한 합성 폴리머는 연골성 층을 위해서만 사용되는 물질이고, 또한 종종 많은 이러한 스캐폴드에서 뼈를 함유한(osseous) 부분의 성분이다. 이는 용이하게 제조할 수 있지만, 합성 폴리머는 콜라겐과 같은 천연 폴리머 보다 세포 부착 및 증식에 대해 보다 덜 도움이 되는 것으로 알려져 있고, 이들이 퇴화되기 때문에 고농도의 잠재적 세포독성 산을 방출할 수 있다. 더욱이, 힘줄 또는 인대 복구가 필요한 적용에 대해, 재흡수가능한 합성 폴리머는 이들이 가교되는 방식과는 관계없이, 재활 운동 동안에 가해지는 심지어 감소된 하중을 견뎌내기에 부적합한 강도 및 강성을 갖는다.
본 층상 스캐폴드의 두번째 결점은 개개 층들 사이의 경계면에 관한 것이다. 생체내에서, 콜라겐 섬유의 연속체는 천연 관절 조인트 및 힘줄/인대 삽입 포인트와 같은 수많은 조직들 사이의 경계면에 걸쳐서 관찰된다. 얻어진 평활전이의 시스템(소프트 경계면(soft interface))은 이러한 부위에 고유한 기계적 안전성을 부여하여, 이들이 기계적 기능부전없이 생리학적 하중을 견뎌낼 수 있도록 한다. 대조적으로, 대부분의 존재하는 층상 스캐폴드는 유사하지 않은 두개의 물질들 간의 별도의 경계를 형성하는 하드 경계면(hard interface)을 함유한다. 봉합[7], 피브린 접착 결합[3] 및 다른 기술들[4,5]은 이러한 경계면을 강화시키는데 사용되지만, 경계면 분리(debonding)가 아직까지 조절된 동물 모델에서도 보고되고 있다. 또한, 이러한 봉합 및 접착 방법이 다루기 어렵고 거의 재생가능하지 않으며, 이에 따라 임상 환경에서 실용적이지 않을 수 있다는 것에 주목할 만하다.
새로운 기술들은 명확하게 다수의 적용을 위해 규정된 일정하지 않은 특징을 갖는 층상 스캐폴드 구조를 형성시키는 능력을 추가로 확장할 것을 요구한다. 주요한 관심사는 적절한 중간층 결합을 갖는 층상 스캐폴드 구조를 형성시키기 위한 적절한 기술들을 개발하는 것이다. 이는 특히 상당한 기계적 하중 하의 구역에서 사용되고, 이에 의해 중간층 박리의 기회가 증가되는 스캐폴드에 대해 상당한 문제점을 갖는다.
추가로 층상의 다공성 콜라겐-계열 스캐폴드를 제작하기 위한 기술을 개발하는 것이 상당히 중요하다. 콜라겐-계열 스캐폴드는 여러 상이한 조직 공학 연구를 위한 천연의 세포외 매트릭스의 유사체로서 성공적으로 사용되었으며; 콜라겐-계열 스캐폴드는 통상적으로 냉동-건조에 의해 제작된다. 콜라겐, 다른 적용가능한 단백질, 액체 담체의 현탁액은 적절한 열조건하에서 고체화되어, 콜라겐 섬유에 의해 둘러싸여진 얼음 결정의 상호침투 네트워크를 형성한다. 냉동된 현탁액은 이후 승화되어, 냉동된 액체 담체를 제거하고 다공성의 스캐폴드 구조를 잔류시킨다. 스캐폴드 공극의 치수는 슬러리의 냉동 공정에 의해 규정된다. 이러한 제작 기술의 큰 장점은 콜라겐 섬유의 연속체가 스캐폴드 전반에 걸쳐 관찰된다는 것이다. 그러나, 공극 크기 및 형태에서 큰 차이를 갖는 층상 스캐폴드를 제작하는 것은 열 환경의 매우 조심스러운 조절을 요구한다. 추가적으로, 현탁액 혼합으로 인하여 단일 고형화 단계 동안에 모든 구조들을 동시에 형성시려고 노력할 때 화학적 조성, 가교 밀도, 및 물질 성질과 같은 상당히 다른 성질들을 갖는 스캐폴드를 형성하는 것이 매우 어렵다.
본 발명은 PCT/GB2006/000797호에 기술된 연구를 확장하고, 종래 기술과 관련된 몇몇 문제점들을 제기하는 것이 목적이다.
따라서, 본 발명은 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 1 구성성분을 제공하며; 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 액체 담체, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하는 유체 조성물을 제공하며; 상기 유체 조성물을 상기 제 1 구성성분의 다공성 표면부와 접촉시키며; 상기 유체 조성물을, 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키며; 복수의 고체 결정 또는 입자 중 적어도 일부를 승화 및/또는 증발로 제거함을 포함하여, 복합 바이오물질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 방법은 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 2 구성성분을 제공하며; 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 상기 유체 조성물을 삽입하여 유체 조성물과 상기 다공성 표면부를 접촉시키며; 상기 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이의 상기 유체 조성물을, 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키며; 복수의 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 승화 및/또는 증발로 제거하여 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 중간층을 형성시킴을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 바이오물질(biomaterial)은 인간 또는 동물 몸체와 생체적합성인 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 슬러리(slurry)는 슬러리, 용액, 현탁액, 콜로이드 및 분산액을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 콜라겐(collagen)은 재조합 인간 (rh) 콜라겐을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 구성성분은 예를 들어, 특정의 화학적, 구조적 및/또는 물질 성질을 갖는 스캐폴드의 별개의 영역을 칭한다. 용어 스캐폴드(scaffold)는 최종의, 다중-구성성분 스캐폴드 구조를 칭한다.
용어 복합체 스캐폴드 및 층상 스캐폴드는 동의어로서, 두개 이상의 층을 포함하는 스캐폴드를 칭하며, 각 층의 물질 조성은 통상적으로 이의 인접한 층 또는 층들의 물질 조성과 실질적으로 상이하다. 용어 단일-층상 스캐폴드 또는 모놀리틱 스캐폴드는 동의어로서, 단지 하나의 층을 포함하는 스캐폴드를 칭하며, 각 층내에서의 물질 조성은 전반에 걸쳐 거의 균질하다.
본원에서 사용되는 용어 다공성은 물질이 거대공극 및/또는 미세공극을 함유할 수 있음을 의미한다. 공극은 표면 상에 존재할 수 있고, 물질의 벌크로 확장할 수 있다. 거대다공도(macroporosity)는 통상적으로 대략 10 마이크론 보다 큰 크기의 공극과 관련된 특징을 칭한다. 미세다공도(microporosity)는 통상적으로 대략 10 마이크론 미만의 크기의 공극과 관련된 특징을 칭한다. 물질내에 개방 및 닫혀진 세포의 임의의 조합이 존재할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 예를 들어, 이러한 물질은 대개 거대공극 및 미세공극 둘 모두를 함유할 것이다. 거대다공도는 일반적으로, 개방-세포에 존재하지 않지만, 닫혀진 세포 구성성분을 지닐 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 일련의 개개의 구성성분들을 포함한 다공성의 복합/층상 스캐폴드를 형성시키기 위해 임의의 수로 반복적으로 적용될 수 있는 단계들의 순서를 포함한다. 이러한 개개의 구성성분들은 서로 별도로 제조될 수 있고, 이후 임의 수의 동시-합성(co-synthesis) 공정의 반복을 이용하여 함께 결합시켜 상이한 구조적, 기계적 및/또는 조성적 특징(예를 들어, 공극 크기, 상대 밀도, 공극 형태, 강성도, 화학적 조성, 가교 밀도, 분해율)의 영역을 갖는 단일 복합/층상 스캐폴드를 형성시킬 수 있다.
보다 큰 복합/층상 스캐폴드 구조를 어셈블리한 후에, 물리적 가교 기술(예를 들어, 탈수소열적 가교, 자외선 가교), 화학적 가교 기술(예를 들어, 카르보디이미드-계열 가교, 글루테르알데히드-계열 가교) 또는 효소 칵테일(예를 들어, 콜라게나제, 디스파제)을 이용한 스캐폴드의 부분적 퇴화를 포함한 임의의 수의 제조후 공정 단계가 이용될 수 있다. 스캐폴드의 수화를 포함하는 임의의 처리를 이용한 후에, 액체 구성성분은 예를 들어, 냉동-건조 공정을 이용하여 제거될 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 생체내에서 보여지는 것과 유사한 스캐폴드 구성성분 층들 사이의 콜라겐 피브릴의 연속체를 지닌 연속(소프트) 경계면을 생산할 수 있다. 본 발명자들은, 이것이 제조 후에 유사하지 않은 상들을 함께 봉합하거나 접합하는 것과 관련된 문제점을 처리하는 것을 밝혀내었다.
본 발명에 따른 방법은 개개의 스캐폴드 구성성분이 액체 상태로부터 실질적으로 동시에 형성되지 않아도 된다는 장점을 제공한다. 이는 액체상 동시-합성과는 대조적이며, 여기서 모든 슬러리가 함께 층상화되고 고형화된다.
제 1 구성성분 및 제 2 구성성분 (존재하는 경우)은 고체 또는 필수적으로 고체 형태로 제공된다.
제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분은 통상적으로 콜라겐 및 임의적으로 글리코사미노글리칸을 포함할 것이다.
제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분은 통상적으로 칼슘 포스페이트 물질과 같은 무기 물질을 포함할 것이다. 예로는 브루샤이트, 옥타칼슘 포스페이트 및 인회석 중 하나 이상을 포함한다.
인회석은 칼슘 및 포스페이트를 포함하는 미네랄의 한 부류로서, 화학식 Ca5(PO4)3(X) [여기서, X는 통상적으로 OH-, F- 및 Cl-인 이온, 또는 당업자에게 공지된 다른 이온들일 수 있다]를 갖는다. 용어 인회석은 또한 실리콘-치환된 인회석과 같은 치환된 인회석을 포함한다. 용어 인회석은 인회석의 특정 예인 히드록시인회석을 포함한다. 히드록시인회석은 또한 다른 종, 예를 들어 실리콘으로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분은 콜라겐 및 칼슘포스페이트 물질의 공침물로부터 형성된다. 본 발명의 바람직한 다른 양태에서, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분은 콜라겐 및 글리코사미노글리칸의 공침물로부터 형성된다.
유리하게는, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분은 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코사미노글리칸의 삼성분 공침물로부터 형성된다.
바람직한 일 구체예에서, 제 1 구성성분은 콜라겐 및 글리코사미노글리칸 및 임의적으로 칼슘 포스페이트 물질을 포함하며, 제 2 구성성분 (존재하는 경우)은 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질을 포함한다.
유체 조성물은 통상적으로 콜라겐 및 임의적으로 글리코사미노글리칸을 포함할 것이다.
유체 조성물은 무기 물질, 예를 들어 칼슘 포스페이트 물질을 추가로 함유할 수 있다. 예로는 브루샤이트, 옥타칼슘 포스페이트 및 인회석 중 하나 이상을 포함한다.
액체 담체는 바람직하게는 물을 포함한다.
유체 조성물은 현탁액의 형태, 예를 들어 콜라겐-계열 현탁액 또는 슬러리로 제공될 수 있다. 현탁액/슬러리는 글리코사미노글리칸 및/또는 칼슘 포스페이트 물질 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 함유할 수 있다.
바람직하게는, 유체 조성물은 콜라겐 및 글리코사미노글리칸의 공침물, 및/또는 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코사미노글리칸의 삼성분 공침물을 포함하는 현탁액/슬러리이다.
대안적으로는, 슬러리는 단순하게 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질 및 임의적으로 글리코사미노글리칸의 기계적 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 예를 들어, EP-A-0164 484 및 EP-A-0214070호에 기술된 바와 같은 통상적인 기술에 의해 생산될 수 있다.
칼슘 포스페이트 물질은 예를 들어, 브루샤이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게는 브루샤이트를 포함한다.
현탁액/슬러리의 pH는 바람직하게는 2.5 내지 6.5, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 5.5, 더더욱 바람직하게는 3.0 내지 4.5, 및 가장 바람직하게는 3.8 내지 4.2이다.
현탁액/슬러리 조성물은 하나 이상의 글리코사미노글리칸을 포함할 수 있다. 슬러리 조성물은 하나 이상의 칼슘 포스페이트 물질을 포함할 수 있다.
현탁액/슬러리 중에 다른 종(예를 들어, 은, 실리콘, 실리카, 식탁용 소금, 설탕 등)의 존재는 배제되지 않는다.
다른 성분들이 현탁액/슬러리에 존재할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 예를 들어, 성장 인자, 유전자, 약물, 또는 다른 생물학적 활성 종이 임의적으로 현탁액/슬러리에 단독으로 또는 조합하여 첨가될 수 있다.
복수의 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부는 승화 및/또는 증발에 의해 제거되어 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 중간층을 형성시킬 수 있다. 바람직한 방법은 승화이다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 복합 바이오물질의 제조방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 콜라겐(재조합 인간 (rh.) 콜라겐 포함), 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함한 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 1 구성성분을 제공하는 단계;
(b) 콜라겐(재조합 인간 (rh.) 콜라겐 포함), 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 2 구성성분을 제공하는 단계;
(c) 콜라겐(재조합 인간 (rh) 콜라겐을 포함), 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함한 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 액체 담체, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하는 유체 조성물을 제공하는 단계;
(d) 상기 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 상기 유체 조성물을 삽입하여 유체 조성물과 상기 다공성 표면부를 접촉시키는 단계;
(e) 상기 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이의 상기 유체 조성물을, 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키는 단계;
(f) 복수의 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 승화 및/또는 증발로 제거하여 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 중간층을 형성시키는 단계.
본 발명에서, 예를 들어 콜라겐-계열 현탁액의 얇은 층은 유리하게는 제 1 구성성분과 제 2 구성성분(예를 들어, 스캐폴드) 사이에 위치되고, 각 골격에서 제 1의 수개의 공극 층으로 흡수되게 할 수 있다. 스캐폴드는 이후 다시 한번 냉동 건조되어, 각각의 별도의 스캐폴드 구성성분들 사이에 콜라겐의 상호침투 네트워크를 형성시킨다. 이러한 공정은 물론, 요망되는 경우 수차례 반복될 수 있다.
현탁액/슬러리의 화학적 및 물리적 성질(예를 들어, 점도)은 제 1 및 제 2 구성성분의 화학적 및 물리적 특정에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 구성성분에서의 공극이 매우 작은 경우, 공극으로 침투시키기 위해 점성이 보다 낮은 현탁액/슬러리가 선택될 수 있다.
유체 조성물을, 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키고, 복수의 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 승화 및/또는 증발로 제거하는 단계가 냉동-건조 기술에 의해 달성될 수 있다.
액체 담체가 물인 경우, 승화 단계는 모울딩되고 냉동된 현탁액/슬러리 주변 환경의 압력을 물/얼음/수증기 시스템의 삼중점 이하로 감소시키고, 이후 달성된 증기압에서 고체-증기 전이 온도 보다 높은 온도로 상승시킴을 포함한다. 생성물 중의 얼음은, 주변 부분 액체 증기압이 현재 온도에서 냉동된 액체의 부분압 보다 낮은 한 승화를 통해 증기로 변환된다. 이러한 온도는 통상적으로 0℃ 또는 이보다 높은 온도로 상승된다. 이러한 단계는 승화에 의해 냉동된 현탁액/슬러리로부터 얼음 결정을 제거하기 위해 수행된다.
냉동-건조 파라미터는 요망되는 경우, 공극 크기 및 종횡비를 제어하기 위해 조절될 수 있다. 일반적으로, 냉각 속도가 느리고, 최종 냉동 온도가 높을수록 (예를 들어, 분당 대략 0.25℃로 약 -10℃의 온도까지 냉각), 보다 큰 종횡비를 갖는 큰 공극을 얻는데 유리하며, 냉각 속도가 빠르고, 최종 냉동 온도가 낮을수록 (예를 들어, 분당 대략 2.5℃로 약 -40℃의 온도까지 냉각), 작은 등축정(equiaxed) 공극을 형성시키는데 유리하다.
본 발명의 방법은 모울드에서 수행될 수 있으며, 이러한 용어는 제 1 및 제 2 구성성분 및 유체 조성물을 형태화하거나, 유지시키거나, 지지할 수 있는 임의의 모울드, 용기 또는 기판을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 이의 가장 간단한 형태인 모울드는 단순하게 지지 표면을 포함할 수 있다. 모울드는 임의의 요망된 형태일 수 있고, 폴리머 (예를 들어, 폴리설폰, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌), 금속 (예를 들어, 스테인레스 스틸, 티탄, 코발트 크롬), 세라믹 (예를 들어, 알루미나, 지르코니아), 유리 세라믹, 및 유리 (예를 들어, 보로실리케이트 유리)를 포함한 임의의 적합한 물질로부터 제작될 수 있다.
제 1 구성성분의 조성은 대개 제 2 구성성분의 조성과 동일하지 않을 것이다.
유체 구성성분의 조성은 대개 제 1 구성성분 또는 제 2 구성성분 (존재하는 경우)의 조성과 동일하지 않을 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 복합 바이오물질은 적어도 두개의 층이 다공성인 다층 스캐폴드를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다수의 층 모두는 콜라겐을 함유하고, 바람직하게는 또한 글리코사미노글리칸을 함유한다. 층들 중 적어도 하나는 바람직하게는 칼슘 포스페이트 물질을 추가로 함유한다.
제 1 및/또는 제 2 구성성분은 2006년 3월 6일에 출원된 본 출원인의 종래 국제 출원 PCT/GB2006/000797에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이의 내용은 본원에 첨부된 별첨에 기술되어 있다. 더욱이, 유체 조성물은 슬러리 조성물과 관련하여 PCT/GB2006/000797에 기술된 것일 수 있다.
2004년 10월 28일에 출원된 본 출원인의 종래 공개된 출원 PCT/GB04/004550에서는 콜라겐, 브루샤이트 및 글리코사미노글리칸의 삼성분 공침물, 및 이의 제조방법이 기재되어 있다. PCT/GB04/004550의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다. PCT/GB04/004550에 기술된 방법은 콜라겐, 칼슘 소스 및 포스포러스(phosphorous) 소스, 및 글리코사미노글리칸을 포함한 산성 수용액을 제공하고; 콜라겐, 브루샤이트 및 글리코사미노글리칸을 함께 수용액으로부터 침전시켜 삼성분 공침물을 형성시킴을 포함한다. 용어 공침물(co-precipitate)은 화합물들이 동일한 용액/분산액으로부터 실질적으로 동시에 침전되는 두개 또는 세개의 화합물의 침전을 의미한다. 이는 구체적으로 이러한 구성성분들이 예를 들어 상이한 용액에서 별도로 침전되는 구성성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과 구별된다. 공침물의 미세구조는 이의 구성성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과 실질적으로 상이하다.
공침물을 제조하는 방법에서, 칼슘 소스는 바람직하게는 칼슘 니트레이트, 칼슘 아세테이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 알콕사이드, 칼슘 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 글루코네이트, 및 헤파린의 칼슘 염 중 하나 이상으로부터 선택된다. 헤파린의 칼슘 염은 돼지 창자 점막으로부터 유도될 수 있다. 적합한 칼슘 염은 예를 들어 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Inc)로부터 상업적으로 입수가능하다. 포스포러스 소스는 바람직하게는 암모늄-이수소 포스페이트, 디암모늄 수소 포스페이트, 인산, 디나트륨 수소 오르토포스페이트 2-수화물 (Na2HPO4·2H2O, 종종 GPR 소렌센의 염(Sorensen's salt)이라 칭함) 및 트리메틸 포스페이트, 포스페이트의 알칼리금속 염 (예를 들어, Na 또는 K), 포스페이트의 알칼리토 염 (예를 들어, Mg 또는 Ca) 중 하나 이상으로부터 선택된다.
글리코사미노글리칸은 반복하는 이당류 단위를 함유한 긴 분지되지 않은 다당류를 함유한 거대분자의 패밀리이다. 바람직하게는, 글리코사미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 데르마틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트 및 히알루론산 중 하나 이상으로부터 선택된다. 콘드로이틴 설페이트는 콘드로이틴-4-설페이트 또는 콘드로이틴-6-설페이트일 수 있으며, 이 둘 모두는 예를 들어 시그마-알드리치사로부터 상업적으로 입수가능하다. 콘드로이틴-6-설페이트는 상어 연골로부터 유도될 수 있다. 히알루론산은 인간 탯줄로부터 유도될 수 있다. 헤파린은 돼지 창자 점막으로부터 유도될 수 있다.
콜라겐은 가용성 또는 불용성일 수 있고, 임의의 동물에서의 임의의 조직으로부터 유도될 수 있고, 임의의 수의 통상적인 기술을 이용하여 추출될 수 있다.
침전은 콜라겐, 칼슘 소스, 포스포러스 소스 및 글리코사미노글리칸을 산성 수용액에서 조합하고, 침전이 발생할 때까지 용액을 정치시키거나, 용액을 교반하거나, 염기성 적정제, 예를 들어 암모니아를 이용하여 적정하거나, 핵제, 예를 들어 사전제작된 브루샤이트를 첨가하거나, 칼슘 소스의 첨가 속도를 변형시키거나, 이러한 기술들의 조합 또는 당해 분야에 공지된 여러 다른 기술들의 임의의 조합에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 복합 바이오물질은 유리하게는 근골격 및 치아 적용을 위한 조직 재생 스캐폴드로서 사용된다.
본 발명에 따른 복합 바이오물질은 대체 뼈 또는 치아 물질로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바이오물질을 포함한 합성 뼈 물질, 뼈 임플란트, 뼈 이식물, 뼈 대체물, 뼈 스캐폴드, 충전제, 코팅 또는 시멘트를 제공한다.
복합 바이오물질은 유리하게는 다층 스캐폴드의 형태로 제공된다. 특히, 본 발명은 근골격 및 치아 적용을 위한 조직 재생 스캐폴드를 제공한다. 본 발명에 따른 다층(즉, 두개 이상의 층) 스캐폴드는 예를 들어 뼈/연골 경계면 (예를 들어, 관절 조인트), 뼈/힘줄 경계면 (예를 들어, 힘줄 삽입점), 뼈/인대 경계면 (예를 들어, 인대 삽입점), 및 치아/인대 경계면 (예를 들어, 치아/치주 인대 접합점)에서의 적용을 발견할 수 있다.
본 발명이 주로 조직 공학 적용을 위한 스캐폴드와 관련이 있지만, 본 발명에 따른 물질은 신체내에 상당한 시간 동안 존재하는 임플란트를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 반영구적 임프란트는 힘줄 및 인대 적용을 위해 필수적일 수 있다.
본 발명은 하기에서 두개의 바람직한 합성 구체예, 즉 고체상 동시-합성 및 고체-액체 동시-합성과 관련하여 기술될 것이다. 이러한 기술들은 상당히 다른 구성성분 성질을 갖는 다성분 스캐폴드를 제작하기 위해 본 발명자들에 의해 개발된 것이다. 이러한 것들은 생체내에서 유사하게 나타나는 스캐폴드 구성성분 층들 사이에 콜라겐 소섬유의 연속체를 지닌 연속적인 (연질) 경계면을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 것들은 제작 후에 함께 다른 상들을 봉합시키거나 접합시키는 것과 관련된 문제점을 처리한다.
본 발명에 따른 고체상 동시-합성 및 고체-액체 동시-합성 방법은 개개의 스캐폴드 구성성분들이 실질적으로 액체 상태와 동시에 형성되지 않아도 된다는 장점을 제공한다. 이는 모든 슬러리가 함께 층을 형성하고 고형화되는 액체상 동시-합성과 상반된다.
이러한 합성 방법은 일련의 개개 구성성분들을 포함하는 다공성 스캐폴드를 형성시키기 위하여 임의의 수로 반복하여 적용될 수 있는 단계들의 순서를 포함한다. 이러한 개개의 구성성분들은 서로 별도로 제작되고, 이후 임의의 수의 동시-합성 공정의 반복을 이용하여 함께 결합시켜 상이한 구조적, 기계적, 또는 조성적 특징(즉, 공극 크기, 상대 밀도, 공극 형태, 강성도, 화학적 조성, 가교 밀도, 분해 속도)의 영역을 갖는 단일 스캐폴드를 형성시킨다.
고체상 동시-합성 및 고체-액체 동시-합성 방법은 하기에서 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
고체상 동시-합성
고체상 동시-합성의 경우에서, 다성분 스캐폴드의 각 구성성분 층은 별도로 제작된다. 스캐폴드 구조물의 최종 3차원 매트릭스는 이후 제 2 냉동-건조 과정을 이용하여 별도의 구성성분 영역으로부터 결합된다. 예를 들어, 콜라겐-계열 현탁액의 박막은 각 스캐폴드들 사이에 배치되고, 각 스캐폴드에서의 공극의 수개의 제 1 층으로 흡수될 수 있다. 스캐폴드는 이후 다시 냉동-건조되어, 각각의 별도의 스캐폴드 구성성분들 사이에 콜라겐 섬유의 상호침투 네트워크를 형성한다. 이러한 방법은 물론 요망되는 경우 수회 반복될 수 있다.
고체상 동시-합성: 단계 1: 슬러리 제조
수성 콜라겐-계열 슬러리의 임의의 조합물을 제조할 수 있다. 상세한 제조 프로토콜이 타입 I 콜라겐 [10, 11], 타입 II 콜라겐 [12], 또는 미네랄화된 타입 I 콜라겐/GAG/브루샤이트 슬러리의 생산을 위해 존재한다[참조, 예를 들어 PCT/GB04/004550].
고체상 동시-합성: 단계 2: 다공성의 콜라겐-계열 구성성분의 제조
별도의 콜라겐-계열 슬러리로부터 냉동-건조를 이용하여 각 구성성분을 제조할 수 있다. 상이한 평균 공극 크기, 형태, 및 지향을 갖는 스캐폴드를 제조할 수 있는 여러 냉동-건조 프로토콜이 공개되었으며[10, 11, 13-15], 임의의 이러한 프로토콜이 각 스캐폴드 구성성분을 형성하기 위해 이용될 수 있다. 간단하게는, 각 콜라겐-계열 현탁액을 모울드에 배치시키고; 여기서 모울드는 임의의 요망되는 형태일 수 있고, 임의의 수의 물질들[즉, 폴리머, 금속, 세라믹, 유리, 또는 유리 세라믹]로부터 제조될 수 있다. 이후 모울드를 냉동 환경에 노출시켜 현탁액을 모울드내에서 고형화시키고; 여기서 고형화는 지배적인 방향으로 또는 균일하게 빠르거나 서서히 일어날 수 있고, 고형화 환경의 온도는 현탁액을 전부 고형화시키기 위해 임의의 방식으로 조절되어 콜라겐 섬유에 의해 둘러싸여진 얼음 결정의 상호침투 네트워크를 형성시킬 수 있다. 이후 고형화된 현탁액을 승화시켜, 얼음 결정을 제거하고 균질한 스캐폴드 구조를 구성하는 다공성 구성성분을 형성시킨다.
임의 수의 개개 구성성분들은 상이한 모울드에서 상이한 현탁액으로부터 상이한 냉동 프로토콜을 이용하여 제조될 수 있다.
고체상 동시-합성: 단계 3: 제조후 공정
임의 수의 제조후 공정 단계가 냉동-건조 후에 각 구성성분들에 대해 수행될 수 있다. 이러한 제조후 공정은 물리적 가교 기술(즉, 탈열수 가교, 자외선 가교) [11, 13, 16-18], 화학적 가교 기술(즉, 카르보디이미드-계열 가교, 글루테르알데히드-계열 가교) [11, 16], 또는 효소 칵테일(즉, 콜라게나제, 디스파제)을 이용한 스캐폴드의 일부 분해를 포함한다. 스캐폴드의 수화를 포함하는 임의의 처리를 이용한 후에, 액체 구성성분을 제 2 냉동-건조 공정을 이용하여 제거할 수 있다. 또한, 임의 수의 모울딩 용기, 냉동 프로토콜, 및 승화 프로토콜을 스캐폴드로부터 액체 구성성분을 제거하기 위해 이용될 수 있다.
고체상 동시-합성: 단계 4: 고체상 동시-합성
각 구성성분의 완전한 가공 후에, 개개의 구성성분들을 고체상 동시-합성을 이용하여 함께 결합시킬 수 있다. 콜라겐-계열 현탁액의 박막을 개개의 스캐폴드 구성성분들 사이에 배치시킨다. 이러한 공정을 반복하여 별도의 영역을 갖는 보다 큰 스캐폴드에 모든 개개 스캐폴드 구성성분들을 함께 결합시킨다. 콜라겐-계열 현탁액은 각 스캐폴드들 사이의 경계면을 국소적으로 수화시켜, 임시적으로 스캐폴드를 함께 고착시킨다. 이후 임의 수의 고형화 및 승화 프로토콜 중 하나를 이용하여 어셈블리된 스캐폴드를 냉동-건조시키고; 냉동-건조 이후에, 스캐폴드 구성성분들 사이의 각 경계면을 가로질러 연장하는 콜라겐 섬유의 상호침투 네트워크로 스캐폴드 구성성분을 함께 고정시킨다.
고체상 동시-합성: 단계 5: 제조후 공정
보다 큰 스캐폴드 구조의 어셈블리 이후에, 임의 수의 제조후 공정 단계를 이용할 수 있으며; 이러한 공정들은 이미 단계 3에 기술되어 있다. 이러한 공정 이후에, 스캐폴드를 다시 냉동-건조시켜 임의의 다양한 상이한 구조 및 조성 성질을 갖는 다공성의 콜라겐-계열 스캐폴드를 형성시킬 수 있다.
고체-액체 동시-합성
고체-액체 동시-합성의 경우에, 최종 스캐폴드의 하나 또는 다수의 구성성분 층을 별도로 제조한다. 이후 스캐폴드 구조물의 최종 3차원 매트릭스를 하나의 추가적인 또는 다수의 추가적인 냉동-건조 과정을 이용하여 결합시킨다. 예를 들어, 콜라겐-계열 현탁액을 이미 제조된 구성성분 또는 구성성분들과 함깨 배치시키고, 구성성분 스캐폴드로 흡수시킨다. 이후 현탁액-스캐폴드 시스템을 다시 냉동-건조시켜, 각 별도의 스캐폴드 구성성분들 사이에 콜라겐 섬유의 상호침투 네트워크를 형성시킨다. 이러한 공정은 물론 요망되는 경우 최종 스캐폴드 구조를 형성시키기 위하여 추가의 현탁액/슬러리와 함께 여러번 반복될 수 있다.
고체-액체 동시-합성 방법은 고체상 동시-합성 방법과 유사하고, 일련의 개개 다공성 구성성분을 포함한 다공성 스캐폴드를 형성시키기 위해 임의 수로 반복하여 도포될 수 있는 단계의 순서를 포함한다. 또한 고체상 동시-합성 방법과 유사하게, 균질한 다공성 스캐폴드를 포함하는 하나 이상의 다공성 구성성분을 냉동-건조 기술로 함께 결합시킨다. 그러나, 고체-액체 동시-합성 방법은, 하나 이상의 구성성분들이 냉동 건조에 의해 하나 이상의 미리 제조된 구성성분들과 완전히 접촉되게 배치된 슬러리로부터 형성된다는 사실로부터 고체상 동시-합성과 구별된다.
고체-액체 동시-합성: 단계 1: 슬러리 제조
수성 콜라겐-계열 슬러리의 임의의 조합물을 제조할 수 있다. 상세한 제조 프로토콜이 타입 I 콜라겐[10, 11], 타입 II 콜라겐 [12], 또는 미네랄화된 타입 I 콜라겐/GAG/브루샤이트 슬러리의 생산을 위해 존재한다[참조, 예를 들어 PCT/GB04/004550].
고체-액체 동시-합성: 단계 2: 다공성 구성성분의 제조
고체상 동시-합성과 관련하여 상기 기술된 하나 이상의 냉동-건조 기술을 이용하여 별도의 콜라겐-계열 슬러리(들)로부터 하나 이상의 스캐폴드를 제조한다.
고체-액체 동시-합성: 단계 3: 미리 제조된 다공성 구성성분의 제조후 공정
임의 수의 제조후 공정 단계를 각 스캐폴드 구성성분에서 수행한 후에 고체상 동시-합성과 관련하여 상기 기술된 냉동-건조를 수행할 수 있다.
고체-액체 동시-합성: 단계 4: 고체-액체 동시-합성
각 스캐폴드 구성성분의 완전한 가공 후에, 하나 이상의 슬러리를 하나 이상의 미리 제조된 다공성 구성성분과 완전 접촉하게 배치시키고; 상기 슬러리를 고형화시키기 전의 지정된 시간 동안 이들의 인접한 미리 제조된 구성성분 또는 구성성분들의 공극으로 슬러리를 확산시키고; 이후 냉동 건조로 승화시켜 미리 제조된 구성성분 또는 구성성분들에 완전하게 연결된 신규한 스캐폴드 구성성분의 다중상 스캐폴드를 형성시킨다. 임의 수의 구성성분을 함유한 다중상 스캐폴드를 형성시키기 위해 이러한 단계를 임의 수로 반복할 수 있다.
고체-액체 동시-합성: 단계 5: 제조후 공정
완전한 스캐폴드 구조의 어셈블리 후에, 임의 수의 제조후 공정 단계를 사용할 수 있으며; 이러한 공정들은 이미 단계 3에 기술되어 잇다. 처리 후에, 스캐폴드를 다시 냉동-건조시켜 임의의 다양한 상이한 구조적 및 조성적 성질을 갖는 다공성 콜라겐-계열 스캐폴드를 형성시킬 수 있다.
본 발명에 따른 공정들은 다중-구성성분 스캐폴드의 생산을 위한 여러 개의 장점을 제공한다. 명확하게는, 하기와 같다:
- 스캐폴드의 상이한 영역에 개개의 조절된 물리적 (즉, 공극 크기, 공극 형태, 가교 밀도, 분해 속도), 기계적 (즉, 모듈러스), 및 화학적 (즉, 미네랄 함량, 콜라겐 함량, 클리코사미노글리칸 함량) 성질,
- 제 1 구성성분으로서 콜라겐의 도입에 의해 개선된 세포 부착,
- 별도의 구성성분들 사이의 경계면을 가로지는 상호연결된 콜라겐-섬유 구조로 인한 강력한 경계면 강도,
- 고체상 동시-합성에 의한, 스캐폴드 중에 상이한 화학적 조성의 인접한 층들 사이에서 제한된 화학적 확산.
본 발명은 하기에서, 하기 실시예 및 도면을 참조로하여 추가로 설명될 것이다:
도 1은 실시예 1C에 따라 이층 스캐폴드를 형성시키기 위해 고체상 동시-합성에 의해 제조된 이-구성성분 스캐폴드를 도시한 것이다. 상부 영역은 비미네랄화된 타입 II 콜라겐 스캐폴드를 포함하며, 하부 영역은 미네랄화된 타입 I 콜라겐 스캐폴드를 포함한다.
도 2는 실시예 1C에 따라 고체상 동시-합성에 의해 제조된 층상 스캐폴드 중에서 미네랄 (Ca 및 P) 함량의 원소 분석을 도시한 것이다. 이러한 미네랄 함량은 미네랄화된 영역(그린 라인의 하부 셋트 사이)에서 거의 배타적으로 발견되었다.
도 3은 실시예 1C에 따라 미네랄화된 타입 I 콜라겐과 비미네랄화된 타입 II 콜라겐 스캐폴드 구성성분들로부터 형성된 층상 스캐폴드에서의 미네랄의 상대적 농도를 도시한 것이다.
실시예
실시예 1 : 고체상 동시-합성
A. 미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐- 글리코사미노글리칸 스캐폴드의 제조
현탁액 제조:
종래 PCT/GB04/004550호에 기술된, 미네랄화된 (브루샤이트) 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액을, 타입 I 콜라겐 (Integra LifeSciences Corp., Plainsboro, NJ, USA) , 콘드로이틴 6-설페이트 (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO, USA), 오르토인산 (H3PO4, BDH Laboratory Supply, Poole, UK), 칼슘 히드록사이드 (Ca(OH)2, Sigma-Aldrich Inc) , 및 칼슘 니트레이트 (Ca(NO3)2· 4H2O, Sigma-Aldrich Inc.)로부터 제조하였다.
냉동-건조:
미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐- 글리코사미노글리칸 현탁액의 10 mm 층을 하부 두께가 8 mm인 직사각형 (25 mm x 50 mm) 폴리설폰 모울드에 배치시켰다. 이전에 기술된 온도 기울기 기술(temperature ramping technique) [10, 15]을 이용하여 미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액을 고형화시키고; 냉동-건조기 선반 온도를 미리 특정된 속도(3℃/분)로 실온에서 -20℃까지 변경시키고, 이후 완전히 고형화시키기 위하여 -20℃에서 600분 동안 유지시키고[15]; 완전한 고형화 후, 냉동된 현탁액을 200 mTorr의 압력, 25℃의 온도에서 24 시간 동안 승화시켜, 250 ㎛ 이상의 평균 공극 크기를 갖는 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드를 형성시켰다.
제조후 공정:
스캐폴드를 이러한 모울드로부터 제거하고 미리 특정된 카르보디이미드 (액체 화학물 계열) 가교 처리를 이용하여 가교하였다[16]. 가교 후에, 스캐폴드를 포스페이트 완충된 염수 (PBS, Sigma-Aldrich Inc.) 및 증류수로 반복적으로 세척하였다. 수화된 스캐폴드를 -40℃ 일정 온도의 냉동-건조시에 60분 동안 다시 배치시키고, 승화(0℃, 17 시간, 200 mTorr)시켜 스캐폴드로부터 액체 내용물을 제거하였다.
B. 비미네랄화된 타입 II 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드의 제조
현탁액 제조:
사전제조된 타입 II 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액 (Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Switzerland) [12]을 냉장고에서 꺼내고, 실온이 되게 하였다.
냉동-건조:
타입 II 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액의 3 mm 층을 바닥 두께가 8 mm인 직사각형 (25 mm x 50 mm) 폴리설폰 모울드에 배치시켰다. 이전에 기술된 온도 기울기 기술 [10, 15]을 이용하여 타입 II 콜라겐- 글리코사미노글리칸 현탁액을 고형화하였다. 냉동-건조기 선반 온도를 실온에서 -40℃까지 미리 특정된 속도(1.4℃/분)로 변경시키고, -40℃에서 60분 동안 유지시켜, 완전하게 고형화시키고[15]; 완전한 고형화 후에, 냉동된 현탁액을 200 mTorr의 압력, 0℃의 온도에서 17 시간 동안 승화시켜, 평균 공극 크기가 대략 100 ㎛인 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드를 형성시켰다.
제조후 공정:
스캐폴드를 이러한 폴리설폰으로부터 제거하고, 스캐폴드 강성도를 증가시키고, 스캐폴드 분해 속도를 감소시키기 위하여 이전에 기술된 탈열수 가교 처리를 이용하여 가교시키고[11, 13]; 간단하게는, 탈열수 가교를 50 mTorr의 압력, 105℃의 온도에서, 24 시간 동안 수행하였다.
C. 이층 스캐폴드를 형성하기 위한 고체상 동시-합성
현탁액 제조:
소량의 상기 기술된 비미네랄화된 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액을, 타입 I 콜라겐 (Integra LifeSciences Inc.)/아세트산 (Sigma-Aldrich Inc.), 및 콘드로이틴 6-설페이트 (Sigma- Aldrich Inc.)로부터 제조하였다 [10, 11, 15].
고체상 동시-합성 :
미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드를 초기 스캐폴드 제조 동안에 사용된 직사각형 폴리설폰 모울드에 배치시켰다. 비미네랄화된 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액의 박막을 미네랄화된 (브루샤이트) 스캐폴드의 상부 표면에 걸쳐 분무하였다. 타입 II 콜라겐- 글리코사미노글리칸 스캐폴드를 현탁액 층 위에 배치시켰다. 둘 모두의 스캐폴드를 경계면을 따라 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액으로 수화시켰다.
상기 기술된 온도 기울기 기술[10, 15]을 이용하여 두개의 이전에 형성된 스캐폴드들 사이의 경계면을 따라 타입 I 콜라겐- 글리코사미노글리칸 현탁액을 고형화시켰다. 냉동-건조기 선반 온도를 실온에서 -40℃까지 미리 특정된 속도(1.4℃/분)으로 변경시키고, 이후 -40℃에서 60분 동안 유지시켜 완전히 고형화시키고[15] ; 완전한 고형화 후에, 냉동된 현탁액을 200 mTorr의 압력, 0℃의 온도에서 17 시간 동안 승화시켰다.
이러한 공정은 두개의 별도의 영역을 갖는 층상 스캐폴드 (미네랄화된 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 및 비미네랄화된 타입 II 콜라겐-글리코사라이노글리칸 스캐폴드)의 제작할 수 있다. 두개의 스캐폴드 층을 두개의 본래 스캐폴드 사이의 경계면을 가로질러 연장하는 얇은 타입 I 콜라겐- 글리코사미노글리칸 스캐폴드 구조로 함께 고정시켰다 [참조, 도 1 내지 3].
실시예 2 : 고체-액체 동시-합성
A. 미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드의 제조
현탁액 제조:
상기 기술된 (참조, PCT/GB04/004550) 미네랄화된 (브루샤이트) 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액을, 타입 I 콜라겐 (Integra LifeSciences Corp., Plainsboro, NJ, USA) , 콘드로이틴 6-설페이트 (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO, USA), 오르토인산 (H3PO4, BDH Laboratory Supply, Poole, UK), 칼슘 히드록사이드 (Ca(OH)2, Sigma-Aldrich Inc), and 칼슘 니트레이트 (Ca(NO3)2· 4H2O, Sigma-Aldrich Inc.)로부터 제조하였다.
냉동-건조:
미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐- 글리코사미노글리칸 현탁액의 10 mm 층을 바닥 두께가 8 mm인 직사각형 (25 mm x 50 mm) 폴리설폰 모울드에 배치시켰다. 상기 기술된 온도 기울기 기술[10, 15]을 이용하여 미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 현탁액을 고형화시켰다. 냉동-건조기 선반 온도를 실온에서 -20℃까지 미리 특정된 속도(3℃/분)로 변경시키고, 이후 -20℃에서 60분 동안 유지시켜 완전히 고형화시키고[15] ; 완전한 고형화 후에, 냉동된 현탁액을 200 mTorr의 압력, 25℃의 온도에서 24 시간 동안 승화시켜, 평균 공극 크기가 250 ㎛ 이상인 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드를 형성하였다.
제조후 공정:
스캐폴드를 이의 모울드로부터 제거하고, 미리 특정된 카르보디이미드 (액체 화합물 계열) 가교 처리를 이용하여 가교하였다[16]. 가교 후에, 스캐폴드를 포스페이트 완충된 염수 (PBS, Sigma-Aldrich Inc.) 및 증류수로 반복적으로 세척하였다. 수화된 스캐폴드를 다시 -40℃의 일정 온도의 냉동-건조기에 60분 동안 배치시키고, 승화 (0℃, 200 mTorr, 17 시간)시켜, 스캐폴드로부터 액체 내용물을 제거하였다.
B. 이층 스캐폴드를 형성하기 위한 고체-액체 동시-합성
현탁액 제조:
0.05 M 인산 중 타입 I 소 아킬레스 힘줄 콜라겐의 현탁액을 포함한 냉동된 고점성의 슬러리 (Devro Casings, Moodiesburn, Chyston, Scotland)를 실온이 되게 하였다.
고체-액체 동시-합성 :
미네랄화된 (브루샤이트) 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 다공성 구성성분을 초기 스캐폴드 제조 동안에 사용된 직사각형 폴리설폰 모울드에 배치시켰다. 이후 고점성 타입 I 콜라겐 현탁액의 2 mm 층을 미네랄화된 다공성 구성성분의 상부 표면을 가로질러 분포시키고, 다공성 구성성분/슬러리 구조물을 15분 동안 정시켜 공극 구조물의 표면 가까이 영역에 침윤시켰다.
상기 기술된 온도 기울기 기술 [10, 15]을 이용하여 고점성 타입 I 콜라겐 현탁액을 고형화시켰다. 냉동-건조기 선반 온도를 실온에서 -40℃까지 미리 특정된 속도(1.4℃/분)으로 변경시키고, 이후 -40℃에서 60분 동안 유지시켜 완전히 고형화시키고 [15]; 고형화 후에, 냉동된 현탁액을 200 mTorr의 압력, 0℃의 온도에서 17 시간 동안 승화시켰다.
제조후 공정:
스캐폴드를 이의 폴리설폰 모울드로부터 제거하고, 스캐폴드 강성도를 증가시키고 스캐폴드 분해 속도를 감소시키기 위하여 상기에 기술된 카르보디이미드 가교 처리[19]를 이용하여 가교시켰다.
이러한 공정은 두개의 별도의 영역을 갖는 층상 스캐폴드 (미네랄화된 타입 I 콜라겐-글리코사미노글리칸 및 비미네랄화된 타입 I 콜라겐 층)을 제조할 수 있다.
본 발명은 상이한 구조적, 조성적, 및 기계적 성질의 영역을 갖는 큰 다공성 스캐폴드를 제조하기 위한 신규한 방법을 기술한 것이다. 제 1 방법은 고체상 동시-합성을 포함한다. 제 2 방법은 고체-액체 동시-합성을 포함한다.
고체상 동시-합성은 보다 큰 스캐폴드 구조의 상이한 구성성분을 별도로 제조하고 예를 들어 냉동 건조되어 상호침투 콜라겐 섬유 네트워크를 형성하는 콜라겐-계열 슬러리의 박막으로 함께 결합시킨다. 이러한 방법은 별도의 영역에서 조절된 물리적 (즉, 공극 크기, 공극 형태, 가교, 밀도, 분해 속도), 기계적 (즉, 모듈러스), 및 화학적 (즉, 미네랄 함량, 콜라겐 함량, 글리코사미노글리칸 함량) 성질을 갖는 특수한 스캐폴드를 제조할 수 있다.
고체-액체 동시-합성은 상이한 스캐폴드 구성성분을 별도로 제조하고, 이후 냉동-건조에 의해 보다 큰 스캐폴드로 다른 슬러리와 함께 결합할 수 있게 한다. 이러한 방법은 별도의 영역에 조절된 물리적 (즉, 공극 크기, 공극 형태, 가교 밀도, 분해 속도), 기계적 (즉, 모듈러스), 및 화학적 (즉, 미네랄 함량, 콜라겐 함량, 글리코사미노글리칸 함량) 성질을 갖는 특수한 스캐폴드를 제조할 수 있다. 특히 고체상 동시-합성 및 고체-액체 동시-합성을 이용하여 달성된 별도의 스캐폴드 영역 간에 강력한 계면 강도, 및 스캐폴드 구성성분 간의 화학적 확산이 유익하지 않는 경우에 인접한 스캐폴드 영역 간의 화학적 확산을 조절하는 능력이 중요하다.
참고문헌
Figure 112009014451211-PCT00001
Figure 112009014451211-PCT00002
Figure 112009014451211-PCT00003
Figure 112009014451211-PCT00004
별첨(Annex)
2006년 3월 6일에 출원된 본 출원인의 종래 국제특허출원 PCT/GB2006/000797호의 내용은 하기와 같다.
Figure 112009014451211-PCT00005
Figure 112009014451211-PCT00006
Figure 112009014451211-PCT00007
Figure 112009014451211-PCT00008
Figure 112009014451211-PCT00009
Figure 112009014451211-PCT00010
Figure 112009014451211-PCT00011
Figure 112009014451211-PCT00012
Figure 112009014451211-PCT00014
Figure 112009014451211-PCT00015
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Figure 112009014451211-PCT00017
Figure 112009014451211-PCT00018
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Figure 112009014451211-PCT00027
Figure 112009014451211-PCT00028
Figure 112009014451211-PCT00029
Figure 112009014451211-PCT00030
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이하는 상기 별첨인 2006년 3월 6일에 출원된 본 출원인의 종래 국제특허출원 PCT/GB2006/000797호의 국문 번역 내용이다:
본 발명은 생물의학적 적용을 위한 합성 뼈 재료, 특히, 콜라겐, 칼슘 포스페이트, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 조직공학용 다공성 모놀리스 및 다공성 적층된 스캐폴드에 관한 것이다.
천연 뼈는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸을 포함하는 비콜라겐성 유기 상, 및 칼슘 포스페이트의 생체복합물이다. 이의 복잡한 계층 구조는 높은 강성, 강도, 및 골절 인성을 포함하는 예외적인 기계적 특성을 유도하고, 매일 뼈에 가해지는 생리적 스트레스에 뼈가 견딜 수 있게 한다. 당해 기술 분야의 연구자들이 당면한 과제는 인체 또는 동물 체내에서 합성 물질에 및 그 주위에 천연 뼈가 성장할 수 있는 조성 및 구조를 지니는 합성 물질을 만들어 낸다는 것이다.
뼈가 신체 환경에서 형성된 뼈-유사 인회석층을 통해 인체 내에서 칼슘 포스페이트에 직접 결합하는 것(생체 활성으로 언급되는 특성)이 관찰되었다. 반면 콜라겐, 및 콜라겐과 글리코스아미노글리칸과 같은 다른 생체유기물질을 포함하는 공중합체가 수많은 세포 타입의 부착 및 증식을 위해 인체내에서 뼈의 생성 및 유지를 위해 필요한 것을 포함하는 최적의 기질인 것으로 알려져 있다.
히드록시인회석은 뼈 대용 물질에서 구성요소로서 가장 일반적으로 사용되는 칼슘 포스페이트이다. 그러나, 이것은 브러사이트, 트리칼슘 포스페이트 및 옥타칼슘 포스페이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 다른 형태에 비하여 비교적 불용성인 물질이다. 인회석의 비교적 낮은 용해성은 신체내에서 재흡수율이 특히 낮기 때문에 생체물질을 제조할 때 불리할 수 있다.
히드록시인회석과 같은 칼슘 포스페이트는 기계적으로 강성인 물질이다. 그러나, 이들은 천연 뼈에 비하여 비교적 부서지기 쉽다. 콜라겐은 기계적으로 인성의 물질이나, 천연 뼈에 비하여 비교적 강성이 낮다. 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공중합체를 포함하는 물질은 콜라겐 단독보다 인성이고 강성이나, 여전히 천연 뼈에 비하여 비교적 낮은 강성을 지닌다.
히드록시인회석 보다 개선된 기계적 인성 및 콜라겐 및 콜라겐과 글리코스아미노글리칸의 공중합체 보다 개선된 강성을 지니는 합성 뼈-대용 물질을 제조하려는 당해 기술분야의 종래 시도로서, 콜라겐 및 인회석을 기계적 혼합에 의해 조합하는 방법이 있다. 상기 기계적 방법은 EP-A-0164 484호에 기재되어 있다.
이후의 기술적 진보로는 히드록시인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 기계적 혼합시키는 것을 포함하여, 뼈-대체 물질을 제조하는 방법이 있다. 이것은 EP-A-0214070호에 기술되어 있다. 상기 문헌은 콜라겐에 콘드로이틴-4-설페이트를 탈수소가열로 가교시키는 것을 추가로 기술한다. 인회석, 콜라겐 및 콘드로이틴-4-설페이트를 포함하는 물질이 양호한 생체적합성을 지님이 발견되었다. 인회석을 콜라겐, 및 선택적으로 콘드로이틴-4-설페이트와 기계적으로 혼합시켜 본질적으로 인회석의 콜라겐/콘드로이틴-4-설페이트-코팅된 입자를 형성한다. 상기 물질이 인체 또는 동물체내에 존재할 때 생체적합성임에도 불구하고 천연 뼈의 제한된 내증식을 일으키며 합성 물질의 칼슘 포스페이트 상이 개질되지 않음이 발견되었다.
골격부의 재생은 외상, 기형, 또는 질병에 따라 달라질 수 있고, 피부, 신경 및 다른 대부분의 조직 유형과 달리, 골격 결함이 다양하고, 조직 유형(즉, 뼈, 연골조직, 힘줄 및 인대)에 따라 특징적이며, 규칙적인 기계적 하중이 걸리는 위치에 관련되고, 미네랄화된 조직과 미네랄화되지 않은 조직 유형(예컨대, 인대 삽입부, 뼈/연골조직에서의 "최고점(tidemark)") 사이 중간을 가로지르기 때문에 외과 수술에 대한 특별한 도전으로 간주된다.
현재의 임상적 접근방법으로는 재흡수 불가능 인공 임플란트, 자가 또는 동종 이형 조직 이식편, 화학 제제, 세포 이식 또는 이들 방법의 조합에 의한 골격 결을 재생하는 것이다. 이러한 접근 방법들이 단일 조직 타입의 치료에 대하여는 어느 정도 성과가 있었으나, 예컨대, 관절 접합 결함과 같은 미네랄화된 조직과 미네랄화되지 않은 조직 사이 경계면이 관련되는 경우, 기껏해야 불완전한 치료결과를 초래하게 된다. 또한, 현재 치료법 중 가장 성공적인 치료법이라 하더라도 제공 부위로부터 조직의 수확 및/또는 뼈, 연골, 인대 또는 힘줄에 대한 접합을 필요로 한다. 후자는 실행에 어려움이 있고, 접합 구멍을 형성하는 부가적인 결함을 발생하는 데 반하여, 전자의 과정들은 제공 부위의 부족 및 제공 부위의 이환율 때문에 어려움이 있다.
복합 스캐폴드 및 적층 스캐폴드라는 용어는 동의어로서, 각 층이 인접한 다른 층 또는 층들의 물질 조성과 실질적으로 다른 물질 조성을 가지는 둘 이상의 층을 포함하는 스캐폴드를 의미하며, 단일-적층된 스캐폴드 또는 모놀리스 스캐폴드라는 용어는 동의어로서, 전체적으로 각 층 내의 물질 조성이 대체로 균일한 하나의 층만을 포함하는 스캐폴드를 의미한다.
최근, 연골, 또는 연골 및 뼈와 관련한 관절 접합 결함의 치료를 위한 다공성, 적층 스캐폴드를 적용하는 조직-공학 기법을 개발하기 위하여, 한정된 수의 몇 가지 노력들이 있어왔다. 이러한 연구들은 뼈 및 연골의 재생을 동시에 유발하지만, 각각에 대한 별도의 스캐폴드를 사용한다(Niederauer 등, 2000; .Schaefer 등, 2000; Gao 등, 2001; Gao 등, 2002; Schaefer 등, 2002; Sherwood 등, 2002; Hung 등, 2003; Hunziker 및 Driesang, 2003).
적층된 스캐폴드의 다른 특징은 연골 밑 뼈 판에 뼈 층이 직접 부착되어 접합 부분이 없이 고정 지지될 수 있다는 것이다. 제공된 연골부는 뼈 부분에 강하게 부착되고, 다른 부가의 고정이 필요 없다. 또한 무접합 고정은 뼈에 대해 힘줄 및 인대의 삽입부와 관련한 결함을 치료할 수도 있다. 이러한 새로운 시도의 장점에도, 두 가지 단점으로 인하여 적층된 스캐폴드의 효율성이 제한될 수 있다. 첫 번째 단점은 스캐폴드 각 층에 대해 사용되는 물질에 관한 것이다. 이제까지 재흡수가능한 합성 폴리머가 연골층에 사용되는 유일한 재료였으며, 이러한 스캐폴드의 뼈 부분의 구성성분이었다. 합성 폴리머는 제작이 용이하지만, 세포 결합 및 증식을 촉진하는 데는 콜라겐과 같은 천연 폴리머에 미치지 못하며, 분해될 때 고농도의 산을 더 많이 방출한다. 더욱이, 힘줄 또는 인대 회복이 필요한 경우의 적용에 대하여, 가교가 이루어지는 방식과 무관하게, 재흡수가능한 합성 폴리머는 재활 운동 중에 적용되는 감소된 하중을 견디기에도 부적합한 강도 및 경도를 갖는다.
종래의 적층된 스캐폴드의 두 번째 단점은 각 층간의 경계면에 대한 것이다. 천연 관절 접합 및 힘줄/인대 삽입 지점은 미네랄화된 영역과 미네랄화되지 않은 영역 사이의 콜라겐 섬유의 연속성에 의해 특성화된다. 매끄러운 변이로 생성된 시스템(연질 경계면)은 이들 부위에 대한 필수적인 기계적 안정성을 부여하고, 이는 기계적 결함 없이 생리적 하중을 견딜 수 있도록 한다. 반대로, 현재의 여러 적층 스캐폴드는 두 가지 비유사 물질들 간에 구별되는 경계를 형성하는 경질 경계면을 포함한다. 봉합술(Schaefer 등, 2000), 섬유 접착술(Gao 등, 2001) 및 다른 기술(Gao 등, 2002;, Hung 등, 2003)은 이러한 경계면을 보강하기 위하여 사용되어 왔다. 그러나, 제어된 동물 모델에서 조차 경계면간의 탈착이 보고되고 있다. 또한 이러한 봉합 및 접착술은 민감하고 재생이 매우 어렵다.
콜라겐 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸(GAGs)의 다공성 스캐폴드를 제조하기 위하여, 동결-건조 프로토콜의 파라미터가 제어될 수 있는 수단을 개발하기 위한 연구들이 이루어져 왔다(Yannas 등, 1989; O'Brien 등, 2004; O'Brien 등, 2005; Loree 등, 1989). 이러한 기술들은 공극 크기 및 종횡비와 같은 스캐폴드의 특징이 제어 방식, 외상 또는 상해 부위에서 치유반응에 대한 효과를 나타내는 것으로 알려진 파라미터들을 내에서 변화시키는 거이다. 그러나, 골격 및 근육 골격 결함과 관련한 상처의 치료를 위해서는, 미네랄화되지 않은 콜라겐-GAG 스캐폴드의 특성에 반하여, 뼈의 특성에 근접한 물질 조성 및 기계적 특성이 있는 다공성 스캐폴드를 제조하기 위한 기술이 개발될 필요가 있다.
본 발명은 종래 분야와 관련된 적어도 일부의 문제점들을 해소하기 위해 고안된 것이다.
본 발명에 따른 무기물 및 유기물을 포함하는 생체 적합 복합 물질 제조방법은
(a) 액체 캐리어, 무기물 및 유기물을 포함하는 제 1 슬러리 조성물을 제공하는 단계;
(b) 슬러리를 위한 모울드를 제공하는 단계;
(c) 모울드 내에 슬러리를 침착(deposit)하는 단계;
(d) 모울드 내에 침착된 슬러리를 액체 캐리어가 복수의 고체 결정 또는 입자로 전환되는 온도로 냉각시키는 단계;
(e) 승화 및/또는 증발에 의해 복수의 고체 결정 또는 입자 중 적어도 일부를 제거하여, 무기물 및 유기물을 포함하는 다공성 복합 물질이 남도록 하는 단계; 및
(f) 모울드로부터 물질을 분리하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 "생체 적합 물질"은 인간 또는 동물의 몸에 생리적으로 적합한 물질을 말한다.
본 명세서에서 "슬러리"는 슬러리, 용액, 현탁액, 콜로이드 및 분산액을 포함한다.
본 명세서에서 "무기물"은 전형적으로 칼슘 포스페이트 물질을 포함한다.
본 명세서에서 "유기물"은 전형적으로 생-유기종, 예컨대 수성 용매에 용해 또는 분산되어 슬러리를 형성할 수 있다. 하나 이상의 알부민, 글리코스아미노글리칸, 하이알루로난, 키토산, 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드가 예가 될 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐이, 선택적으로 글리코스아미노글리칸과 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "콜라겐"은 재조합 인간 (rh) 콜라겐을 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 무기물은 칼슘 포스페이트 물질을 포함하며, 유기물은 콜라겐, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 이는 칼슘 포스페이트 물질 및 콜라겐 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 형성한다. 바람직하게는, 제 1 슬러리가 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 제 1 슬러리가 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물을 포함한다.
또는, 제 1 슬러리가 단순히 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸의 기계적 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 예컨대, EP-A-0164 484 및 EP-A-0214070에 기재된 바와 같은 종래 기술에 의해 제조될 수 있다. 기계적 혼합물이 슬러리를 형성하는 데 사용될 수는 있지만, 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물 또는 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물이 바람직하다.
칼슘 포스페이트 물질은, 예컨대, 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 칼슘 포스페이트 물질은 브러사이트를 포함한다.
슬러리의 pH는 2.5 내지 6.5가 바람직하며, 더 바람직하게는 2.5 내지 5.5이고, 더욱더 바람직하게는 3.0 내지 4.5이며, 3.8 내지 4.2가 가장 바람직하다.
슬러리 조성물은 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 슬러리 조성물은 하나 이상의 칼슘 포스페이트 물질을 포함할 수 있다. 전구체 슬러리 내에 다른 화학종(은, 실리콘, 실리카, 식탁용 소금, 설탕 등)이 배제되는 것은 아니다.
적어도 복수 고체 결정 또는 입자 중 일부가 승화 및/또는 증발에 의해 제거되어 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 남기게 된다. 바람직하게는, 승화시킨다.
단계 (d) 및 (e)는 동결-건조법에 의해 행해진다. 액체 캐리어가 물인 경우, 승화 단계는 모울드 및 동결 슬러리 주변의 압력을 물/얼음/물 증기 시스템의 삼성분점 아래로 낮추고, 얻어진 진공 압력하에서 고체-증기 전이 온도 보다 높은 온도로 온도를 높이는 과정을 포함한다. 주위 액체 증기 부분압이 현재 온도에서 동결 액체의 부분압 더욱 더 낮은 한, 생성물 내의 얼음은 승화를 통해 직접 증기로 전환된다.
온도는 전형적으로 0℃ 이상의 온도로 상승한다. 이 단계는 승화를 통해 동결 슬러리로부터 얼음 결정을 제거하는 데 바람직하다.
동결-건조 파라미터는 바람직한 공극 크기 및 종횡비를 제어하기 위하여 조정될 수 있다. 일반적으로, 냉각 속도가 낮고 최종 동결 온도가 높을수록 (예컨대, 약 -10℃의 온도까지 분당 대략 0.25℃의 온도로 냉각) 더 높은 종횡비를 가지는 큰 공극이 생기며, 냉각 속도가 빠르고 최종 동결 온도가 낮을수록 (예컨대, 약 -40℃의 온도까지 분당 대략 2.5℃의 온도로 냉각) 작게 균분된 공극을 형성하는 경향이 있다.
본 명세서에서 "모울드"는 슬러리 조성물을 성형, 유지 또는 지지할 수 있는 임의의 모울드, 컨테이너 또는 기질을 포함한다. 따라서, 가장 간단한 형태의 모울드는 단지 지지 표면을 포함할 수 있다. 모울드는 임의의 바람직한 형성을 가질 수 있으며, 폴리머(예컨대, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티타늄, 코발트 크롬), 세라믹(예컨대, 알루미나, 지르코니아), 유리 세라믹 및 유리(보로실리케이트 유리)를 포함하는 임의의 적합한 물질로부터 제조될 수 있다.
2004년 10월 28일 출원된 본 출원인의 선출원, PCT/GB04/004550는 콜라겐, 브러사이트 및 글리코스아미노글리칸의 삼성분 공침물 및 그 제조방법을 기재하고 있다. PCT/GB04/004550의 기재 내용은 참고문헌으로서 본 출원과 관련된다.
참고문헌 PCT/GB04/004550에 기재된 제조방법은 콜라겐, 칼슘원(calcium source) 및 인 소스(phosphorous source) 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 산성 수용액을 제공하는 단계, 및 콜라겐, 브러사이트 및 글리코스아미노글리칸을 수용액으로부터 함께 침전시켜 삼성분 공침물을 형성하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 "공침물"은 동일한 용액/분산액으로부터 실질적으로 동시에 침전된 두가지 또는 세 가지 화합물의 침전물을 의미한다. 이것은, 특히 성분들이, 예를 들어 상이한 용액에서 개별적으로 침전되는 경우에 성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과는 구별된다. 공침물의 미세구조는 그 성분들의 기계적 혼합으로부터 형성된 물질과는 실질적으로 상이하다.
공침물 제조 단계에 있어서, 칼슘원은 칼슘 니트레이트, 칼슘 아세테이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 알콕사이드, 수산화칼슘, 칼슘 실리케이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 글루코네이트 및 헤파린의 칼슘 염 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 헤파린의 칼슘 염은 돼지의 장 점막으로부터 유래될 수 있다. 적합한 칼슘염이 시그마-알드리치 인크(Sigma-Aldrich Inc.)로부터 시판된다. 인 소스는 암모늄-디히드로겐 포스페이트, 디암모늄 히드로겐 포스페이트, 인산, 이나트륨 수소 오르쏘포스페이트 2-수화물 (Na2HPO4.2H2O, 종종 GPR 소렌슨 염이라 불림) 및 트리메틸 포스페이트, 포스페이트의 알칼리 금속 염 (예컨대, Na 또는 K), 포스페이트의 알칼리토류 염 (예컨대, Mg 또는 Ca) 중 하나 이상으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
글리코스아미노글리칸은 반복 이당류 유닛을 함유하는 비분지된 장쇄 다당류를 함유하는 거대분자 패밀리이다. 바람직하게는, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 더마틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트 및 히알루론산으로부터 선택된다. 콘드로이틴 설페이트는 콘드로이틴-4-설페이트 또는 콘드로이틴-6-설페이트일 수 있고, 둘 모두는 시그마-알드리치 인크로부터 시판된다. 콘드로이틴-6-설페이트는 상어 연골로부터 유래될 수 있다. 히알루론산은 사람 탯줄로부터 유래할 수 있다. 헤파린은 돼지의 장 점막으로부터 유래될 수 있다.
콜라겐은 가용성 또는 불용성이며, 임의의 동물 내의 임의의 조직으로부터 유래될 수 있고, 임의의 종래 기술을 사용하여 추출될 수 있다.
침전은 콜라겐, 칼슘원, 인 소스 및 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 산성 수용액에서 조합하고, 침전이 일어날 때까지 용액을 방치하고, 용액을 교반하고, 암모니아와 같은 염기성 적정제를 사용하여 적정하고, 미리 제조된 브러사이트와 같은 핵형성제를 첨가하고, 칼슘원의 첨가 속도를 변화시키고, 상기 기술을 임의로 조합시킴에 의해 수행될 수 있다.
슬러리 내에 다른 성분들이 존재할 수 있음은 자명하다. 예컨대, 성장 인자, 유전자, 약물 또는 다른 생리학적 활성종이 단독 또는 상호 조합으로 슬러리에 첨가될 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 액체 캐리어 및 유기물 및 선택적으로 무기물을 포함하는 제 2 슬러리 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 냉각 단계 전, 상기 제 1 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 모울드 내에 상기 제 2 슬러리 조성물을 침착하는 단계를 더 포함한다. 전술한 바와 같이, 유기물은 하나 이상의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산, 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함한다.
제 2 슬러리 조성물은 무기물, 바람직하게 칼슘 포스페이트 물질을 포함할 수 있다.
바람직하게, 제 2 슬러리 조성물이 액체-캐리어, 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 이러한 실시예에 있어서, 제 2 슬러리 조성물은 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다. 공침물에 대하여는 제 1 슬러리의 제조와 관련하여 이미 기술하였다.
또는, 제 2 슬러리가 단지 콜라겐 및 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코스아미노글리칸 중 하나 또는 둘의 기계적 혼합물을 포함할 수 있다. 기계적 혼합물에 대하여는 제 1 슬러리의 제조와 관련하여 이미 기술하였다.
제 2 슬러리내의 칼슘 포스페이트 물질이 존재하는 경우, 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석이 선택될 수 있다.
제 1 및 제 2 슬러리 조성물은 모울드내에 제 1 및 제 2 층으로 침착될 수 있다. 예컨대, 제 1 슬러리가 모울드내에 침착되고, 제 2 슬러리가 침착된다. 이후, 모울드 내용물은 단계 (d), (e) 및 (f)를 거치게 될 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 다중-적층된 물질을 형성하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는 적어도 하나의 층이 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 다공성 복합 물질을 포함한다. 제 2 슬러리 조성물에 의해 형성된 층은 다공성 또는 비-다공성 층이다. 다공성 층이 요구되는 경우, 공극은 제 2 슬러리 내에 형성된 복수의 고체 결정 또는 입자의 승화 및/또는 증발에 의해 생성될 수 있다.이러한 기술은 이미 제 1 슬러리와 관련하여 기술하였으며, 바람직하게는 동결 건조법이 포함된다.
본 발명에 따른 방법은 액상에서 행해지며, 이는 제 1 슬러리 층 및 제 2 슬러리 층 사이의 확산에 의해 행해진다. 층은 임의적인 적층 순서 또는 기하학적 형태로 침착될 수 있다. 층은 예컨대, 수직(즉, 다른 층의 위에 적층), 수평(즉, 다른 층의 옆에 적층), 및/또는 방사상(다음 층 정상 위의 구상 층)으로 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 캐스팅 방법은 조직 공학용으로 사용되는 다공성 모놀리스 및 다공성 적층 스캐폴드를 제조할 수 있다.
제 1 및 제 2 슬러리 조성물이 모울드 내에 침착된 후, 모울드의 내용물은 냉각 단계 전, 24 시간 미만 동안 방치하는 것이 바람직하다. 이는 인접층 사이의 여러 슬러리 구성 성분의 경계-확산이 일어날 수 있어 유리하다. 이는 층간 결합 강도를 개선시킨다.
제 1 슬러리내의 액체 캐리어는 물을 포함하는 것이 바람직하다. 제 2 슬러리내의 액체 캐리어도 물을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 냉각 단계 전, 상기 제 1 및/또는 제 2 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 다른 슬러리 층이 모울드내에 침착될 수 있음을 알 수 있다.
냉각 단계 전, 모울드 내에 침착된 슬러리의 온도가 슬러리의 점성도에 영향을 미치는 것이 일반적이다. 온도가 너무 높으면, 슬러리의 점성도가 너무 낮아지게 되고, 이는 제 2 슬러리가 침착 되고 나서 제 1 층과 제 2 층이 완전 상호 혼합되는 바람직하지 않은 결과를 초래하게 된다. 또한, 너무 높은 온도는 콜라겐의 변성을 초래하기도 한다. 한편, 너무 낮은 온도는 슬러리의 점성도를 너무 높게 하여, 효율적인 분산, 연마 또는 성형이 이루어지지 못하게 하며, 얼음 결정 조기 에 형성될 염려가 있다. 따라서, 본 발명자들은 냉각 단계 전, 제 1 모울드 내에 침착된 슬러리의 온도가 바람직하게는 2 내지 40℃의 온도, 더욱 바람직하게는 4 내지 37℃, 더 더욱 바람직하게는 20 내지 37℃인 것을 발견하였다.
적층 슬러리 조성물이 사용된다면, 부가의 슬러리에도 이러한 온도 범위가 적용될 수 있다.
제 1 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계는 바람직하게 ≤0℃의 온도로 행해진다. 더욱 바람직하게, 냉각단계는 -100 내지 0 ℃의 온도범위로, 더욱 더 바람직하게 -80 내지 -10℃의 온도, 더욱 더 바람직하게 -40 내지 -20℃의 온도로 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
제 1 모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계는 바람직하게 0.02 - 10℃/분, 더 바람직하게 0.02 - 6.0℃/분, 더욱 더 바람직하게 0.2 - 2.7℃/분의 냉각 속도로 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
일반적으로, 냉각 속도가 느리고 최종 동결 온도가 높을 수록(예컨대, 0.25℃/분의 냉각 속도로 -10℃의 온도까지 냉각) 더 높은 종횡비를 가지는 공극이 형성되고, 냉각 속도가 빠르고 최종 동결 온도가 낮을 수록(예컨대, 2.5℃의 냉각 속도로 -40℃의 온도까지 냉각) 작게 균분된 공극을 형성하는 경향이 있다.
모울드 내에 침착된 슬러리를 냉각하는 단계는 1 - 200 kPa, 바람직하게 50 - 150 kPa, 더욱 바람직하게 50 - 101.3 kPa의 압력에서 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 50 kPa 미만의 압력에서는 슬러리내에 버블을 형성하고, 200 kPa 초과의 압력에서는 인접층의 과도한 혼합을 초래하는 것을 발견하였다.
제 1 모울드 내에 침착된 슬러리의 두께는 바람직하게 0.1 - 500 mm, 더욱 바람직하게 0.5 - 20 mm, 더욱 더 바람직하게 1.0 - 10 mm이다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 두께가 500 mm를 초과하는 경우에는 완전하게 고화(solidify)가 이루어지기 어렵고, 두께가 0.1 mm 미만인 경우 거의 순간적으로 동결이 일어날 수 있어 얼음 결정의 핵화 및 성장 과정을 정확하게 제어하기 어렵게 된다.
모울드 내에 침착되기 전의 제 1 슬러리의 점성도는 바람직하게 0.1 - 50 Pa·s, 더욱 바람직하게 0.1 - 10 Pa·s, 더욱 더 바람직하게 0.5 - 5 Pa·s이다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 슬러리의 점성도가 너무 큰 경우, 분산, 연마 또는 성형이 어렵고, 너무 낮은 점성도의 경우, 제 2 슬러리가 침착되면 제 1 및 제 2 층간에 완전한 상호 혼합이 일어나게 된다(따라서, 바람직하지 않음).
승화에 의해 제 1 슬러리 내의 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계는 바람직하게 0 - 0.08 kPa, 더욱 바람직하게 0.0025 - 0.08 kPa, 더욱 더 바람직하게 0.0025 - 0.04 kPa의 압력 범위에서 행해진다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 물의 삼중점 압력(약 0.08 kPa) 이상의 압력에서 행해지는 경우, 승화 대신 용융이 일어날 염려가 있고, 너무 낮은 압력은 수행하기도 어렵고 불필요한 승화를 촉진하게 한다.
제 1 슬러리 내 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 승화에 의해 제거하는 단계에 관하여, 승화 시간이 너무 짧으면, 나머지 물과 용매가 스캐폴드 벽의 재용해를 초래하기 96 시간 이하의 시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 12 - 72 시간, 더욱 더 바람직하게 24 - 36 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다.
승화에 의해 제 1 슬러리 내 고체 결정 또는 입자의 적어도 일부를 제거하는 단계는 바람직하게 -10 - 60℃의 온도, 더욱 바람직하게 0 - 40℃의 온도, 더욱 더 바람직하게 20 - 37℃의 온도, 가장 바람직하게 25 - 37℃의 온도 범위에서 수행한다. 다층 슬러리 조성물이 사용되는 경우, 부가적인 슬러리에도 이러한 범위가 적용될 수 있다. 승화 중의 온도가 너무 낮으면, 승화가 완료되기에 필요한 시간이 너무 길어지게 되고, 온도가 너무 높으면(즉, 40℃ 초과의 온도), 콜라겐이 변성될 위험이 있다.
물질이 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 콜라겐과 하나 이상의 글리코스아미노글리칸이 다공성 생체 적합 복합 물질(porous composite bimaterial) 내에서 가교하는 단계를 더 포함한다. 가교은 전형적으로 물질이 승화 후에 모울드로부터 제거된 후 일어난다. 교차 결합은 공침물을 하나 이상의 감마 방사, 자외선 방사, 탈수열처리, 글루코스, 만노스, 리보오스 및 슈크로스와 같은 단당류와의 무효소 당화, 삼성분 공침물과 하나 이상의 글루타르알데히드, 카보디이미드(예컨대, 에틸 디메일아미노프로필 카보디이미드) 및/또는 노르- 디히드로구아리아레트산과의 접촉법, 또는 이들 방법의 임의의 조합에 의한 방법을 행함으로써 수행된다. 이들 방법은 기술분야에 공지되어 있다.
물질이 칼슘 포스페이트를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 다공성 생체 적합 복합 물질 내의 칼슘 포스페이트 물질의 적어도 일부를 다양한 칼슘 포스페이트 상으로 전환하는 단계를 더 포함한다. 예컨대, 방법이 다공성 생체 적합 복합 물질내의 적어도 일부의 브러사이트를 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로 전환시킨다. 브러사이트의 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로의 전환은 가수분해에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 상 전환은 전형적으로 물질이 모울드로부터 제거( 및 선택적으로 가교)된 후에 일어난다.
인회석은 칼슘 및 인산염을 포함하는 광물 부류이며, 일반식 Ca5(PO4)3(X)이며, X는 전형적으로 OH-, F- 및 Cl-인 이온, 또는 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 다른 이온 일 수 있다. 본 명세서에서 "인회석"은 또한 실리콘 치환 인회석과 같은 대체 인회석일 수 있다. 본 명세서에서 "인회석"은 인회석의 구체적인 예인 수산화인회석일 수 있다. 수산화 인회석은 또한 예컨대, 실리콘과 같은 다른 화학종으로 치환될 수도 있다.
상기한 바와 같이, 슬러리 층은 상기 냉각 단계 전, 또는 상기 제 1 및/또는 제 2 슬러리 조성물이 침착되기 전 또는 후에, 모울드내에 침착 될 수 있다. 추가의 슬러리도 전형적으로 예컨대, 액체 캐리어, 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함할 수도 있다. 모울드의 내용물을 바람직하게 24 시간 미만 동안 방치하여, 인접 층 간의 여러 슬러리 성분의 경계 확산이 이루어지게 한다.
따라서, 본 발명은 하나, 둘 또는 그 이상의 층을 포함하는 생체 적합 복합 물질의 제조방법을 제공한다. 적어도 하나의 층은 바람직하게 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질, 및 바람직하게는 글리코스아미노글리칸의 다공성 생체 복합물질을 포함한다. 모든 층은 바람직하게 콜라겐을 포함한다.
본 발명에 따른 생체 적합 복합 물질은 예컨대, 적어도 하나의 층이 다공성인 다공성 모놀리스 스캐폴드, 또는 다중-적층된 스캐폴드를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 생체 적합 복합 물질은 근골격 및 치과적 용도의 조직 재생 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게 제 1 및 제 2 층 내의 유기 성분으로서 콜라겐을 혼합하는 것과 관련된다(바람직하게는, 콜라겐이 제 1 및 제 2 층 내의 주요 유기 성분임). 부가 층이 존재하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게 하나 이상의 부가 층 내 유기 성분으로서 콜라겐을 혼합하는 것과 관련된다(바람직하게는, 콜라겐이 하나 이상의 부가 층 내의 주요 유기 성분임). 본 발명에 따른 방법은 모든 층, 따라서 이들 사이의 경계면을 액상으로 동시에 제조하는 데 관련된다. 이는 경계 확산을 통해 강한 층간 경계면을 형성하게 된다. 본 명세서에서 "경계 확산"은 서로 다른 조성을 가지는 두 슬러리가 접하여 위치할 때 일어나는 분자 확산 또는 브라운 운동에 의한 혼합을 의미한다.
제 2의 관점에서, 본 발명은 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질 및 하나의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산 또는 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함하는 다공성 공침물로부터 형성되며, 매크로포어 사이즈(포어 직경)가 바람직하게 1 - 1000 마이크론, 더욱 바람직하게 200 - 600 마이크론인 합성 생체 적합 복합 물질을 제공한다. 본 발명에 따른 복합물질은 바람직하게 콜라겐을 포함한다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택된다. 다공성 물질은 바람직하게 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물을 포함한다. 이는 상기 본 발명의 제 1 관점과 관련하여 이미 기술하였다. 본 명세서에서 물질이 "다공성"이라는 것은 물질이 매크로포어 및/또는 마이크로포어를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. "매크로포어"는 전형적으로 대략 10 마이크론 초과 스캐일의 공극과 관련한 특징을 말한다. "미세공극률"은 전형적으로 대략 10 마이크론 미만 스캐일의 공극과 관련한 특징을 말한다. 물질내의 오픈 및 클로즈 셀의 임의의 조합이 가능함을 알 수 있다. 예컨대, 물질이 일반적으로 매크로포어 및 마이크로포어를 모두 포함하는 조합이 될 수 있다.
본 발명의 제 1 및 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)는 전형적으로 1 내지 1200 마이크론, 바람직하게 10 내지 1000 마이크론, 더욱 바람직하게 100 내지 800 마이크론, 더욱 더 바람직하게 200 내지 600 마이크론이다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서 평균 종횡비 범위는 바람직하게 1 내지 50, 더욱 바람직하게 1 내지 10이고, 가장 바람직하게는 대략 1이다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내의 공극 크기 분포(평균 포어 직경의 표준 편차)는 바람직하게 1 내지 800 마이크론, 더욱 바람직하게 10 내지 400 마이크론, 더욱 더 바람직하게 20 내지 200 마이크론이다. 본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내의 공극률은 바람직하게 50 내지 99.99 vol%, 및 더욱 바람직하게 70 내지 98 vol%이다.
오픈-셀 공극률의 백분률(오픈- 및 클로즈-셀의 전체 공극수의 백분률로 측정)은 바람직하게 1 내지 1 100%, 더욱 바람직하게 20 내지 100%, 및 더욱 더 바람직하게 90 내지 100%이다.
본 발명의 제 3 관점에 있어서, 본 발명은 생체 적합 물질의 적어도 일부가 칼슘 포스페이트 물질 및 둘 이상의 콜라겐 [재조합 인간 (rh) 콜라겐 포함], 글리코스아미노글리칸, 알부민, 하이알루로난, 키토산 및 일부 콜라겐 폴리펩티드 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드를 포함하는 다공성 삼성분 공침물로부터 형성된다. 본 발명에 따른 물질은 바람직하게 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 본 발명에 따른 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명에 따른 다공성 물질은 바람직하게 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다. 이는 본 발명의 제 1 관점과 관련하여 이미 기술하였다. 본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)가 제 3의 관점에도 적용될 수 있다. 평균 종횡비 범위, 공극 크기 분포, 공극률 및 오픈-셀 공극 백분률에 대하여도 동일하다. 제 4의 관점에서, 본 발명은 제 2 및 제 3의 관점에 따른 생체 적합 복합 물질로 이루어진 제 1 층; 및 상기 제 1 층에 결합되고, 콜라겐, 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 3 성분 공침물을 포함하는 물질로 형성된 제 2 층을 포함하는 합성 생체 적합 복합 물질을 제공한다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택된다.
바람직하게, 제 1 및 제 2 층은 일체로 형성된다. 유리하게는, 액상 공합성과 관련된 방법에 의해 형성된다. 이는 다중 층을 포함하는 밀집 또는 다공성 물질로 이루어진 인접층이 액체 캐리어 또는 캐리어들을 제거시키기 전에, 각 층에 대한 전구체를 포함하는 슬러리를 전체적으로 상호 접촉시킴으로써 형성되며, 모든 층으로부터 액체 캐리어 또는 캐리어들의 제거는 실질적으로 동시에 행해지는 것이 바람직하다. 액체 캐리어를 제거하기 전에, 전구체 슬러리(즉, 아직 액상)를 전체 접촉시키는 것이 인접 슬러리 사이에 경계 확산이 일어날 수 있도록 한다. 이는 생성 물질의 인접층 사이 경계면에 중간확산영역이 생기게 되며, 이 영역의 물질 조성은 인접층의 조성에 대해 중간적이다. 중간 확산 영역의 존재로 인하여 인접층 사이의 경계면에 대하여 기계적 강도 및 안정성을 부여할 수 있다. 따라서, 제 1 및 제 2 층은 경계 확산층을 통하여 바람직하게 결합되어 있다.
또는, 제 1 및 제 2 층은 경계 층을 통하여 서로 결합될 수 있다. 본 명세서에서 "경계 층"은 결합 강도를 개선하거나 또는 생성 스캐폴드의 인접층 사이의 셀, 분자 또는 유체의 경로를 차단할 목적으로 다른 두 층 사이에 독립적으로 침착된 임의의 층을 의미하며, 예컨대, 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 섬유소, 안티-안제오젠 약물(예컨대, 수라민(suramin)), 성장인자, 유전자 또는 임의의 다른 성분들이 될 수 있다. 경계 확산층은 인접층 사이의 경계 확산층으로 인하여 상호 배타적으로 형성되는 데 반하여, 경계 층은 조성이 다른 슬러리로서 별도로 침착되기 때문에 경계 층과 확산층은 구별된다.
제 1 층은 다공성이다. 제 2 층은 필요한 경우 비-다공성 또는 실질적으로 비-다공성 층일 수 있으나, 다공성인 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)가 본 발명의 제 4의 관점에도 적용될 수 있다. 평균 종횡비 범위, 공극 크기 분포, 공극률 및 오픈-셀 공극 백분률에 대하여도 동일하다. 본 발명의 제 2, 3, 또는 4 의 관점에서, 제 1 및/또는 제 2 층에 결합되는 하나 이상의 부가 층들을 포함할 수 있으며, 상기 각 부가 층이 콜라겐, 또는 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 또는 콜라겐 및 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 및 적어도 하나의 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 물질로 형성된다. 칼슘 포스페이트 물질은 바람직하게 하나 이상의 브러사이트, 옥타칼슘 포스페이트 및/또는 인회석으로부터 선택된다. 제 1 및 제 2 층 및 상기 하나 이상의 부가 층은 바람직하게 일체로 형성되며, 인접층은 바람직하게 경계 확산층을 통하여 상호 결합하고, 이는 전형적으로 액상 공합성에 의해 형성된다. 일반적으로, 적어도 하나의 상기 부가 층은 다공성이다.
본 발명의 제 2 관점에 따른 다공성 물질 내에서의 매크로포어 사이즈 범위(포어 직경)는 부가 층에 대해서도 적용될 수 있다. 평균 종횡비 범위, 공극 크기 분포, 공극률 및 오픈-셀 공극 백분률에 대하여도 동일하다.
인접층 사이의 공극 크기에 있어서의 편차는 +/- 1000 마이크론 정도로 거의 무시할 만하다.
다른 언급이 없다면, 이하의 기재는 본 발명의 범주 내에서 임의의 다른 실시에도 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 물질은 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸은 가교될 수 있다. 콜라겐은 물질 내에 바람직하게, 1 내지 99 wt%, 더 바람직하게 5 내지 90 wt%, 더욱 더 바람직하게 15 내지 60 wt%의 량으로 존재한다.
글리코스아미노글리칸은 물질 내에 바람직하게, 0.01 내지 20 wt%, 더욱 바람직하게 1 내지 12 wt%, 더욱 더 바람직하게 1 내지 5.5 wt%의 량으로 존재한다.
본 발명에 따른 물질이 브러사이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 브러사이트의 중량비는 바람직하게, 10:1 내지 1:100, 더욱 바람직하게 5:1 내지 1:20의 중량비가 된다.
본 발명에 따른 물질이 옥타칼슘 포스페이트를 포함하는 경우, 콜라겐 대 옥타칼슘 포스페이트의 중량비가, 바람직하게 10:1 내지 1:100, 더욱 바람직하게 5:1 내지 1:20의 중량비이다.
콜라겐 대 글리코스아미노글리칸의 중량비는 바람직하게 8:1 내지 30:1의 중량비이다.
본 발명에 따른 생체 적합 물질은 뼈 대체물 또는 치과 재료로 사용될 수 있다. 따라서, 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재한 바와 같은 생체 적합 물질을 포함하는 합성 뼈 재료, 뼈 임플란트, 뼈 이식편, 뼈 대체 재료, 뼈 스캐폴드, 충전재, 코팅재 또는 시멘트를 제공한다.
생체 적합 물질은 유용하게 다중-적층된 스캐폴드 형태로 제공된다. 특히, 본 발명은 근골격 및 치과적 용도를 위한 조직 재생 스캐폴드를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 다층(즉, 둘 이상의 층) 스캐폴드는 예컨대, 뼈/연골 경계면(예컨대, 관절 접합), 뼈/힘줄 경계면(예컨대, 힘줄 삽입 포인트), 뼈/인대 경계면(예컨대, 인대 삽입 포인트), 및 치아/인대 경계면(예컨대, 치아/치주 인대 접합물)의 용도로 사용될 수 있다.
본 발명은 주로 조직 공학적 용도를 위한 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 물질은 상당기간 신체에서 견딜 수 있는 임플란트 제조에 사용될 수 있다. 예컨대, 반영구 임플란트는 힘줄 및 인대 용도로 필요할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재한 바와 같은 방법에 의해 얻어질 수 있는 다공성 생체 적합 복합 물질을 제공한다.
합성 방법
이하에서 본 발명을 실시예를 참고로 기재한다. 바람직한 합성법은 순차적인 단계들을 포함하며, 바람직하게 적어도 하나의 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함하는 하나 이상의 층을 가지는 다공성 스캐폴드를 제조하기 위하여, 전체 또는 부분적으로 적용될 수 있다.
단계 0: 슬러리 제조
미네랄화된 콜라겐/GAG/브러사이트 슬러리 또는 슬러리들은 본 출원인의 선행 국제특허출원, PCT/GB04/004550호(2004년 10월 28일자 출원)에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 국제출원 PCT/GB04/004550호는 본 발명의 참고문헌으로서, 본 명세서에 이를 첨부한다.
미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 슬러리 또는 슬러리들의 제조는 참고문헌[Yannas 등, 1989; O'Brien 등, 2004; O'Brien 등, 2005); Loree 등, (1989)]에 기재된 방법에 따라 얻어질 수 있다.
선택적으로 성장 인자, 유전자, 약물 또는 다른 생리적 활성종이 단독 또는 혼합되어 슬러리에 가해지며, 스캐폴드로의 혼합을 촉진하기 위한 기계적 혼합이 이용된다. 이 경우, 스캐폴드가 하나 이상의 층을 가지는 경우, 한 층에 가해지는 생리적 활성종과 다음 층에 가해지는 활성종이 동일할 필요는 없다.
단계 I: 캐스팅
단계 I-a: 제 1 층 캐스팅
단계 I-b: 제 2 층 캐스팅
단계 I-c: 제 3 층 캐스팅
단계 I-n: 제 n 층 캐스팅
캐스팅 단계는 용액, 현탁액, 콜로이드 또는 분산액 형태로, 슬러리 또는 슬러리들의 연속적인 디포지션을 수반하며, 물이 모울드로의 주요 희석제이고, 적어도 하나의 슬러리가 콜라겐, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 브러사이트의 삼성분 공침물을 포함하며, 모든 슬러리들이 콜라겐을 포함한다. 모울드는 임의의 바람직한 형상을 가지며, 폴리머 (예컨대, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티타늄, 크롬 코발트) 또는 세라믹(예컨대, 알루미나, 지르코니아), 유리 세라믹, 또는 유리(예컨대, 보로실리케이트 글래스)를 포함하는 물질들 중 임의의 물질들로 제조될 수 있다. 구체적으로 층의 제조를 촉진하기 위한 모울드가 제조될 수 있다. 적합한 디자인의 예가 제 1 도 및 제 2 도에 도시되어 있다. 층은 예컨대, 수직(즉, 다른 층의 위에 적층), 수평(즉, 다른 층의 옆에 적층), 및/또는 방사상(다음 층 정상 위의 구상 층)으로 위치할 수 있다.
스캐폴드가 하나의 층을 포함하는 경우, 캐스팅되는 단일층은 콜라겐, 바람직하게 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 공침물 슬러리를 포함한다. 바람직하게, 슬러리는 콜라겐, 브러사이트 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물을 포함한다. 바람직한 층 두께는 표 1에 기재되어 있다.
스캐폴드가 두 층을 포함하는 경우, 캐스팅되는 적어도 하나의 층은 콜라겐, 바람직하게 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 공침물 슬러리를 포함한다. 바람직하게는, 슬러리가 콜라겐, 브러사이트, 및 글리코스아미노글리칸을 포함하는 삼성분 공침물을 포함한다. 이러한 층의 바람직한 두께는 표 1에 나타나 있다. 다른 층은 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 슬러리를 포함한다. 이러한 슬러리 조성물은 바람직하게 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 콜라겐 및 브러사이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 바람직하게는 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다.
상기한 바와 같이, 부가 층이 포함될 수 있으며, 이러한 부가 층들은 콜라겐, 선택적으로 칼슘 포스페이트 물질, 및 선택적으로 글리코스아미노글리칸을 포함하는 슬러리로부터 형성된다. 추가의 슬러리 조성물은 바람직하게 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸의 공침물, 콜라겐 및 브러사이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질의 공침물, 또는 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 바람직하게는 브러사이트인 칼슘 포스페이트 물질의 삼성분 공침물을 포함한다.
각 인접층들 내의 슬러리 조성은 동일하거나 약간 다르거나 상당히 다를 수 있다. 각 층에 콜라겐 및 바람직하게는 글리코스아미노글리칸이 존재하고, 적어도 하나의 층이 예컨대, 브러사이트와 같은 칼슘 포스페이트 물질을 포함한다.
단계 II: 경계 확산
공-확산 단계는 캐스트, 적층 슬러리의 각 층이 경계 확산하도록 한다. 이 단계는 인접층 사이의 슬러리 성분을 경계-확산시키기 위하여 행해지며, 따라서 고화 및 승화 후 경계층의 결합 강도를 증가시킨다. 경계-확산 단계의 바람직한 조건이 표에 기재되어 있다.
*단계 III: 제어 냉각
제어 냉각 단계는 슬러리를 포함하는 모울드를 0℃의 온도 이하의 최종 온도까지 제어 속도로 냉각시키는 환경으로 하는 것을 수반한다. 이러한 단계는 슬러리 내의 핵화 및 성장을 개시하고 속도를 제어함으로써 수행된다. 순차적으로 얼음 결정은 승화에 의해 제거되어 다공성 스캐폴드를 남기게 된다. 얼음 결정 네트워크의 설계는 궁극적인 스캐폴드의 공극 구조를 결정하게 된다. 냉각에 대한 바람직한 파라미터는 표3에 나열되어 있다.
단계 IV: 어닐링
어닐링 단계는 슬러리를 제어 냉각 단계의 최종 온도에서 소정의 시간 동안 방치하는 것을 포함한다. 이러한 단계는 슬러리를 완전히 또는 실질적으로 완전히 동결시키게 된다. 어닐링에 대한 바람직한 파라미터는 표4에 나열되어 있다.
단계 V: 승화
승화 단계는 동결 슬러리가 대략 제어 냉각 및 어닐링 단계의 최종 온도로 유지되는 동안, 모울드 및 동결 슬러리 주변 환경의 압력을 물/얼음/수증기의 삼중점 미만으로 감소시키고, 얻어진 진공 압력에서 고체-증기 전이 온도더욱 더 높은 온도(전형적으로 ≥ 0℃의 온도)로 온도를 상승시키는 것을 포함한다. 이 단계는 승화에 의해 동결 슬러리로부터 얼음 결정을 제거하기 위하여 수행된다. 물을 제거하는 방법에 있어, 증발에 비하여 승화는 사전에 미리 존재하는 얼음 결정의 네트워크 설계를 정확하게 모방하는 빈 공간(즉, 공극)의 네트워크를 남기는 장점이 있다. 얼음이 용융될 수 있으면, 얼음 결정 네트워크는 그 형상을 잃게 되며, 공극 네트워크는 그 형상을 잃게 되고, 생성되는 공극 네트워크의 설계는 절충되게 된다. 승화 단계에 대한 바람직한 파라미터는 표5에 나열되어 있다.
단계 V + I: 가교
필요한 경우, 방법은 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸를 가교시키기 위하여 가교단계를 수반할 수 있다. 이에 관하여는 상기 본 출원인의 선행 국제 출원 PCT/GB04/004550(2004년 10월 28일 출원)에 기재되어 있다. 국제 출원 PCT/GB04/004550의 기재 내용은 본 출원의 참고문헌으로서, 본 명세서에 이를 첨부한다.
실시예 I: 콜라겐/GAG/CaP의 단일-층 스캐폴드
재료
콜라겐: 소 힘줄로부터 추출된 미세섬유 콜라겐, 타입 I, 인테그라 라이프 사이언스 플레인스보로[Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA].
GAG: 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 [Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)].
칼슘원: 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
가교제: (i) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (=EDAC); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) N-히드록시숙신이미드 (=NHS); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA).
절차
단계 0: 슬러리 제조
3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 H3PO4 14.3mL에 분산되어 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다. 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물 슬러리를 생성하였으며, 이때 삼성분 공침물 슬러리의 pH는 약 4.0이었다. 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 25℃에서 48시간 동안 교반기에서 혼합시키면서 유지하고, 4℃에서 12시간 동안 유지하였다. 냉각된 슬러리를 25 Pa 압력에서 25시간 동안 진공 플라스크 내에서 탈기시켰다.
단계 1 : 캐스팅
자동 적정기를 사용하여 15mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 50mm 길이, 30mm 폭, 및 50mm 깊이의 폴리술폰 모울드내로 캐스팅하였다. 핸드 피펫을 사용하여 슬러리로부터 큰 버블을 모두 제거하였다.
*단계 II: 경계-확산
실시예 I의 스캐폴드는 하나의 층만을 포함하기 때문에, 경계-확산 단계는 불필요하다.
단계 III: 제어 냉각
모울드 및 슬러리를 온도 제어 강철 쉘프가 장착된 온도-제어 버티스 동결 건조기(VirTis Genesis 동결 건조기)에 위치시키고 동결 건조기의 쉘프 온도를 약 2.4℃/분의 속도로, 4℃에서 -20℃의 온도가 되도록 온도를 낮추었다.
단계 IV: 어닐링
동결 건조기의 쉘프 온도를 -2O℃의 온도에서 10 시간 동안 유지하였다.
단계 V: 승화
쉘프 온도가 아직 -20℃의 온도일 때, 모울드 및 (현재 동결된) 슬러리를 포함하는 챔버에 25Pa 미만의 진공(약 200mTorr)을 적용하였다. 챔버 온도를 37℃의 온도로 올리고, 36 시간 동안 연속적으로 승화가 일어나도록 하였다. 그 후, 진공을 제거하고, 온도를 다시 실온으로 상승시켜 50mm X 30mm X 10mm 크기의 콜라겐/GAG/CaP의 단층 스캐폴드가 남도록 하였다.
단계 V + I: 가교
스캐폴드를 40mL의 탈이온수로 20분 동안 수화시켰다. 20mL의 0.035M EDAC 및 0.014M NHS 용액을 삼성분 공침물 및 탈이온수를 함유하는 컨테이너에 첨가하고, 삼성분 공침물을 2시간 동안 실온에서 부드러운 교반하에 가교시켰다. EDAC 용액을 제거하고, 스캐폴드를 포스페이트 완충 용액(PBS)으로 세정하고, 새로운 PBS에서 가벼운 교반하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 스캐폴드를 약 2.4℃의 온도/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각시키고, -20℃의 온도에서 약 5 시간동안 어닐링한 후, 25Pa 미만 및 37℃의 온도에서 승화시킴으로써, 동결 건조시켜 물을 제거하여, 대략 50mm X 30 mm X 10mm 크기의 가교된 콜라겐/GAG/CaP 스캐폴드를 생성하였다.
생성된 단층 스캐폴드의 X-선 단층 촬영 이미지, SEM(scanning electron microscope)이미지, 이온 분포도 및 기계적 압축 특성은 도 3 내지 10에 도시하였다. 도 3은 X-선 단층 촬영에 의해 나타난 것으로, 상기 공정에 의해 제조된 스캐폴드의 9.5mm x 9.5mm 원통부의 프로파일을 나타낸다. 전체 스캐폴드의 물질 조성 및 공극률은 실질적으로 균일함을 알 수 있다. 동일한 스캐폴드의 연속 단면이 도 4에 도시되어 있으며, 스캐폴드 공극 구조가 균일한 특성을 나타내고 있고, 고도의 공극 경계 연접성, 균분 공극 형태 및 큰 (500 마이크론의 평균 직경) 매크로포어 사이즈를 입증하고 있다. 도 5의 SEM 마이크로그래프도 매크로포어 형태를 잘 나타내고 있으며, 특정 매크로포어의 벽에서 볼 수 있는 한정된 미세 공극률을 보여주고 있다. 스캐폴드 벽 부분의 고배율(400Ox), 2차(즉, X-단층촬영 반응), 및 후방 산란(즉, 조성-반응) 전자 이미지(도 6)는 약 1-2 마이크론 크기의 작은 마디가 돌출되는 형태의 한정된 형태적 변이가 존재하긴 하지만, 스캐폴드 벽의 조성이 균일함을 증명하고 있다. 도 7에 도시한 인 및 칼슘 분포도는 전체 스캐폴드를 통해 두원소가 균일하게 분포되는 것을 통하여 스캐폴드 전체가 실질적으로 조성에 있어 동일성을 가지고 있다는 결론에 이를 수 있다. 도 8은 건조 상태의 단층 스캐폴드를 나타내고 있으며, 스캐펠, 면도날 및 관상톱날(각막 이식에 사용되는 원형 절단 수단)과 같은 통상의 외과 수단을 사용하여 부스러짐, 갈라짐 또는 일체성이 상실되지 않고 바람직한 형성으로 절단될 수 있다는 것을 나타내고 있으며, 도 8은 또한 고체-스틸 볼-베어링의 중량하에서 그 중량을 견딜 수 있는 건조 단층 스캐폴드의 체중 부하능(weight bearing capacity)을 나타내고 있다. 도 9는 건조 상태의 단층 스캐폴드의 양상을 나타내고 있다. 이러한 양상은 762+/-188kPa의 탄성률 및 85.2+/-11.7kPa의 압축 항복 강도를 가지는 다공성 고체의 전형적인 3 단계 변형을 나타낸다. 이러한 건조 스캐폴드의 항복 강도는 스캐폴드가 강한 고정 압력이 적용되는 경우(예컨대, 임플란트의 형상을 외과적으로 수정하는 경우), 영구적으로 변형되지 않고 (예컨대, 결함 사이트로의 삽입 중) 견고한 엄지 손가락 압력(firm thumb pressure)을 견딜 수 있게 한다. 도 10에는 가수분해 단계에서의 단층 스캐폴드의 압축 변형이 도시되어 있다. 건조단계에서, 가수분해된 미네랄화 콜라겐/GAG 스캐폴드는 압축 로딩(loading)하에서 3 단계 기계적 양상을 나타내지만, 건조 스캐폴드의 해당 특성보다 대략 낮은 정도의 압축탄성률(4.12+/-0.76kPa) 및 항복강도(0.29+/-0.1IkPa)를 갖는다. 또한, 붕괴 평탄역에서, 압축 스트레스의 해제에 따라 점탄성 변형 회복이 관찰되었다.
실시예 II: 2층 미네랄화/미네랄화되지 않은 스캐폴드
재료
콜라겐 (미네랄화된 슬러리용) : 인소 힘줄로부터 추출된 타입 I 미세섬유 콜라겐, 테그라 라이프 사이언스 플레인스보로[Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA].
GAG (미네랄화된 슬러리용) : 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 [Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)].
타입 II 콜라겐
+ GAG (미네랄화되지 않은 슬러리용) : 돼지 연골로부터 용해된 타입 II 콜라겐 및 GAG (콜라겐/GAG) 슬러리, 겔스리치 바이오머티리얼스[Gelstlich Biomaterials, (Wolhusen, Switzerland)].
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA).
인 소스: 오르쏘인산(H3PO4), BDH 래버러토리 서플라이스 (BDH Laboratory Supplies, Poole, United Kingdom).
가교제: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (=EDAC); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 N-히드록시숙신이미드 (=NHS); 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA).
단계 0: 슬러리 제조
미네랄화된 슬러리 제조
3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 H3PO4 14.3mL에 분산되어 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다. 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물 슬러리를 생성하였으며, 이때 삼성분 공침물 슬러리의 pH는 약 4.0였다. 냉각된 슬러리를 25 Pa 압력에서 25시간 동안 진공 플라스크내에서 탈기시켰다.
미네랄화되지 않은 슬러리 제조
타입 II 콜라겐/GAG 슬러리를 냉장고로부터 제거하고 실온으로 온도를 회복시킨다.
단계 I: 캐스팅
*2.5mL의 미네랄화되지 않은 타입 II 콜라겐/GAG 슬러리를 바닥부가 50mm 길이, 30mm 폭, 및 2mm 깊이의 혼합 폴리술폰 모울드의 바닥부에 캐스팅하였다. 슬러리를 면도날(razor blade)을 사용하여 표면을 매끄럽게 하였다. 폴리술폰으로 만들어지고, 50mm 길이, 30mm 폭, 및 6mm 깊이의 상부 컬러를 매끄러운 미네랄화되지 않은 슬러리를 포함하는 모울드의 바닥부에 부착시켰다. 9mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 동일하게 배치하는 방식으로, 매끄러운, 미네랄화되지 않은 층 위, 미리 비워둔 상부 컬러에 위치시켰다. 핸드 피펫을 사용하여 슬러리로부터 큰 버블을 모두 제거하였다.
단계 II: 경계-확산
적층된 슬러리를 동결 건조기에 위치시키기 전에, 실온 및 대기압에서 전체 4시간 동안 유지하였다.
단계 III: 제어 냉각
모울드 및 슬러리를 (온도 제어 강철 쉘프가 장착된 온도-제어) 버티스 동결 건조기 (VirTis Genesis freeze dryer)에 위치시키고 동결 건조기의 쉘프 온도를 4℃에서 -20℃의 온도까지, 약 2.4℃/분의 속도로, 온도를 낮추었다.
단계 IV: 어닐링
동결 건조기의 쉘프 온도를 -2O℃의 온도에서 10 시간 동안 유지하였다.
단계 V: 승화
쉘프 온도는 -40℃를 유지하면서, 모울드 및 (현재 동결된) 슬러리를 포함하는 챔버에 25Pa 미만의 진공(약 200mTorr)을 적용하였다. 챔버 온도를 37℃까지 올리고, 36 시간 동안 연속적으로 승화가 일어나도록 하였다. 그 후, 진공을 제거하고, 온도를 다시 실온으로 상승시켜, 크기가 50mm X 30mm X 10mm이고, 2mm 두께의 미네랄화되지 않은 층과 6mm 두께의 미네랄화된 층으로 이루어진 2층 스캐폴드를 얻었다.
단계 V + I: 가교
스캐폴드를 32mL의 탈이온수로 20분 동안 수화시켰다. 18mL의 0.035M EDAC 및 0.014M NHS 용액을 스캐폴드 및 탈이온수를 함유하는 컨테이너에 첨가하고, 스캐폴드를 2시간 동안 실온에서 부드러운 교반하에 가교시켰다. EDAC 용액을 제거하고, 스캐폴드를 포스페이트 완충 용액(PBS)으로 세정하고, 새로운 PBS에서 가벼운 교반하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 스캐폴드를 약 -2.4℃/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각하고, -20℃의 온도에서 5 시간 동안 어닐링한 후, 25Pa 미만의 압력 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 승화시키도록 동결 건조 시킴으로써, 물을 제거하여, 대략 50mm X 30 mm X 8mm 크기의 미네랄화되지 않은 층과 미네랄화된 층으로 이루어진 2층 스캐폴드를 생성하였다.
생성된 단층 스캐폴드의 X-선 단층 촬영 이미지, SEM 이미지, 및 이온 분포도를 도 11 내지 17에 도시하였다. 상기 공정에 의해 제조된 2층 스캐폴드의 9.5mm x 9.5mm 원통부의 X-선 단층 촬영 이미지가 도 11에 도시되어 있다. 아래쪽 불투명한 영역은 미네랄화된 층을 나타내며, 위쪽 투명한 영역은 미네랄화되지 않은 층을 나타낸다. 두 층 모두 조성 및 공극에 있어 매우 균일함을 알 수 있다. 도 12에 도시된 연속 단면은 평균 매크로포어 크기를 나타내고 있는데, 미네랄화되지 않은 층이 700 마이크론 단위인데 반하여 미네랄화된 층은 약 400 마이크론 정도이며, 두 층 모두 균분 공극 형태를 나타내었다. 도 13의 SEM 이미지는 미네랄화되지 않은 층의 정상도를 나타내는 데, 미세 공극성의 흔적이 약간 나타나는 데 반하여, 도 14에서는 임의의 큰 공간이나 미네랄화되거나 미네랄화되지 않은 층을 구별하는 비연속성이 없음을 볼 수 있다.
도 15는 2층 압축 로딩하에서, 2층 스캐폴드의 양상을 나타내고 있다. 압축 로드를 적용할 때, 미네랄화된 스캐폴드에서는 임의의 충분한 변형을 유도하기에 불충분한 응력에서, 순응적인 미네랄화되지 않은 층은 압축되기 시작하여 연골 부분의 거의 완전한 컴팩션이 일어난다. 로딩이 해제된 후, 미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 층은 거의 즉시 원래의 형상으로 되돌아간다(도 15d). 도 16 은 수화 상태의 2층 스캐폴드의 역학적 양상을 나타내고 있다. 일단 수화되면, 미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 층은 낮은 규모의 하중하에서 압축될 수 있다(도 16a-c). 건조상태와 달리, 수화된 미네랄화되지 않은 부분은 제 1 압축 하중 적용 후, 원래 두께로 완전히 회복되지 않지만(도 16d), 대신 미네랄화된 부분의 단면에 걸쳐 드리워져 있다. 그러나, 이러한 초기 압축 후의 각 후속 압축 하중 적용 후에는 미네랄화되지 않은 층이 그 압축 두께를 회복한다(도 16d). 도 17에는 관절 접합부 내의 뼈 및 연골 경계면을 둘러싸는 외과적 결함의 벽에 부착되는 2층 스캐폴드의 미네랄화되지 않은 층을 유추하여 도시하였다. 도 17에서의 유리 슬라이드는 뼈 연골 결함의 벽과 유사하며, 미네랄화되지 않은 층의 이 표면에의 부착력은 스캐폴드가 이러한 결함을 스캐폴드 및 인접 관절 연골의 미네랄화되지 않은 층 사이에 갭이 지속되지 않고 그 주변으로 채우는 능력을 나타낸다.
실시예 III: 3층 미네랄화-비미네랄화-미네랄화 스캐폴드
재료
콜라겐(미네랄화된 슬러리용): 소 힘줄로부터 추출된 미세섬유 콜라겐, 타입 I, 인테그라 라이프 사이언스 플레인스보로[Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA].
GAG(미네랄화된 슬러리용): 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 [Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)].
칼슘원: (i) 수산화칼슘; Ca(OH)2 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA), 및 (ii) 칼슘 니트레이트; Ca(NO3)2.2H2O; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
인 소스: 오르쏘인산; H3PO4; BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom)
콜라겐(미네랄화되지 않은 콜라겐-GAG 슬러리용): 돼지 피부로부터의 펩신-용해된 콜라겐; 85% 타입 I, 15% 타입 III; 재팬 미트 팩커스(Japan Meat Packers, Osaka, Japan)
GAG(미네랄화되지 않은 슬러리용): 상어 연골로부터의 콘드로이틴-6-설페이트; 나트륨 염; 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
희석제(미네랄화되지 않은 콜라겐 및 GAG용): 빙초산 (CH3COOH), 피셔 사이언티픽[Fiher Scientific, Loughborough, UK)
가교제: 노르디히드로구아리아레인산(NDGA), 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA);이수소인산나트륨(NaH2PO4), BDH 래버러토리 서플라이스 (Poole, United Kingdom), 염화나트륨(NaCl), 시그마-알드리치 인크 (St. Louis, MO, USA)
절차
단계 0: 슬러리의 제조
미네랄화된 슬러리 제조
3.8644g의 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.3436g의 GAG가 실온에서 0.1383M의 H3PO4 14.3mL에 분산되어 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다. 혼합한 지 90분 후, 1.804g의 Ca(OH2) 및 0.780g의 Ca(NO3)2.4H2O를 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액에 30분 동안 15,000rpm에서 일정하게 혼합시키며 첨가하여 콜라겐/GAG/CaP 삼성분 공침물 슬러리를 생성하였으며, 이때 삼성분 공침물 슬러리의 pH는 약 4.0이었다. 이후, 냉각된 슬러리를 25 Pa 압력에서 25시간 동안 진공 플라스크내에서 탈기시키고, 균질화장치를 이용하여 30분 동안 재혼합한 후, 48시간 동안 다시 탈기시켰다.
미네랄화되지 않은 슬러리 제조
1.9322g의 타입 I/III 콜라겐을 얼음조에서 냉각된 171.4mL의 0.1383M H3PO4에 분산시키고, 직경이 19mm인 고정자가 구비된 균질화기를 이용하여 15,000rpm에서 90분 동안 혼합하여 고도로 점성인 콜라겐 분산액을 생성하였다. 동시에, 콘드로이틴-6-설페이트(GAG)를 분산시키기 위해 주기적으로 진탕시켜, 0.1718g의 GAG를 실온에서 0.05M의 초산 28.6mL에 용해시켜 GAG 용액을 생성하였다. 90분 후, 14.3mL의 GAG 용액을 혼합된 콜라겐 분산액에 약 0.5mL/분의 속도로 15,000rpm에서 연속하여 균질화시키며 첨가하고, 생성된 고도로 점성인 콜라겐/GAG 분산액을 총 90분 동안 혼합하였다.
단계 I: 캐스팅
3.5mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 바닥부가 50mm 길이, 30mm 폭, 및 3mm 깊이의 혼합 폴리술폰 모울드의 바닥부에 캐스팅하였다. 슬러리를 면도날(razor blade)을 사용하여 평편한 표면을 매끄럽게 하였다. 폴리술폰으로 만들어지고, 50mm 길이, 30mm 폭, 및 5mm 깊이인 중간 컬러를 매끄러운 미네랄화된 슬러리를 포함하는 모울드의 바닥부에 부착시켰다. 7.5mL의 미네랄화되지 않은 콜라겐/GAG 슬러리를 동일하게 배치하는 방식으로, 매끄러운, 미네랄화되지 않은 층 위, 미리 비워둔 중간 컬러에 위치시켰다. 또한, 폴리술폰으로 만들어지고, 50mm 길이, 30mm 폭, 및 3mm 깊이인 상부 컬러를 매끄러운 미네랄화되지 않은 슬러리 위, 모울드의 중간부에 부착시켰다. 3.5mL의 미네랄화된 콜라겐/GAG/CaP 슬러리를 동일하게 배치하는 방식으로, 매끄러운, 미네랄화되지 않은 층 위, 미리 비워둔 상부 컬러에 위치시켰다. 핸드 피펫을 사용하여 슬러리로부터 큰 버블을 모두 제거하였다.
단계 II: 경계-확산
3층 슬러리를 동결 건조기에 위치시키기 전에, 실온 및 대기압에서 20분 동안 유지하였다.
단계 III: 제어 냉각
모울드 및 3층 슬러리를 (온도 제어 강철 쉘프가 장착된 온도-제어) 버티스 동결 건조기(VirTis Genesis freeze dryer)에 위치시키고 동결 건조기의 쉘프 온도를 4℃에서 -40℃까지, 약 -2.4℃/분의 속도로, 온도를 낮추었다.
단계 IV: 어닐링
동결 건조기의 쉘프 온도를 -40℃의 온도로 10 시간 동안 유지하였다.
단계 V: 승화
쉘프 온도는 -40℃를 유지하면서, 모울드 및 (현재 동결된) 슬러리를 포함하는 챔버에 25Pa 미만의 진공(약 200mTorr)을 적용하였다. 챔버 온도를 37℃까지 올리고, 36 시간 동안 연속적으로 승화가 일어나도록 하였다. 그 후, 진공을 제거하고, 온도를 다시 실온으로 상승시켜, 크기가 50mm X 30mm X 11mm이고, 5mm 두께의 미네랄화되지 않은 중간층과 이를 둘러싼 3mm 두께의 두 미네랄화된 층으로 이루어진 3층 스캐폴드를 생성하였다.
단계 V + I: 가교
스캐폴드를 인산염 완충 식염수내의 0.1M NaH2PO4 및 0.15M NaCl(PBS; pH 7.0)에서 30분 동안 수화시켰다. NDGA를 1N NaOH에 현탁시키고, PBS에 가해, 3mg/mL의 PBS 내 NGDA용액을 제조하며; 스캐폴드를 이 용액내에서 24시간 동안 교반하에 수화시켰다. 3층 스캐폴드를 NGDA-PBS 용액으로부터 제거하고, 탈이온수로 세정하였다. 스캐폴드를 약 2.4℃/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각하고, -20℃의 온도에서 5 시간 동안 어닐링한 후, 25Pa 미만의 압력 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 승화시키도록 동결 건조시킴으로써, 건조 가교 스캐폴드를 얻었다. 후처리는 0.1mg/mL NDGA의 농도에서 행해졌다. 이 후, 스캐폴드를 70% 에탄올로 6 시간에 걸쳐 세정하고, 이어서 24 시간 in PBS내에서 24시간 동안 실온에서 세정하였다. 스캐폴드를 약 2.4℃/분의 속도로 실온에서 -20℃의 온도까지 제어 냉각하고, -20℃의 온도에서 5 시간 동안 어닐링한 후, 최종적으로 25Pa 미만의 압력 및 37℃의 온도에서 24시간 동안 승화시켜 잔존하는 물을 제거하도록 2차 동결 건조시켰다.
하기 표의 파라미터들은 다른 언급이 없는 한, 본 발명의 범주내에서 단독으로 또는 조합하여 다양하게 적용될 수 있다.
표 1: 캐스팅에 바람직한 파라미터
제어 냉각의 개시 온도 바람직함 0 내지 37℃
보다 바람직함 2 내지 37℃
가장 바람직함 4 내지 37℃
층두께 바람직함 0.1 내지 500mm
보다 바람직함 0.5 내지 20mm
가장 바람직함 1.0 내지 10mm
슬러리 점성도 바람직함 0.1 내지 50 Pa·s
보다 바람직함 0.1 내지 10 Pa·s
가장 바람직함 0.1 내지 5 Pa·s
모울드 벽 두께 바람직함 1 내지 50mm
보다 바람직함 5 내지 20mm
가장 바람직함 5 내지 15mm
층 수 바람직함 1 내지 50
보다 바람직함 1 내지 5
가장 바람직함 1 내지 3
표 2: 경계-확산에 바람직한 파라미터
경계확산에 허용되는 시간 바람직함 0 내지 24시간
보다 바람직함 0 내지 6시간
가장 바람직함 0 내지 2시간
온도 바람직함 2 내지 40℃
보다 바람직함 4 내지 37℃
가장 바람직함 20 내지 37℃
압력 바람직함 1 내지 200 kPa
보다 바람직함 50 내지 150 kPa
가장 바람직함 50-101.325 kPa
표 3: 제어-냉각에 바람직한 파라미터
냉각 속도 바람직함 0.02 내지 10.0℃/분
보다 바람직함 0.02 내지 6.0℃/분
가장 바람직함 0.2 내지 2.7℃/분
최종 냉각 온도 바람직함 -100 내지 0℃
보다 바람직함 -80 내지 -10℃
가장 바람직함 -40 내지 -20℃
표 4: 어닐링에 바람직한 파라미터
어닐링 온도 바람직함 -100 내지 0℃
보다 바람직함 -80 내지 -10℃
가장 바람직함 -40 내지 -20℃
어닐링 시간 바람직함 0 내지 48시간
보다 바람직함 2 내지 12시간
가장 바람직함 8 내지 10시간
표 5: 승화에 바람직한 파라미터
승화 압력 바람직함 0 내지 0.08 kPa
보다 바람직함 0.0025 내지 0.08 kPa
가장 바람직함 0.0025 내지 0.04 kPa
승화 시간 바람직함 0 내지 120시간
보다 바람직함 12 내지 72시간
가장 바람직함 24 내지 36시간
승화 온도 바람직함 -10 내지 -60℃
보다 바람직함 0 내지 40℃
가장 바람직함 20 내지 37℃
참고문헌
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- 주사제용 칼슘 포스페이트 및 하이알루로난 스폰지의 조직-공학적 2-상 복합 물질에 의한 뼈 연골 결함의 치유[Gao J, Dennis JE, Solchaga LA, Goldberg VM, Caplan AI. 2002. 치유 of Osteochondral Defect with Tissue-Engineered Two-Phase Composite Material of Injectable Calcium Phosphate and Hyaluronan Sponge. Tissue Engineering 8:827-837].
- 관절 연골 치유를 위한 자동 성형 뼈 연골 구조물[Hung CT, Lima EG, Mauck RL, Taki E, LeRoux MA, Lu HH, Stark RG, Guo XE, Ateshian GA. 2003. Anatomically Shaped Osteochondral Constructs for Articular Cartilage 치유. Journal of Biomechanics 36:1853-1864].
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- 염소의 병적 뼈 연골 결함의 치유를 위한 다상 임플란트의 평가[Niederauer GG, Slivka MA, Leatherbury NC, Korvick DL, H. H. HJ, Ehler WC, Dunn CJ, Kieswetter K. 2000. Evaluation of Multiphase Implants for 치유 of Focal Osteochondral Defects in Goats. Biomaterials 21:2561-2574].
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- 콜라겐-GAG 스캐폴드에서의 세포 접착에 대한 공극 크기 및 구조의 영향[O'Brien FJ, Harley BA, Yannas IV, Gibson LJ. 2005. The Effect of Pore Size and Structure on Cell Adhesion in Collagen-GAG Scaffolds. Biomaterials 26:433-441].
- 말초 신경 재생을 위하여 동결-건조에 의한 폴리머 브리지의 제조방법[HM Loree, IV Yannas, B Mikic, AS Chang, SM Perutz, TV Norregaard, and C Kararup, ‘A freeze-drying process for fabrication of polymeric bridges for peripheral nerve regeneration’Proc. 15th Annual Northeast Bioeng. Conf. P.53-54, 1989].
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- 관절 연골 치유를 위한 3차원 뼈 연골 복합 스캐폴드[Sherwood JK, Riley SL, Palazzolo R, Brown SC, Monkhouse DC, Coates M, Griffith LG, Landeen LK, Ratcliffe A. 2002. A Three-Dimensipnal Osteochondral Composite Scaffold for Articular Cartilage 치유 Biomaterials 23:4739-4751].
- 성숙 포유동물 피부를 부분적으로 재생케 하는 모델 세포외 기질의 합성 및 특성화[Yannas IV, Lee E, Orgill DP, Skrabut EM, Murphy GF. 1989. Synthesis and Characterization of a 모델 Extracellular Matrix that Induces Partial Regeneration of Adult Mammalian Skin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86:933-937].
본 발명은 다양한 용도에 적용될 수 있으며, 그 예로써 이하의 실시예를 제공한다.
관절 연골 치유 제품: 2층 스캐폴드
2층 스캐폴드는 뼈 골수 유래 줄기 세포가 관절- 연골 상처 부위로 뼈 골수 유래 줄기 세포를 모이게 하는 현존하는 최일선의 외과 과정에 있어서 효율성을 증진시킬 수 있다.
예컨대, 건조, 진공-팩, 감마 살균된 스티로폼 유사 물질의 건조, 2cm x 2cm x lcm 블록과 같이 전달될 때, 이러한 스캐폴드는 스캐펠 또는 다른 수단을 사용하여 절단될 수 있고, 엄지 손가락- 또는 무딘-도구 압력만을 사용하여 쉽게 결함에 삽입될 수 있고, 봉합 또는 접합 없이도 부위에 직접 결합될 수 있다.
슬개골 인대 제공 부위 치유 제품: 3층 스캐폴드
3층 스캐폴는, 전 십자인대 인대(ACL) 재생 중, 정면 무릅 통증을 완화하고, 슬개골 인대 파열 및 슬개골 골절 위험을 감소시키기 위하여, 슬개골 인대(슬개골 힘줄) 제공 부위에서의 재생을 증진시킬 수 있다.
힘줄 치유 제품: 2층 스캐폴드
연장된 미네랄화되지 않은 성분을 갖는 2층 스캐폴드는 회전 근개 과정 중 힘줄 치유 효과를 개선하고, 현재 효과적인 치유책이 존재하지 않는 소-힘줄에 대한 적용을 유도할 수 있다.
본 발명은 이하의 대규모 동물 시험에 대하여 연구되었으며, 이하에서 이의 개요를 제공한다.
시험 1 : 양 뼈 결함 모델
본 발명에 따라, 한 면은 구조 및 조성이 뼈와 유사한 한편, 다른 면은 미네랄화되지 않은 조직(예컨대, 연골, 인대, 힘줄)이며, 그 사이의 경계면은 매끄럽고 안정된, 적층된 조직 재생 스캐폴드를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라, 이러한 임플란트의 뼈 부분의 미네랄 상의 화학 조성을 체계적으로 변경시킬 수 있다.
- 동물 : 골격이 충분히 성숙한 암컷 텍셀 유럽양(Texcel Continental sheep
결함: 9mm 직경 및 9mm 깊이를 가지는 외측 대퇴 과상 돌기상의 다공성 뼈 결함
- 이식 기간: 6주.
실험 집단: 각 실험군의 6개 임플란트를 동일한 동물의 각 면에 동일한 임플란트 타입으로 반대 측면으로 임플란트하였다.
- 제어 집단:
포지티브 제어: 네 부위를 경골 조면으로부터 얻어진 다공질 자가이식편으로 채워넣었다.
네가티브 제어: 네 부위를 미네랄을 전혀 포함하지 않는 임플란트를 포함하는 제어 임플란트로 채워 넣는다(즉, 뼈 대용물(ChondroMimetic)의 골질면 만의 유기 성분 포함).
- 연구 목적: 임플란트 실험 집단을 화학 조성에 의해 구분된 4개의 실험 집단의 수행에 있어서의 차이를 규명하고, 뼈 대용물의 골질 구획을 위해 한 최종 가장 바람직한 조성물을 규명하고자 함.
- 주요 발견: 3개의 실험 집단은 어떠한 해로운 면역반응도 나타내지 않았으며, 세 실험 집단 및 미네랄화되지 않은 네가티브 제어 집단은 세포 매개 직접 치환 메카니즘을 통해 뼈의 내부 성장을 지지하였으며; 세 임플란트 집단이 관찰된 장소 사이에 통계적으로 유의할만한 차이가 나타나지 않았으며, 세 실험 집단 모두에서 관찰된 뼈 형성이 네가티브 제어 집단에 있어서 보다 통계적으로 유의할 만 할 정도로 높았다.
- 임플란트 디자인을 위한 이식: 본 연구에 의한 직접 치환 시스템은 본 발명에 따른 뼈 형성 메카니즘이, 종래의 뼈-이식편 대용물에서 관찰되는 전형적인 병치 메카니즘 보다, 태아 및 신생 동물(신생아 포함)의 성장판에서 일어나는 모형 뼈 형성에 더욱 더 가깝다는 것을 제시하고 있다. 이러한 미네랄화되지 않은 제어에 있어서의 치환 메카니즘의 존재는 임프란트의 유기 성분이 이러한 특성을 부여한다는 사실을 제시하고 있다.
임플란트에 대한 공극 크기는 임플란트의 골질 구획의 평균 공극 크기를 감소시킴으로써 이러한 치환 메카니즘을 설명하기 위하여 변경될어야 할 것이다.
세 실험 집단의 뼈 형성 양상에 있어서 상당한 차이가 나타나지 않는다는 사실은 공정의 파라미터가 대부분의 임플란트 미네랄 조성물을 규명하는 데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
시험 2: 염소 뼈 연골 결함 모델
연구의 목적은 골수 자극 기술(연골하 드릴링)의 결과를 개선하는 수단으로서 뼈 대용물의 성능을 평가하는 것이다.
- 동물: 골격이 성숙한 수컷 스페인 염소 산양
- 결함: 4mm 직경 및 6mm 깊이를 가지는 뼈 연골 결함(활차 그루우브에 하나; 측면 관절 돌기에 하나).
- 이식 기간: 16주.
- 실험 집단: 기본형이 되는 뼈 대용물의 6개 임플란트.
- 제어 집단: 종래의 연골하 드릴링을 모방한 6개의 결함(즉, 임플란트를 포함하지 않음).
- 연구 목적: 골수 자극을 돕는 보조 수단으로서, 뼈 대용물의 성능 평가
- 주요 발견: 뼈 대용물의 취급 특성에 관하여 외과의사로부터의 피드백은 예외없이 매우 긍정적이었다.

Claims (24)

  1. 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 1 구성성분을 제공하며;
    콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산, 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 액체 담체, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하는 유체 조성물을 제공하며;
    상기 유체 조성물을 상기 제 1 구성성분의 다공성 표면부와 접촉시키며;
    상기 유체 조성물을, 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키며;
    승화 및/또는 증발로 복수의 고체 결정 또는 입자의 일부 또는 전부를 제거함을 포함하여, 복합 바이오물질(composite biomaterial)을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 알부민, 히알루로난, 키토산 및 콜라겐의 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 합성 폴리펩티드 중 하나 이상, 및 임의적으로 무기 물질을 포함하고, 적어도 다공성인 표면부를 갖는 실질적으로 고체인 제 2 구성성분을 제공하며;
    상기 제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 상기 유체 조성물을 삽입하여 유체 조성물을 상기 다공성 표면부와 접촉시키며;
    제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이의 상기 유체 조성물을, 액체 담체가 복수의 고체 결정 또는 입자로 변형되는 온도로 냉각시키며;
    제 1 구성성분과 제 2 구성성분 사이에 중간층을 형성시키기 위하여, 승화 및/또는 증발로 복수의 고체 결정 또는 입자의 일부 또는 전부를 제거함을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 구성성분이 무기 물질을 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 무기 물질이 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 칼슘 포스페이트 물질이 브루샤이트(brushite), 옥타칼슘 포스페이트 및 인회석(apatite) 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분이 콜라겐, 및 임의적으로 글리코사미노글리칸을 포함하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분이 콜라겐과 칼슘 포스페이트 물질의 공침물(co-precipitate)로부터 형성 되는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분이 콜라겐과 글리코사미노글리칸의 공침물로부터 형성되는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 구성성분 및/또는 제 2 구성성분이 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코사미노글리칸의 삼성분 공침물(triple co-precipitate)로부터 형성되는 방법.
  10. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 구성성분이 콜라겐과 글리코사미노글리칸, 및 임의적으로 칼슘 포스페이트 물질을 포함하며, 제 2 구성성분이 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 조성물이 무기 물질을 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 무기 물질이 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 칼슘 포스페이트 물질이 브루샤이트, 옥타칼슘 포스페이트 및 인회석 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 조성물이 콜라겐, 및 임의적으로 글리코사미노글리칸을 포함하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 담체가 물을 포함하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 조성물이 현탁액 형태로 제공되는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 유체 조성물이 콜라겐-계열 현탁액을 포함하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 조성물이 슬러리 형태로 제공되는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 유체 조성물이 콜라겐, 및 임의적으로 글리코사미노글리칸, 및 임의적으로 칼슘 포스페이트 물질을 포함하는 슬러리인 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 유체 조성물이 콜라겐과 글리코사미노글리칸의 공침물을 포함하는 슬러리인 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 유체 조성물이 콜라겐, 칼슘 포스페이트 물질 및 글리코사미노글리칸의 삼성분 공침물을 포함하는 슬러리인 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 복합 바이오물질이 다층 스캐폴드(multilayer scaffold)인 방법.
  23. 제 2항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 구성성분의 조성이 제 2 구성성분의 조성과 동일하지 않는 방법.
  24. 제 2항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 유동성 구성성분의 조성이 제 1 구성성분 또는 제 2 구성성분의 조성과 동일하지 않는 방법.
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