KR101425036B1 - 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법이 개시되어 있다. 본 발명은, 폴리카프로락톤(PCL)을 2,2,2-트리플루오에탄올에 용해시킨 후 교반시켜 슬러리화하는 단계; 상기 제조된 슬러리에 비페이직 칼슘 포스페이트(BCP)를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하는 단계; 다공성 구조를 형성하기 위하여 혼합된 PCL/BCP 슬러리에 염화나트륨을 첨가하는 단계; 상기 다공성 PCL/BCP 슬러리를 진공오븐에 넣어 건조시켜 PCL/BCP 지지체를 형성하는 단계; 상기 건조된 지지체 내에 잔류하는 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수로 세척하는 단계; 상기 지지체의 표면을 화학적으로 변형시키기 위하여, 상기 PCL/BCP 지지체를 1.6-헥사메틸렌디아민 용액에 넣어 반응시키는 단계; 1.6-헥사메틸렌디아민 용액을 제거하기 위하여 증류수로 세척하는 단계; 가교제인 EDC/NHS(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide hydrochloride/Hydroxy-2,5-dioxopyrolidine-3-sulfonic acid sodium)로 지지체를 가교시키는 단계; 상기 가교된 PCL/BCP 지지체에 콜라겐 용액을 코팅하는 단계; 및 콜라겐이 코팅된 PCL/BCP-Col 지지체에 잔류하는 콜라겐을 증류수로 세척하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리카프로락톤(Polycaprolactone)과 비페이직 칼슘 포스페이트 (biphasic calcium phosphate)를 혼합한 뒤 염 침출법을 실시하여, 골모세포의 증식을 향상시킬 수 있는 뼈 조직공학에 적용할 수 있도록 한 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법에 관한 것이다.
뼈에 결손부가 발생했을 시, 이를 대체하기 위한 방법으로 자가골이나 동종골을 이식하는 방법이 이용된다. 그러나 자가골은 얻을 수 있는 양이 제한되어 있다는 단점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 생체재료가 개발되어 사용되고 있다.
뼈 조직 공학에 사용되는 생체재료는 본래 구조를 유지하면서 세포가 지지체에 부착되어 증식할 수 있어야 하며 일정 기간 후 분해되는 생체적합성을 지녀야 한다. 생체재료 지지체로 쓰이는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락타이드(PLA), 포리글리콜라이드(PGA), 락-글리콜리드(PLGA)는 합성고분자로 뼈 조직 공학 재생에 쓰인다. 상기 합성 고분자들은 생체적합성이 우수하지 않고 소수성 특징을 갖고 있어 세포를 사용하는 연구에서 효율적이지 않다.
따라서, 물질 표면에 친수성 특성을 갖는 유사한 물질에 대한 연구가 이루어지고 있다.
본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 고분자-세라믹 지지체의 표면을 변형시켜 콜라겐을 코팅함으로써 전조골 세포의 부착 및 증식을 향상시킬 수 있도록 하는 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법은,
폴리카프로락톤(PCL)을 2,2,2-트리플루오에탄올에 용해시킨 후 교반시켜 슬러리화하는 단계; 상기 제조된 슬러리에 비페이직 칼슘 포스페이트(BCP)를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하는 단계; 다공성 구조를 형성하기 위하여 혼합된 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 혼합슬러리에 염화나트륨을 첨가하는 단계; 상기 다공성 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 혼합슬러리를 진공오븐에 넣어 건조시켜 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 지지체를 형성하는 단계; 상기 건조된 지지체 내에 잔류하는 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수로 세척하는 단계; 상기 지지체의 표면을 화학적으로 변형시키기 위하여, 상기 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 지지체를 1.6-헥사메틸렌디아민 용액에 넣어 반응시키는 단계; 1.6-헥사메틸렌디아민 용액을 제거하기 위하여 증류수로 세척하는 단계; 가교제로 지지체를 가교시키는 단계; 상기 가교된 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 지지체에 콜라겐 용액을 코팅하는 단계; 및 콜라겐이 코팅된 PCL/BCP-Col(PCL, BCP 및 콜라겐) 지지체에 잔류하는 콜라겐을 증류수로 세척하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 가교단계에서 상기 지지체를 가교제로 4℃에서 6시간 동안 가교하며, 상기 코팅단계에서 상기 가교된 지지체에 콜라겐 용액을 4℃에서 18시간 동안 코팅하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 화학적 성질이 향상된 많은 기공을 갖는 생분해성 지지체를 제조하여 뼈 조직의 재생을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 고분자-세라믹 지지체의 표면을 변형시켜 콜라겐을 코팅함으로써 전조골 세포의 부착 및 증식을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP지지체와 PCL지지체를 주사전자현미경, 수은 기공도 측정기, EDS 및 X선 회절로 분석한 사진이다.
도 3은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP 지지체와 PCL 지지체를 표면 변형하여 푸리에변환적외분광법 그리고 닌히드린 염색으로 지지체의 화학적 특성 변화를 분석한 사진이다.
도 4는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP 지지체와 PCL 지지체를 표면변형한 뒤 콜라겐을 코팅하여 고해상도의 주사전자현미경과, 수은 기공도 측정기로 분석한 사진이다.
도 5는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체와 비교예인 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 구성하는 원소를 X-선 광전자 분광법으로 분석한 것이다.
도 6은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체 표면과 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조 골세포를 심어 1, 12, 24,시간 동안 배양한 뒤 공초점 현미경으로 세포 부착도 및 형태를 관찰한 것이다.
도 7은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체 표면과 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조 골세포를 심어 1일 3일 7일 동안 배양한 뒤 공초점 현미경과 MTT 분석으로 세포 생존력을 관찰한 것이다.
도 8은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체와 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 쥐(rat) 두개골에 결손을 만들어 4, 6주 간 이식하여 뼈 형성을 도식으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col지지체와 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색을 하여 지지체 내에 형성된 뼈를 저해상도로 비교한 사진이다.
도 10은 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)과 매손-트리크롬으로 염색하여 PCL, PCL/BCP, PCL-Col, PCL/BCP-Col 지지체의 뼈형성과 단백질 형성도를 고해상도로 비교한 사진이다.
도 2는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP지지체와 PCL지지체를 주사전자현미경, 수은 기공도 측정기, EDS 및 X선 회절로 분석한 사진이다.
도 3은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP 지지체와 PCL 지지체를 표면 변형하여 푸리에변환적외분광법 그리고 닌히드린 염색으로 지지체의 화학적 특성 변화를 분석한 사진이다.
도 4는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP 지지체와 PCL 지지체를 표면변형한 뒤 콜라겐을 코팅하여 고해상도의 주사전자현미경과, 수은 기공도 측정기로 분석한 사진이다.
도 5는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체와 비교예인 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 구성하는 원소를 X-선 광전자 분광법으로 분석한 것이다.
도 6은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체 표면과 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조 골세포를 심어 1, 12, 24,시간 동안 배양한 뒤 공초점 현미경으로 세포 부착도 및 형태를 관찰한 것이다.
도 7은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체 표면과 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조 골세포를 심어 1일 3일 7일 동안 배양한 뒤 공초점 현미경과 MTT 분석으로 세포 생존력을 관찰한 것이다.
도 8은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체와 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 쥐(rat) 두개골에 결손을 만들어 4, 6주 간 이식하여 뼈 형성을 도식으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col지지체와 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색을 하여 지지체 내에 형성된 뼈를 저해상도로 비교한 사진이다.
도 10은 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)과 매손-트리크롬으로 염색하여 PCL, PCL/BCP, PCL-Col, PCL/BCP-Col 지지체의 뼈형성과 단백질 형성도를 고해상도로 비교한 사진이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 설명에 있어서, PCL/BCP는 폴리카프로락톤에 비페이직 칼슘 포스페이트를 혼합하여 슬러리화 한 것을 의미하고, PCL/BCP-Col은 폴리카프로락톤에 비페이직 칼슘 포스페이트를 혼합하여 슬러리화 한 지지체에 콜라겐을 코팅한 것을 의미하며, EDC/NHS(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide hydrochloride/Hydroxy-2,5-dioxopyrolidine-3-sulfonic acid sodium)는 EDC와 NHS 용액을 혼합한 것을 의미한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법은 다음과 같은 공정을 통해 이루어진다.
1. 10w/v%의 폴리카프로락톤(PCL)을 2,2,2-트리플루오에탄올에 용해시킨 후 12시간 동안 교반시켜 슬러리화한다.
2. 상기 제조된 슬러리에 10w/v%의 비페이직 칼슘 포스페이트(BCP)를 첨가하여 교반시켜 슬러리화한다.
3. 혼합된 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 혼합슬러리에 염화나트륨을 첨가하여 다공성 구조를 형성한다.
4. 상기 다공성 PCL/BCP 혼합슬러리를 진공오븐에 넣어 건조시켜 PCL/BCP 지지체를 형성한다.
이때, 건조시간은 약 3∼4일 정도가 바람직하다.
5. 상기 건조된 지지체 내에 잔류하는 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수로 24시간 세척한다.
6. 상기 지지체의 표면을 화학적으로 변형시키기 위하여, 상기 PCL/BCP 지지체를 1.6-헥사메틸렌디아민 용액에 넣어 37℃에서 8시간 동안 반응시킨다.
이와 같은 표면 변형을 위한 반응은 PCL/BCP 지지체 표면을 친수성화 하여 콜라겐과 같은 천연폴리머와 결합을 쉽게 하며 이를 "아미노라이시스(Aminolysis)" 라 표현한다.
7. 1.6-헥사메틸렌디아민 용액을 제거하기 위하여 증류수로 세척한다.
8. 가교제인 EDC/NHS(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide hydrochloride/Hydroxy-2,5-dioxopyrolidine-3-sulfonic acid sodium)로 지지체를 가교시킨다.
상기 지지체를 가교제로 4℃에서 6시간 동안 가교하며, 이러한 가교반응을 통해 이후의 공정인 콜라겐의 표면 코팅이 잘 되도록 한다.
9. 상기 가교된 PCL/BCP 지지체에 콜라겐 용액을 코팅한다.
상기 지지체에 콜라겐 용액을 4℃에서 18시간 동안 코팅한다.
10. 콜라겐이 코팅된 PCL/BCP-Col 지지체에 잔류하는 콜라겐을 증류수로 세척한다.
상기와 같은 공정을 통해 본 발명에 따른 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체를 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 PCL/BCP-Col 지지체는 전조골 세포의 부착 및 증식을 향상시킬 수 있는 것이다.
이와 같이, 지지체에 콜라겐을 코팅함으로써 세포의 부착 및 증식능력이 향상되는데, 콜라겐을 지지체에 용이하게 코팅할 수 있는 방법을 본 발명에서 개시한 것이다.
이하에서는 본 발명에 따른 일 실시예와 비교예를 설명하도록 한다.
<실시예>
90㎖의 2.2.2-트리플루오에탄올에 10g의 폴리카프로락톤을 넣어 교반시키고, 제조된 슬러리에 10g 비페이직 칼슘 포스페이트(BCP)를 넣고 완전히 슬러리화 한다. 제조된 슬러리에 염화나트륨을 첨가하여 기공을 형성하고, 슬러리를 진공오븐에 3~4일간 건조시켜 PCL/BCP 지지체를 형성하며, PCL/BCP 지지체에 잔류된 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 24시간 동안 증류수로 세척한다. 지지체의 표면 변형을 위해 1.6-헥사메틸렌디아민 용액에 넣어 37℃에 8시간 동안 반응시키고, 1.6-헥사메틸렌디아민 용액을 제거하기 위해 증류수로 세척한다. EDC/NHS 용액으로 지지체를 가교시키고, 가교된 PCL/BCP 지지체에 콜라겐 타입 I 용액으로 코팅하며, 상기 PCL/BCP-Col 지지체에 잔류하는 콜라겐을 증류수로 세척하여, 최종적으로 PCL/BCP-Col 지지체를 제조한다.
<비교예 1>
90㎖의 2.2.2-트리플루오에탄올에 10g의 폴리카프로락톤을 넣어 교반시켜서 슬러리화 한다. 제조된 슬러리에 염화나트륨을 첨가하여 기공을 형성하고, 슬러리를 진공오븐에 3~4일간 건조시켜 PCL 지지체를 형성하며, PCL 지지체에 잔류된 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 24시간 동안 증류수로 세척한다. 이렇게 하여 최종적으로 PCL 지지체를 제조한다.
<비교예 2>
90㎖의 2.2.2-트리플루오에탄올에 10g의 폴리카프로락톤을 넣어 교반시키고, 제조된 슬러리에 10g 비페이직 칼슘 포스페이트(BCP)를 넣고 완전히 슬러리화 한다. 제조된 슬러리에 염화나트륨을 첨가하여 기공을 형성하고, 슬러리를 진공오븐에 3~4일간 건조시켜 PCL/BCP 지지체를 형성하며, PCL/BCP 지지체에 잔류된 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 24시간 동안 증류수로 세척한다. 이렇게 하여 PCL/BCP 지지체를 제조한다.
<비교예 3>
90㎖의 2.2.2-트리플루오에탄올에 10g의 폴리카프로락톤을 넣어 교반시켜서 슬러리화 한다. 제조된 슬러리에 염화나트륨을 첨가하여 기공을 형성하고, 슬러리를 진공오븐에 3~4일간 건조시켜 PCL 지지체를 형성하며, PCL 지지체에 잔류된 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 24시간 동안 증류수로 세척한다. 지지체의 표면 변형을 위해 1.6-헥사메틸렌디아민 용액에 넣어 37℃에 8시간 동안 반응시키고, 1.6-헥사메틸렌디아민 용액을 제거하기 위해 증류수로 세척한다. EDC/NHS 용액으로 지지체를 가교시키고, 가교된 PCL 지지체에 콜라겐 타입 I 용액으로 코팅하며, 상기 PCL-Col 지지체에 잔류하는 콜라겐을 증류수로 세척하여, 최종적으로 PCL-Col 지지체를 제조한다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예와 비교예들 비교하도록 한다. 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 PCL/BCP-Col과 상기 비교예들에 의해 제조된 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체들을 주사전자현미경과 EDS, X선 회절분석, 수은 기공도 측정기, 푸리에변환적외분광법, X-선 광전자 분광법과 세포 실험을 실시하였고 그에 대한 결과는 도 2에서 도 10까지 나타내었다.
도 2는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP지지체와 PCL지지체를 주사전자현미경, 수은 기공도 측정기, EDS 및 X선 회절로 분석한 사진이다.
도 2의 (a1, a2)로 나타낸 도식과 같이, PCL 지지체와 PCL/BCP 지지체는 각각 기공이 상호 연결된 구조를 보이고 있다.
도 2의(b1, b2)로 나타낸 도식은 PCL, PCL/BCP 지지체의 기공의 지름이 각각 100∼500㎛와 100∼250㎛로 BCP가 첨가된 PCL/BCP의 기공율이 감소함을 확인할 수 있었다. 기공율이 감소한다는 것은 지지체에서 기공의 연결구조가 좀 더 조밀하다는 의미이고, 세포의 부착 및 증식 능력이 좋다는 것을 나타낸다.
도 2의(c, d)로 나타낸 도식과 같이,(c)는 지지체를 구성하는 원소가 측정됨에 따라 PCL과 BCP 조성이 잘 배합되었음을 알 수 있었고, (d)에 표시된 지점들은 PCL, BCP, PCL/BCP는 보편적인 PCL, BCP 피크를 갖는 결과를 토대로 PCL/BCP 지지체는 PCL 과 BCP 조성이 잘 이루어져 있음을 확인할 수 있었다.
도 3은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP 지지체와 PCL 지지체를 표면 변형하여 푸리에변환적외분광법 그리고 닌히드린 염색으로 지지체의 화학적 특성 변화를 분석한 사진이다.
도 3의(a)로 나타낸 도식과 같이, PCL-aminolysis 된 지지체의 아미드 Ⅲ 지역에 NH기 즉, 아미노 그룹의 피크점이 관찰됨을 확인하였다.
도 3의 (b, c, d, f)로 나타낸 도식은, 닌히드린 염색 전과 후를 비교한 것으로 보라색을 띄는 색깔변화를 통해 PCL, PCL/BCP 지지체 표면에 아미노 그룹의 도입을 확인하였다.
위와 같은 과정을 통해 에스터기를 갖는 PCL에 아미노 그룹이 결합되어 표면 변형 된 지지체를 얻게 된다.
도 4는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP 지지체와 PCL 지지체를 표면변형한 뒤 콜라겐을 코팅하여 고해상도의 주사전자현미경과, 수은 기공도 측정기로 분석한 사진이다.
도 4의 (a,b)로 나타낸 도식과 같이, 콜라겐 섬유 형태는 사각형으로 표시된 부분에서 볼 수 있었고 지지체 표면에 잘 부착되었음을 확인할 수 있었다. 도 4의(c, d)로 나타낸 도식과 같이, 콜라겐 코팅 전 샘플 보다 그래프가 왼편으로 옮겨져 기공크기가 감소했음을 확인하였다.
도 5는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체와 비교예인 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 구성하는 원소를 X-선 광전자 분광법으로 분석한 것이다.
도 5로 나타낸 도식과 같이, PCL, PCL/BCP의 각 원소들은 C, O 그리고 C, O, Ca, P로 측정되었고 콜라겐이 코팅된 지지체인 PCL-Col, PCL/BCP-Col은 각 지지체들의 원소 존재 하에 N 피크가 새롭게 나타났다. 도 5의 도표는 각 원소의 결합에너지 값을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체 표면과 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조 골세포를 심어 1, 12, 24,시간 동안 배양한 뒤 공초점 현미경으로 세포 부착도 및 형태를 관찰한 것이다.
도 6에 나타낸 도식과 같이, 배양 1시간 후에는 지지체에 안착된 세포의 수는 적게 관찰되었다. 그러나 배양 시간을 늘릴수록 PCL-Col과 PCL/BCP-Col 지지체 내의 세포가 PCL, PCL/BCP 보다 증가되어 관찰되었고 세포체가 형성되었다. 특히 24시간 뒤에는 PCL-Col지지체 보다도 PCL/BCP-Col 지지체에 상당한 양의 세포가 부착되어 증식까지 되었음을 관찰하였다.
도 7은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체 표면과 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체 표면에 MC3T3-E1 전조 골세포를 심어 1일 3일 7일 동안 배양한 뒤 공초점 현미경과 MTT 분석으로 세포 생존력을 관찰한 것이다.
도 7의 (A)에 나타낸 도식과 같이, 초록색과 붉은색으로 염색된 세포는 각각 살아있는 세포와 죽은 세포를 나타낸다. 배양 1일 후 죽은 세포가 관찰되나 살아있는 세포가 더 많이 관찰되었고, 3일에서는 PCL-Col에서 살아있는 세포와 액틴섬유 같은 것이 관찰되었다. 배양 7일 후 살아있는 세포의 증식이 높아졌으며 PCL/BCP-Col 지지체는 표면을 덮었다.
도 7의 (B)에 나타낸 도식과 같이, 배양 1일 뒤에는 모든 지지체와 컨트롤과의 값이 비슷하게 측정되었으나 3일 과 7일 뒤에는 콜라겐이 코팅된 PCL-Col, PCL/BCP-Col 지지체의 값이 PCL, PCL/BCP 지지체보다 세포 성장률이 우수하게 관찰된 것을 통해, 기존 지지체보다 증식에 영향력 있는 것으로 평가된다.
도 8은 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col 지지체와 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 쥐(rat) 두개골에 결손을 만들어 4, 6주 간 이식하여 뼈 형성을 도식으로 나타낸 것이다.
도 8에 나타낸 도식과 같이, PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체는 결손부 가장자리에서부터 뼈가 형성되었으나 PCL/BCP-Col 지지체는 4주 때 결손 중앙부에서 뼈가 형성되었고 6주 후 적출된 샘플은 결손부와 거의 흡사할 정도의 뼈가 형성되었다.
도 9는 본 발명으로 제조된 PCL/BCP-Col지지체와 PCL, PCL/BCP, PCL-Col 지지체를 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색을 하여 지지체 내에 형성된 뼈를 저해상도로 비교한 사진이다.
도 9에 나타낸 도식과 같이, 4, 6주간 실시한 이식 후 적출된 모든 샘플에서 지지체와 천연골 사이에 조직이 나타났고, 치밀 조직이 지지체와 천연골을 같이 감싸는 형태로 관찰되었다.
도 10은 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin)과 매손-트리크롬으로 염색하여 PCL, PCL/BCP, PCL-Col, PCL/BCP-Col 지지체의 뼈형성과 단백질 형성도를 고해상도로 비교한 사진이다.
도 10의 (A)로 나타낸 도식과 같이, 비페이직 칼슘 포스페이트와 콜라겐의 영향으로 PCL/BCP, PCL/BCP-Col 지지체에서 뼈가 밀집되어 형성되었다.
도 10의 (B)로 나타낸 도식과 같이, 모든 지지체에서 파란색으로 염색된 단백질 섬유가 형성 되었으며, 6주간 이식된 PCL/BCP, PCL/BCP-Col 지지체에서 붉은색으로 염색된 뼈 형성 지역이 관찰되었다. 특히 6주간 이식된 PCL/BCP-Col은 지지체에서 부분적 뼈 형성이 다른 지지체에 비해 우수하게 나타났다.
본 발명의 권리범위는 위에서 설명된 실시 예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.
Claims (2)
- 폴리카프로락톤(PCL)을 2,2,2-트리플루오에탄올에 용해시킨 후 교반시켜 슬러리화하는 단계;
상기 제조된 슬러리에 비페이직 칼슘 포스페이트(BCP)를 첨가하여 교반시켜 슬러리화하는 단계;
다공성 구조를 형성하기 위하여 혼합된 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 혼합슬러리에 염화나트륨을 첨가하는 단계;
상기 다공성 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 혼합슬러리를 진공오븐에 넣어 건조시켜 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 지지체를 형성하는 단계;
상기 건조된 지지체 내에 잔류하는 솔벤트와 염화나트륨을 제거하기 위해 증류수로 세척하는 단계;
상기 지지체의 표면을 화학적으로 변형시키기 위하여, 상기 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 지지체를 1.6-헥사메틸렌디아민 용액에 넣어 반응시키는 단계;
1.6-헥사메틸렌디아민 용액을 제거하기 위하여 증류수로 세척하는 단계;
가교제로 지지체를 가교시키는 단계;
상기 가교된 PCL/BCP(PCL 및 BCP) 지지체에 콜라겐 용액을 코팅하는 단계; 및
콜라겐이 코팅된 PCL/BCP-Col 지지체에 잔류하는 콜라겐을 증류수로 세척하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 가교단계에서 상기 지지체를 가교제로 4℃에서 6시간 동안 가교하며, 상기 코팅단계에서 상기 가교된 지지체에 콜라겐 용액을 4℃에서 18시간 동안 코팅하는 것을 특징으로 하는 표면 변형된 뼈 조직 재생용 지지체의 제조방법.
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