이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 골 지지체 제조방법에 있어서, 단계 1은 고상의 생체고분자를 클로로포름에 용해시켜 생체고분자 용액을 얻는 단계이다.
상기 생체고분자는 생분해성 고분자 또는 인산칼슘계 생체세라믹을 사용할 수 있다. 상기 생분해성 고분자로는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리카프롤락톤(polycaprolactones), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(poly-orthocarbonates), 옥살산염 폴리알킬렌(polyalkylene oxalates), 숙신산염 폴리알킬렌(polyalkylene succinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성 단백질(modified proteins), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체(terpolymers), 이들의 조합물(combinations) 또는 혼합 물(mixtures), 이들의 중합체 혼합물(polymer blends) 등을 사용하는 것이 바람직하고, 이 중에서도 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(poly(L-lactide-co-glycolide)), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드)(poly(L-lactide)), 폴리(D,L-락티드)(poly(D,L-lactide)), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide)), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리(L-락티드-코-카프롤락톤(poly(L-lactide-co-caprolactone)), 폴리(D,L-락티드-코-카프롤락톤(poly(D,L-lactide-co-caprolactone)), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonate), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(L-lactide-co-trimethylenecarbonate)), 폴리(D,L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(D,L-lactide-co-trimethylene-carbonate)), 폴리디옥사논(polydioxanone), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체, 이들의 중합체 혼합물(polymer blends) 등을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 인산칼슘계 생체세라믹으로는 2 상의 칼슘포스페이트(biphasic calcium phosphate; BCP), 히드록시아파타이트(HAp), 트리칼슘포스페이트(TCP), α-트리칼슘포스페이트(α-TCP). β-트리칼슘포스페이트(β-TCP), 비정질 칼슘포스페이트(ACP), 옥타칼슘포스페이트(OCP), 무수 디칼슘포스페이트(DCPA), 디칼슘포스페이트 2수화물(DCPD), 무수 모노칼슘포스페이트(MCPA), 모노칼슘포스페이트 모노수화물(MCPM), 칼슘설페이트 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 단계 1에 따른 생체고분자 용액 중 고분자 함량은 10~50 중량%인 것이 바람직하고, 10~30 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 이는 템플레이트로 이용되는 PCL의 함량이 증가할수록 템플레이트의 페이스트상이 증가된다. 곧 제 2의 템플레이트인 인산칼슘계 생체세라믹과의 혼합비에도 영향을 주어, 재료적·기계적 특성을 현저히 변화시킬 수 있다. 상기 PCL을 클로로포름에 10~50 중량%를 사용하는데, 이는 염류용탈작용 공정 후에 생체고분자만을 템플레이트로 사용 시 재료적·기계적 특성을 현저히 저하시키는 반면, 인체의 뼈 구조물과 유사한 재료적·기계적 특성 및 우수한 골 유착능을 위하여 인산칼슘계 생체세라믹을 제 2 템플레이트로 사용하기 위하여 PCL을 클로로포름에 10~50 중량%로 사용하는 것이 양론비적 이론비가 알맞기 때문이다. 또한, 고상의 PCL과 액상의 클로로포름을 10~50 중량%비에 용해하여, 용매에 대한 오염도를 줄이고 제 2 템플레이트인 인산칼슘계 생체세라믹과의 혼합이 PCL의 유동성과 혼합물의 회전을 부여하여 전체적이 혼합이 가능하다.
본 발명의 골 지지체 제조방법에 있어서, 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 생체고분자 용액에 인산칼슘계 생체세라믹을 혼합시켜 생체고분자/인산칼슘 혼합물을 얻는 단계로, 상기 단계 1의 생체고분자 용액을 분산시킨 후, 여기에 분말형태인 인산칼슘계 생체세라믹을 첨가하고 균일하게 혼합하는 단계이다.
상기 생체고분자/인산칼슘 혼합물의 혼합비는 1:1 내지 1:5의 중량비인 것이 바람직하고, 1:1 내지 1:3의 중량비인 것이 더욱 바람직하다. 이때, 상기 혼합비 를 1:1 미만이 되도록 혼합하는 경우, 생체복합체 제조에 있어서 기계적 특성과 생분해성의 저하에 영향을 미치는 문제가 있고, 1:5를 초과하여 혼합하는 경우, 상대적으로 적은 생체 고분자의 양으로 인하여 인산칼슘과의 성형체를 성형함에 있어서 결합력이 저하되는 문제가 있다. 상기 범위 내에서, 제 2 템플레이트인 인산칼슘계 생체세라믹의 첨가량이 증가함에 따라 최종화합물의 재료적·물리적 특성치가 인체의 뼈 구조물과 유사한 것으로 확인되며, 생체고분자가 제 1 템플레이트에서 바인더의 역할로 바뀌는 생분해성 생체고분자/인산칼슘 하이브리드 복합체가 제조된다.
본 발명의 골 지지체 제조방법에 있어서, 단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 생체고분자/인산칼슘 혼합물을 분산시킨 후, 염류용탈공정을 수행하여 기공형성제를 균일하게 혼합시키는 단계이다.
염류용탈작용은 염류(salt)가 용매에 의해 운반되는 과정으로, 본 발명에서는 기공형성제로 이용되는 염류를 용매상에 균일하게 용해시켜 생체고분자/인산칼슘 혼합물에 공급함으로써 인체의 골 구조물과 유사한 기공률을 갖는 골 지지체를 얻기 위하여 이 방법을 이용한다. 상기 기공형성제로는 염류계 염화나트륨 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 사용할 수 있다.
상기 기공형성제는 생체고분자에 대하여 1~3 배 중량비로 첨가되는 것이 바람직하다. 이때, 염류용탈작용 공정을 통하여 기공형성제 역할을 하는 염화나트륨의 비를 증가시킴에 따라 기공률이 증가하는데, 인체의 뼈 구조물의 경우 70~80%의 기공률을 보이기에, 염화나트륨을 생체고분자에 대하여 1~3 배 중량비로 사용하여 최종 성형체의 기공률을 70~80%로 조절할 수 있다.
또한, 입자크기가 200~300 μm인 구형의 염화나트륨을 사용하여, 인체의 뼈 구조물이 가지는 기공 크기 및 골 유착능에 적합한 형상을 띄고 오염물질이 없는 최종 성형체를 얻을 수 있다.
본 발명의 골 지지체 제조방법에 있어서, 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 생체고분자/인산칼슘 페이스트 혼합물을 성형하여 성형체를 얻는 단계로, 상기 단계 3의 페이스트 혼합물을 지름 15 mm, 높이 5 mm인 테프론 몰드를 이용하여 성형한 후 건조하여 성형체를 얻는 단계이다.
상기 단계 3에 따라 제조된 생분해성 고분자와 생체 세라믹의 페이스트상 혼합물을 성형틀에 사출시킨 후, 잔존하는 수분을 제거하여 수분함량이 0.1~1 중량 %인 고상 형태를 얻을 수 있다. 이는 하기 단계 5에서 수세와 동결건조시 불순물의 제거가 용이하며, 또한, 성형틀(몰드)의 크기 및 모양에 따라 골 이식재, 뼈 플레이트(bone plate) 및 각종 임플란트에 대한 구조적용이 용이하다.
본 발명의 골 지지체 제조방법에 있어서, 단계 5는 상기 단계 4에서 얻은 성형체를 수세 및 동결건조시켜 다공성 생체 재료를 얻는 단계이다.
상기 수세 및 동결건조 단계를 통하여 생분해성 생체고분자/인산칼슘계 성형체에 기공형성제로 첨가한 염류를 제거하여 기공을 형성하고 불순물을 제거할 수 있다. 이때, 수세를 위한 용매로는 3차 증류수가 바람직하게 사용될 수 있다. 또한 염류용탈작용 공정으로 인한 템플레이트 안의 기공형성제 대신 수분으로 교체되어 있는 상태를 동결건조로 건조함으로써 생체고분자/생체세라믹 하이브리드 골 지지체의 재료적·구조적 특징을 유지할 수 있으며, 상호연결된 기공(interconnected pore)을 갖는 생분해성 생체고분자/인산칼슘계 하이브리드 골 지지체를 얻을 수 있다. 상기 동결건조는 -80~-50 ℃의 온도에서 10 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 생체고분자 PCL과 생체세라믹 BCP의 중량비를 조절하여 혼합하고 염류용탈작용 공정 및 동결건조를 사용하는 것으로, 생체고분자와 생체세라믹의 함량을 조절함에 따라 생분해성 하이브리드 골 지지체를 제조할 수 있으며, 재료적·기계적 및 생분해성도 제어된 고기능 생분해성 생체고분자/인산칼슘 하이브리드 골 지지체를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예의 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> PCL/BCP 하이브리드 골 지지체 1의 제조
제 1 템플레이트로 사용할 폴리카프롤락톤(PCL, 2.2 g, 고상)을 클로로포름(20 ml)에 균일하게 용해시시키고 분산시킨 후, 제 2 템플레이트로 사용할 인산 칼슘계 생체세라믹인 바이페이직 칼슘포스페이트(BCP, 2.2 g, 분말상)을 첨가하고 혼합하였다. 이 혼합물에 기공형성제인 염류계 NaCl(22 g, 분말상)을 첨가하여 균일하게 분산시켰다. 페이스트상태의 혼합물을 테프론 성형틀에 사출하여 장입시킨 후, 건조단계를 거쳐 3 차 증류수에 수세하고 -53 ℃의 동결건조기(freeze drying)에서 진공상태로 24 시간 동안 동결건조 처리 수행하여 PCL/BCP 하이브리드 골 지지체 1을 얻었다.
<실시예 2> PCL/BCP 하이브리드 골 지지체 2의 제조
제 2 템플레이트인 바이페이직 칼슘포스페이트를 4.4 g 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 합성을 수행하여 PCL/BCP 하이브리드 골 지지체 2를 얻었다.
<실시예 3> PCL/BCP 하이브리드 골 지지체 3의 제조
제 2 템플레이트인 바이페이직 칼슘포스페이트를 6.6 g 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 합성을 수행하여 PCL/BCP 하이브리드 골 지지체 3을 얻었다.
<비교예 1> PCL 하이브리드 골 지지체의 제조
템플레이트로 사용할 폴리카프롤락톤(PCL, 2.2 g, 고상)을 클로로포름(20 ml)에 균일하게 용해시키고 분산시킨 후, 기공형성제인 염류계 NaCl(22 g, 분말상)을 첨가하여 균일하게 분산시켰다. 페이스트상태의 혼합물을 테프론 성형틀에 사출하여 장입시킨 후, 건조단계를 거쳐 3 차 증류수에 수세하고 -53 ℃의 동결건조 기(freeze drying)에서 진공상태로 24 시간 동안 동결건조 처리 수행하여 PCL 하이브리드 골 지지체를 얻었다.
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1의 제조공정도 및 각각의 얻은 골 지지체의 주사전자현미경 사진을 도 1 내지 도 3에 나타내었고, 실시예 및 비교예에 사용한 초기물질의 성상 및 정량비는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
|
용도 |
구성 |
형상 |
입도크기 |
PCL |
탬플레이트 |
C6H10O2 |
고상 |
- |
BCP |
탬플레이트 |
칼륨포스페이트 |
분말상 |
80~100 nm |
클로로포름 |
용매 |
CHCl3 |
액상 |
- |
NaCl |
기공형성제 |
NaCl |
고상 |
200~300 μm |
|
PCL:BCP:NaCl |
PCL의 첨가량(10%, g) |
BCP의 첨가량(g) |
NACl의 첨가량(g) |
비교예 1 |
1:0:10 |
2.2 |
0 |
22 |
실시예 1 |
1:1:10 |
2.2 |
2.2 |
22 |
실시예 2 |
1:2:10 |
2.2 |
4.4 |
22 |
실시예 3 |
1:3:10 |
2.2 |
6.6 |
22 |
<분석>
본 발명의 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1의 골 지지체의 시료표면 정보를 얻기 위하여 주사전자현미경(FE - SEM , JMS -6335F, JEOL , Japan)을 이용하여 분석을 실시하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 제조된 생분해성 PCL/BCP 하이브리드 골 지지체의 횡단면을 분석한 결과로서 비교예1 (a), 실시예1 (b) ~ 실시예3 (c)의 이미지와 같이 뼈형성 세포들에게 적합한 200-300 ㎛의 기공이 관측되었다. 또한 기공을 형성하기위하여 세수과정을 통한 염류용탈작용이 완벽하게 된 것을 확인할 수 있다. 특히, 비교예1 (a)와 실시예1 (b)에서는 닫힌 기공 (closed pore)가 아닌 열린 기공 (open pore, interconnected pore)가 형성이 관찰되었으며 이는 뼈 형성세포들의 행동거동 및 친수성과 관련하여 골 지지체 안에서 활발한 증착 및 부착능에 효과적이다. 반면 실시예3 (d)의 경우에는 생체세라믹의 함량이 능가되어 기공을 형성하는 기공표면이 증가됨을 확인할 수 있으며, 닫힌 기공 (closed pore)이 되어가는 것을 관찰하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 제조된 생분해성 PCL/BCP 하이브리드 골 지지체의 종단면을 분석한 결과로서 비교예1 (a), 실시예1 (b) ~ 실시예3 (d)의 이미지와 같이 횡단면뿐만 아니라 종단면에서도 뼈형성 세포들에게 적합한 200-300 ㎛의 기공이 관측되었다. 또한 골 지지체 내부에도 염류용탈작용이 완벽하게 된 것을 확인하였다. 비교예1 (a)를 통하여 기공이 서로 연결되어 있으며 잘 분포되어 있는 것이 관찰되었다. 특히, 고배율의 실시예1 (b) ~ 실시예3 (d)에 나타난 바와 같이, 고분자의 표면에 인산칼슘계 세라믹이 분산되어 있는 것을 확연히 관찰할 수 있었다. 점차 인산칼슘계 세라믹의 함량이 증가함에 따라 점차 인산칼슘 분말을 생체고분자가 거미줄처럼 감싸고 있는 것을 확인하였다. 이는 생체고분자/인산칼슘 하이브리드 골 지지체의 기계적/물리적 특성을 향상시키며, 많은 미세 기공과 뼈형성세포들의 성장거동에 적합한 골 지지체 형상을 제공한다.
본 발명의 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1의 골 지지체의 시료입자의 정보를 얻기 위하여 X선 회절 분석기(XRD, D/MAX-250, Rigaku, Japan)를 이용하여 분석을 실시하였다(스캔 속도: 2, 스캔 범위: 10 ~ 60 ℃. 전력: 150 kW)
도 4에 나타난 바와 같이, 결정학적인 분석방법으로 XRD를 이용한 인산칼슘계 세라믹 BCP (a)는 수산화아파타이트 (hydroxyapatite, HAp) 와 베타-트리칼슘포스페이트 (β-tricalcium phosphate, β-TCP) 의 피크를 나타내는 것을 확인하였으며, 비교예1 (b)의 분석결과 순수한 PCL의 피크를 나타내었다. 특히, 실시예1 (c)의 피크에는 PCL/BCP 하이브리드 골 지지체의 PCL, 수산화아파타이트 그리고 베타-트리칼슘포스페이트 피크가 관찰되었다.
본 발명의 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1의 골 지지체의 시료성분 정보를 얻기 위하여 퓨리에 변환 적외선 분광기(FT-IR,TENSOR-37, BRUSKER, USA)를 이용하여 분석을 실시하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 분광분석방법으로 FT-IR를 이용한 비교예1 (a)과 실시예1 (b)을 분석하였다. 비교예1 (a)의 경우에는 순수한 PCL의 투과도 (C-H, C=O, C-O) 를 보였으며 실시예1 (b)에서는 PCL/BCP 하이브리드 복합체로써 PCL의 투과도 뿐만 아니라 전형적인 인산칼슘계 세라믹 BCP의 투과도 (PO4 3-)가 관찰되었다.
본 발명의 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1의 골 지지체의 밀도 및 기공률 정보를 얻기 위하여 수은밀도기공측정기(Mercury Porosimeter, AccuPyc-1330,USA)를 이용하여 분석을 실시하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 비교예 1 및 실시예 1 내지 3의 골 지지체의 밀도 및 기공률을 분석해본 결과, 실시예 1 내지 3의 골 지지체는 BCP가 첨가되지 않은 비교예 1의 골 지지체(밀도= 1.6 g/cm3)와 비교하여 밀도가 상당히 높게 나타남을 알 수 있었다. 이와는 반대로 기공률의 경우 실시예 1 내지 3의 골 지지체는 BCP가 첨가되지 않은 비교예 1의 골 지지체(기공률= 2.2%)와 비교하여 기공률이 낮게 나타났다. 또한, 실시예 1 내지 3의 경우 BCP의 첨가량이 증가할수록 밀도는 증가하고 기공률은 감소하는 경향을 보이는데, 이는 인체의 골 구조체와 유사한 재료적·물리적 특성치를 나타내는 것이다.
<실험예 1> 제조한 골 지지체의 압축강도 및 탄성계수 분석 실험
도 7에 나타난 바와 같이, 비교예 1 및 실시예 1 내지 3의 골 지지체의 압축강도(Instron Mechanical Tester, 4443D2074, USA) 및 탄성계수(Ultrasonic Flaw Detector, UFD-5800, USA)를 분석해본 결과, 실시예 1 내지 3의 골 지지체는 BCP가 첨가되지 않은 비교예 1의 골 지지체(밀도:1.6 g/cm3)와 비교하여 압축강도 및 탄성계수 모두 높게 나타남을 알 수 있었다. 또한, 실시예 1 내지 3의 경우 BCP의 첨가량이 증가할수록 압축강도 및 탄성계수는 증가하는 경향을 보인다.